A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa bacteriana causada por Mycobacterium tuberculosis (Mtb), acomete seres humanos em todo mundo, e é considerada uma das principais causas de morbidade e mortalidade dentre as doenças infecciosas. Nesse cenário, a TB ainda é vista como um grande desafio para a ciência e para medicina. Com o estudo de novos alvos moleculares para terapia e diagnóstico, por exemplo, a sinalização Notch tem sido descrita como uma via importante para a manutenção da resposta imunológica durante a infecção por Mtb. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a participação da via Notch na modulação da resposta imune durante a infecção por Mtb em humanos. Neste trabalho foram incluidos 13 pacientes com tuberculose ativa e 13 indivíduos saudáveis. Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladas e avaliadas quanto à expressão de receptores Notch 1 - 2 em células T e ligantes Notch, DLL1 - 4 em subpopulações de monócitos por citometria de fluxo e expressão de genes relacionados à via Notch e resposta imune. Além disso, o plasma foi utilizado para avaliar níveis de citocinas, CD14s e CD163s. Ainda, avaliamos a função celular dependente da ativação da via Notch durante a infecção de células mononucleares de sangue periférico de indivíduos saudáveis com Mtb H37Rv in vitro. Observamos que pacientes com TB ativa apresentaram aumento na expressão de DLL4 em monócitos intermediários e não-clássicos e diminuição na expressão de Notch 2 em células T CD8+. In vitro, observamos nas culturas de PBMCs, aumento da expressão de DLL4 em monócitos intermediários e Notch 2 em células T CD4+. A expressão do ligante DLL4 em monócitos intermediários e a expressão do Notch 1 em células T CD4+ em pacientes com TB ativa se correlacionaram positivamente com o grau de lesão pulmonar. Além disso, pacientes com quadros de lesão pulmonar moderado e avançado têm maior expressão de Notch 1 em células T CD4+ quando comparados a pacientes com grau mínimo de lesão pulmonar. Pacientes com TB ativa apresentam aumento significativo nos níveis plasmáticos de IL-6, IP- 10, CD14s e CD163s e diminuição nos níveis de IFN-?, IL-17A, IL-4, IL-2, IL-1? e RANTES. Os níveis plasmáticos de IFN-?, TNF-?, IL-17A, IL-4, IL-2, IL-12, IL-1?, RANTES e IL-10 se correlacionaram positivamente com o maior grau de lesão pulmonar.Além disso, demonstramos que os níveis de IFN-?, IL-17A, IL-1?, IL-4 e IL-2 se relacionam com maior expressão do receptor Notch 1 em células T CD4+ , enquanto níveis plasmáticos de IP-10, CD163s e de procalcitonina se correlacionam com maior expressão de Notch 1 em células T CD8+. Evidenciamos maior tendência na expressão de HES1 em pacientes com TB ativa e células infectadas in vitro, indicando que a via Notch está sendo ativada durante a infecção por Mtb. De forma interessante, in vitro as culturas de PBMCs tratadas com inibidor farmacológico da via Notch (GSI), reduziram a produção de IL-17A, IL-2 e IL-10 e aumentaram IL-8, enquanto o tratamento com anti-hDLL4 promoveu o aumento significativo nos níveis de TNF-? e atividade fagocítica de monócitos. Em conclusão, a expressão de receptores e ligantes Notch é alterada durante a TB, em especial o ligante DLL4 em subpopulações de monócitos. Além disso, a via Notch parece ser importante na modulação de respostas pró e anti-inflamatórias. Nesse trabalho, sugerimos que a expressão de Notch 1 em células T e DLL4 em subpopulações de monócitos estão associados com a gravidade da TB. Assim, a detecção desses constituintes da via Notch em PBMCs de pacientes com TB ativa são potenciais biomarcadores para avaliar a progressão da doença. / Tuberculosis (TB) is a bacterial infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), affects humans worldwide, and is considered a major cause of morbidity and mortality among infectious diseases. In this scenario, TB is still seen as a major challenge for science and medicine. With the study of new molecular targets for therapy and diagnosis, for example, Notch signaling has been described as an important pathway for the maintenance of immune response during Mtb infection. Thus, the objective of this work was to evaluate the participation of the Notch pathway in the modulation of the immune response during Mtb infection in humans. In this study, 13 patients with active tuberculosis and 13 healthy individuals were included. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated and evaluated for Notch 1 - 2 receptor expression in T cells and Notch, DLL1 - 4 ligands in monocyte subpopulations by flow cytometry and expression of Notch - pathway related genes and immune response. In addition, plasma was used to assess levels of cytokines, CD14s and CD163s. Furthermore, we evaluated the cellular function dependent on the activation of the Notch pathway during the infection of peripheral blood mononuclear cells of healthy subjects with Mtb H37Rv in vitro. We observed that patients with active TB had increased DLL4 expression in intermediate and nonclassic monocytes and decreased expression of Notch 2 in CD8+ T cells. In vitro, we observed in the cultures of PBMCs, increased expression of DLL4 in intermediate monocytes and Notch 2 in CD4+ T cells. The expression of the DLL4 linker in intermediate monocytes and the expression of Notch 1 in CD4+ T cells in patients with active TB correlated positively with the degree of lung injury. In addition, patients with moderate and advanced lung injury have higher Notch 1 expression in CD4+ T cells when compared to patients with a minimal degree of lung injury. Patients with active TB showed a significant increase in plasma levels of IL-6, IP-10, CD14s and CD163s, and decreased levels of IFN-?, IL-17A, IL-4, IL-2, IL-1? and RANTES. The plasma levels of IFN-?, TNF-?, IL-17A, IL-4, IL-2, IL-12, IL-1?, RANTES and IL-10 correlated positively with the highest degree of lung injury. In addition, we demonstrated that levels of IFN-?, IL-17A, IL-1?, IL-4 and IL-2 are related to higher Notch 1 receptor expression in CD4+ T cells, whereas plasma levels of IP-10,CD163s and procalcitonin correlate with increased Notch 1 expression in CD8+ T cells. We have shown a greater trend in HES1 expression in patients with active TB and in vitro infected cells, indicating that the Notch pathway is being activated during Mtb infection. Interestingly, in vitro cultures of PBMCs treated with the Notch pharmacological inhibitor (GSI), reduced IL-17A, IL-2 and IL-10 production and increased IL-8, while anti-hDLL4 treatment promoted the significant increase in TNF-? levels and monocyte phagocytic activity. In conclusion, the expression of Notch receptors and ligands is altered during TB, especially the DLL4 linker in monocyte subpopulations. In addition, the Notch pathway appears to be important in modulating pro and anti-inflammatory responses. In this work, we suggest that Notch 1 expression in T cells and DLL4 in monocyte subpopulations is associated with TB severity. Thus, detection of these constituents of the Notch pathway in PBMCs of patients with active TB are potential biomarkers to assess disease progression.

A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa bacteriana causada por Mycobacterium tuberculosis (Mtb), acomete seres humanos em todo mundo, e é considerada uma das principais causas de morbidade e mortalidade dentre as doenças infecciosas. Nesse cenário, a TB ainda é vista como um grande desafio para a ciência e para medicina. Com o estudo de novos alvos moleculares para terapia e diagnóstico, por exemplo, a sinalização Notch tem sido descrita como uma via importante para a manutenção da resposta imunológica durante a infecção por Mtb. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a participação da via Notch na modulação da resposta imune durante a infecção por Mtb em humanos. Neste trabalho foram incluidos 13 pacientes com tuberculose ativa e 13 indivíduos saudáveis. Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladas e avaliadas quanto à expressão de receptores Notch 1 - 2 em células T e ligantes Notch, DLL1 - 4 em subpopulações de monócitos por citometria de fluxo e expressão de genes relacionados à via Notch e resposta imune. Além disso, o plasma foi utilizado para avaliar níveis de citocinas, CD14s e CD163s. Ainda, avaliamos a função celular dependente da ativação da via Notch durante a infecção de células mononucleares de sangue periférico de indivíduos saudáveis com Mtb H37Rv in vitro. Observamos que pacientes com TB ativa apresentaram aumento na expressão de DLL4 em monócitos intermediários e não-clássicos e diminuição na expressão de Notch 2 em células T CD8+. In vitro, observamos nas culturas de PBMCs, aumento da expressão de DLL4 em monócitos intermediários e Notch 2 em células T CD4+. A expressão do ligante DLL4 em monócitos intermediários e a expressão do Notch 1 em células T CD4+ em pacientes com TB ativa se correlacionaram positivamente com o grau de lesão pulmonar. Além disso, pacientes com quadros de lesão pulmonar moderado e avançado têm maior expressão de Notch 1 em células T CD4+ quando comparados a pacientes com grau mínimo de lesão pulmonar. Pacientes com TB ativa apresentam aumento significativo nos níveis plasmáticos de IL-6, IP- 10, CD14s e CD163s e diminuição nos níveis de IFN-?, IL-17A, IL-4, IL-2, IL-1? e RANTES. Os níveis plasmáticos de IFN-?, TNF-?, IL-17A, IL-4, IL-2, IL-12, IL-1?, RANTES e IL-10 se correlacionaram positivamente com o maior grau de lesão pulmonar.Além disso, demonstramos que os níveis de IFN-?, IL-17A, IL-1?, IL-4 e IL-2 se relacionam com maior expressão do receptor Notch 1 em células T CD4+ , enquanto níveis plasmáticos de IP-10, CD163s e de procalcitonina se correlacionam com maior expressão de Notch 1 em células T CD8+. Evidenciamos maior tendência na expressão de HES1 em pacientes com TB ativa e células infectadas in vitro, indicando que a via Notch está sendo ativada durante a infecção por Mtb. De forma interessante, in vitro as culturas de PBMCs tratadas com inibidor farmacológico da via Notch (GSI), reduziram a produção de IL-17A, IL-2 e IL-10 e aumentaram IL-8, enquanto o tratamento com anti-hDLL4 promoveu o aumento significativo nos níveis de TNF-? e atividade fagocítica de monócitos. Em conclusão, a expressão de receptores e ligantes Notch é alterada durante a TB, em especial o ligante DLL4 em subpopulações de monócitos. Além disso, a via Notch parece ser importante na modulação de respostas pró e anti-inflamatórias. Nesse trabalho, sugerimos que a expressão de Notch 1 em células T e DLL4 em subpopulações de monócitos estão associados com a gravidade da TB. Assim, a detecção desses constituintes da via Notch em PBMCs de pacientes com TB ativa são potenciais biomarcadores para avaliar a progressão da doença. / Tuberculosis (TB) is a bacterial infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), affects humans worldwide, and is considered a major cause of morbidity and mortality among infectious diseases. In this scenario, TB is still seen as a major challenge for science and medicine. With the study of new molecular targets for therapy and diagnosis, for example, Notch signaling has been described as an important pathway for the maintenance of immune response during Mtb infection. Thus, the objective of this work was to evaluate the participation of the Notch pathway in the modulation of the immune response during Mtb infection in humans. In this study, 13 patients with active tuberculosis and 13 healthy individuals were included. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated and evaluated for Notch 1 - 2 receptor expression in T cells and Notch, DLL1 - 4 ligands in monocyte subpopulations by flow cytometry and expression of Notch - pathway related genes and immune response. In addition, plasma was used to assess levels of cytokines, CD14s and CD163s. Furthermore, we evaluated the cellular function dependent on the activation of the Notch pathway during the infection of peripheral blood mononuclear cells of healthy subjects with Mtb H37Rv in vitro. We observed that patients with active TB had increased DLL4 expression in intermediate and nonclassic monocytes and decreased expression of Notch 2 in CD8+ T cells. In vitro, we observed in the cultures of PBMCs, increased expression of DLL4 in intermediate monocytes and Notch 2 in CD4+ T cells. The expression of the DLL4 linker in intermediate monocytes and the expression of Notch 1 in CD4+ T cells in patients with active TB correlated positively with the degree of lung injury. In addition, patients with moderate and advanced lung injury have higher Notch 1 expression in CD4+ T cells when compared to patients with a minimal degree of lung injury. Patients with active TB showed a significant increase in plasma levels of IL-6, IP-10, CD14s and CD163s, and decreased levels of IFN-?, IL-17A, IL-4, IL-2, IL-1? and RANTES. The plasma levels of IFN-?, TNF-?, IL-17A, IL-4, IL-2, IL-12, IL-1?, RANTES and IL-10 correlated positively with the highest degree of lung injury. In addition, we demonstrated that levels of IFN-?, IL-17A, IL-1?, IL-4 and IL-2 are related to higher Notch 1 receptor expression in CD4+ T cells, whereas plasma levels of IP-10,CD163s and procalcitonin correlate with increased Notch 1 expression in CD8+ T cells. We have shown a greater trend in HES1 expression in patients with active TB and in vitro infected cells, indicating that the Notch pathway is being activated during Mtb infection. Interestingly, in vitro cultures of PBMCs treated with the Notch pharmacological inhibitor (GSI), reduced IL-17A, IL-2 and IL-10 production and increased IL-8, while anti-hDLL4 treatment promoted the significant increase in TNF-? levels and monocyte phagocytic activity. In conclusion, the expression of Notch receptors and ligands is altered during TB, especially the DLL4 linker in monocyte subpopulations. In addition, the Notch pathway appears to be important in modulating pro and anti-inflammatory responses. In this work, we suggest that Notch 1 expression in T cells and DLL4 in monocyte subpopulations is associated with TB severity. Thus, detection of these constituents of the Notch pathway in PBMCs of patients with active TB are potential biomarkers to assess disease progression.

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Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / A tuberculose (TB) é uma doença infecto-contagiosa obtida a partir da inalação de aerossóis contendo seu agente etiológico, o Mycobacterium tuberculosis. A TB acomete principalmente os pulmões e é a patologia bacteriana líder em causar mortes no mundo. No Brasil, por ano, são notificados 69 mil casos de tuberculose, dos quais 4,6 mil evoluem para o óbito. Durante a infecção pelo M. tuberculosis, 90% dos indivíduos permanece na forma latente assintomática, e aproximadamente 10% evolui para doença. Este trabalho estudou parâmetros de resposta imune e inflamatória, em indivíduos de ambos os sexos, com idades de 18 a 65 anos, com diferentes graus de exposição ao M. tuberculosis (indivíduos não-expostos ao M. tuberculosis, TST < 5 mm, n= 30; indivíduos com tuberculose latente, TST &#8805; 5 mm, n=29; pacientes com tuberculose pulmonar n= 22). Nossos resultados mostraram que o TST isoladamente falhou em detectar todos os indivíduos expostos ao M. tuberculosis, e em 1/3 dos TST positivos não foi observada resposta in vitro a antígenos específicos de M. tuberculosis, avaliada com os biomarcadores IFN-&#947; e CXCL10. Houve uma alta correlação entre os biomarcadores IFN-&#947; e CXCL10 em culturas de sangue não fracionado estimuladas com antígenos específicos de M. tuberculosis. A utilização combinada destes 2 biomarcadores mostrou positividade para M. tuberculosis em 94,4% dos pacientes. Foram observadas diferenças marcantes de nível de expressão de RNA mensageiro específicos para CD64, GTPase associada a Ras, lactoferrina, PDL-1 e CXCL10, mas não para OASL em leucócitos sanguíneos, quando os pacientes com tuberculose pulmonar foram comparados com os dois outros grupos de voluntários. Da mesma forma, os níveis de expressão dos receptores CD64 e CD163 foram significativamente mais elevados em neutrófilos dos pacientes quando comparados com os grupos-controle. Tomadas em conjunto, nossas observações sugerem que o uso de mais de um biomarcador aumenta a sensibilidade e especificidade dos métodos para detecção de infecção latente por M. tuberculosis e tuberculose.

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / A tuberculose (TB) é uma doença infecto-contagiosa obtida a partir da inalação de aerossóis contendo seu agente etiológico, o Mycobacterium tuberculosis. A TB acomete principalmente os pulmões e é a patologia bacteriana líder em causar mortes no mundo. No Brasil, por ano, são notificados 69 mil casos de tuberculose, dos quais 4,6 mil evoluem para o óbito. Durante a infecção pelo M. tuberculosis, 90% dos indivíduos permanece na forma latente assintomática, e aproximadamente 10% evolui para doença. Este trabalho estudou parâmetros de resposta imune e inflamatória, em indivíduos de ambos os sexos, com idades de 18 a 65 anos, com diferentes graus de exposição ao M. tuberculosis (indivíduos não-expostos ao M. tuberculosis, TST < 5 mm, n= 30; indivíduos com tuberculose latente, TST &#8805; 5 mm, n=29; pacientes com tuberculose pulmonar n= 22). Nossos resultados mostraram que o TST isoladamente falhou em detectar todos os indivíduos expostos ao M. tuberculosis, e em 1/3 dos TST positivos não foi observada resposta in vitro a antígenos específicos de M. tuberculosis, avaliada com os biomarcadores IFN-&#947; e CXCL10. Houve uma alta correlação entre os biomarcadores IFN-&#947; e CXCL10 em culturas de sangue não fracionado estimuladas com antígenos específicos de M. tuberculosis. A utilização combinada destes 2 biomarcadores mostrou positividade para M. tuberculosis em 94,4% dos pacientes. Foram observadas diferenças marcantes de nível de expressão de RNA mensageiro específicos para CD64, GTPase associada a Ras, lactoferrina, PDL-1 e CXCL10, mas não para OASL em leucócitos sanguíneos, quando os pacientes com tuberculose pulmonar foram comparados com os dois outros grupos de voluntários. Da mesma forma, os níveis de expressão dos receptores CD64 e CD163 foram significativamente mais elevados em neutrófilos dos pacientes quando comparados com os grupos-controle. Tomadas em conjunto, nossas observações sugerem que o uso de mais de um biomarcador aumenta a sensibilidade e especificidade dos métodos para detecção de infecção latente por M. tuberculosis e tuberculose.

En 10-plex GeneXpert analysmetod för diagnos av M. Tuberculosis infektion samt med kapacitet att särskilja aktiv och latent tuberkulos har utvecklats på Cepheid. Analysmetoden sker ex-vivo och kvantifierar uttryck av tuberkulos associerade mRNA biomarkörer i antigenstimulerat helblod. Ett original set av mRNA biomarkörer har nedselekterats till 9 biomarkörer som utgör mRNA signaturen i 10-plex analysmetoden. Urvalet av biomarkörer baserades på probescreening och optimeringstudier utfört med Cepheids ”in cartridge” qPCR teknologi. Den diagnostiska prestandan av mRNA signaturen utvärderades genom att analysera 380 antigenstimulerade kliniska prover klassificerade som M. Tuberculosis infekterad, aktiv tuberkulos, latent tuberkulos och icke infekterad. mRNA signaturens förmåga korrekt klassificera samt diskriminera aktiv och latent tuberkulos bestämdes genom att implementera ROC-kurvor vilket resulterade i ett optimalt AUC-värde på 0.784 vilket visar på diagnostisk kapacitet att separera aktiv och latent tuberkulos. / A 10-color prototype GeneXpert assay based on distinct mRNA expression profiles in ex-vivo antigen stimulated whole blood has been developed at Cepheid for diagnosis of M. Tuberculosis infection and separation of active and latent tuberculosis. An original larger set of mRNA biomarkers has been downselected to a set of 9 biomarkers constituting the mRNA signature in the 10-color assay. The downselection of biomarkers was based on probe screening and optimization studies performed with Cepheid’s “in cartridge” qPCR technology. The 10-color assay was evaluated for diagnostic performance by analyzing 380 banked antigen stimulated clinical samples classified as M. Tuberculosis infected, active tuberculosis, latent tuberculosis and not infected. The ability of the mRNA signature to correctly classify and separate active and latent tuberculosis was determined by implementing ROC curves using delta Ctvalues as test variables and resulted in an optimal AUC value of 0.784 indicating ability to separate active and latent tuberculosis.