Un des mécanismes principaux de la morphogenèse des organismes est la contraction des réseaux d’actine sous l’effet du moteur moléculaire Myosine II. L’invagination de l’endoderme postérieur de Drosophila est causée par la contraction apicale des cellules par MyoII, mais la cause de sa déformation polarisée est inconnue. Nous avons découvert une vague de Rho1, MyoII et de déformation qui se propage à l’échelle du tissu et sous-tend la déformation de l’endoderme. MyoII est d’abord activée dans le primordium de l’endoderme par un ligand de GPCR, Fog. L’activation apicale de MyoII se propage ensuite à travers l’épithélium dorsal à 2.2 ± 0.2 µm/min. La dynamique de la vague n’est définie ni par les niveaux de Fog ni par leur motif d’expression. A la place, l’activité de MyoII est nécessaire pour l’activation intracellulaire de Rho1 et sa propagation à travers le tissu, indiquant une boucle de rétroaction. Des simulations d’un matériau viscoélastique contractile montrent qu’une boucle de rétroaction basée sur la tension peut générer une vague. Des perturbations de l’environnement mécanique du tissu avec des moyens génétiques ou mécaniques résultent en une augmentation de l’activité de MyoII et une diminution de la vitesse de la vague. Les déformations ou les forces du tissu procurent donc un rétrocontrôle sur l’activation de Rho1/MyoII lors de la vague, contrôlant sa dynamique. A l’échelle cellulaire, la vague de déformation implique la compression basale des cellules et l’étalement et l’adhésion du cortex apical sur la membrane vitelline, suivi d’un détachement. Ainsi la morphogenèse observée émerge de la propagation stimulée mécaniquement d’une vague de déformation 3D. / One of the main mechanisms of organism morphogenesis is the contraction of actin filament networks powered by non-muscle Myosin II motor proteins (MyoII). Drosophila presumptive posterior endoderm invagination is caused by MyoII-dependent apical constriction, but the cause of its polarized deformation is unknown. We unravelled a tissue scale wave of high Rho1 and MyoII activation and deformation which underlies the polarized deformation of the endoderm. MyoII is first activated medio-apically in cells within the endoderm primordium by the GPCR ligand Fog. Subsequently, apical MyoII activation propagates across the dorsal epithelium at a constant speed of 2.2 ± 0.2 µm/min. MyoII wave dynamics are set neither by Fog levels nor expression pattern. Instead, both intracellular Rho1 activation and its propagation across the tissue require sustained MyoII activity, indicating a positive feedback from contractility into Rho1 activity. Through simulations of a contractile viscoelastic material we found that a stress-based feedback loop could generate a wave. Perturbations of the tissue mechanical environment with both genetic and physical means result in an increase in MyoII activity and a strong reduction of the wave speed. Tissue deformation or stress thus provides a feedback onto Rho1/MyoII activity during the wave, controlling its dynamics. At the cell scale, the deformation wave involves cells basal compression and apical cortex spreading and adhering onto the vitelline membrane, followed by de-adhesion, that correlates with MyoII activation and propagation within cells. Thus the observed morphogenesis emerges from a mechanically driven wave of 3D deformation.

Chez les vertébrés, les cellules souches hématopoïétiques adultes émergent chez l'embryon à partir de l'endothélium de l'Aorte Dorsale et par un changement de morphologie cellulaire appelé Transition Endothélio-Hématopoïétique (TEH). L'EHT a été observée pour la première fois in vivo en utilisant le poisson zèbre et est régulée par le facteur de transcription runx1.Au cours de ma thèse, grâce à l'utilisation d'embryons de poisson zèbre transgéniques, j'ai mis en place des méthodes d'imagerie qualitative et quantitative afin d'analyser le processus cellulaire de la TEH in vivo ainsi que la dynamique des cellules environnantes à la plus haute résolution spatiale et temporelle possible. Mes résultats montrent que la TEH prend place dans un vaisseau dont l'organisation cellulaire et jonctionnelle est ajustée pour résister le plus efficacement possible aux forces mécaniques induites par le flux sanguin. La TEH nécessite la contraction d'un anneau cortico-apical d'actomyosine et le maintien des jonctions antéro-postérieures jusqu'à la fin du processus. De plus, il subit une série de phases de contraction et de relaxation suggérant sa régulation par un mécanisme de type ratchet. Les résultats montrent également l'implication de la Myosine regulatory light chain 9 (Myl9b) dont l'expression est régulée positivement par runx1. De plus, l'activité de la Myl9b au cours de la TEH nécessite la phosphorylation par la PKC de son domaine Nter. Dans ce contexte, nous faisons l'hypothèse que la phosphorylation Nter de la Myl9b, est une régulation essentielle au mécanisme de contraction de l'anneau cortico-apical d'actomyosine et est probablement à la base du mécanisme de type ratchet . / In vertebrates, Hematopoietic Stem Cells emerge from the endothelium of the dorsal aorta in a process featuring striking cell shape changes and called the Endothelial to Hematopoietic Transition (EHT). This transition was observed for the first time in vivo in our laboratory, using the zebrafish as a model organism, and is regulated by the transcription factor runx1. During my PhD, using transgenic zebrafish embryos, I set up qualitative and quantitative imaging methodologies to dissect the EHT process and the dynamics of surrounding vascular cells at the highest possible spatio-temporal resolution. My results show that the EHT is a unique cellular process, that takes place in a vessel whose cellular and intercellular organisation are tuned to resist the hemodynamic forces induced by blood flow. It requires the contraction of an apico-cortical actomyosin belt and the maintenance of antero-posterior to release the cells into the sub-aortic space while preserving the vessel integrity. The apical belt undergoes series of contraction/relaxation phases suggesting that it is controlled by a ratchet-like mechanism. I also provide evidence supporting a role of the Myosin regulatory light chain 9 (Myl9b) whose expression is positively regulated by the transcription factor runx1. The activity of Myl9b in the EHT is requires its amino-terminal PKC phosphorylation site. We make the hypothesis that the phosphorylation of the amino-terminal of Myl9b, at a site that is conserved through vertebrate species, is key to the regulation of the contraction of the cortico-apical actomyosin belt and is most probably at the basis of its dynamic control according to a ratchet-like mechanism.

Les cellules épithéliales fournissent différentes fonctions biologiques: elles servent de barrière entre l'extérieur et l'intérieur d'un organisme et forment un continuum mécanique à travers les jonctions adhérentes qui les connectent. Au cours du développement, elles subissent des modifications extrêmes pour former l'embryon: elles changent de forme, modifient leur position relative ou perdent leur intégrité épithéliale. La plus part de ces changement se basent sur la modulation de l'actomyosine corticale et jonctionale, et sur la modulation des protéines qui définissent et maintiennent la polarité apico basale. Neuralized (Neur) est une E3 ubiquitine ligase qui est conservée des nématodes jusqu'aux mammifères. Elle a été découverte pour son rôle dans la régulation de la signalisation Delta/Nocth. Dans ce travail on décrit deux autres functions Notch-indépendantes de Neur dans le remodelage des épithéliums. En premier temps, on montre que Neur régule négativement la protéine apicale Crumbs à travers une isoforme de Stardust, ce qui permet le remodelage de l'intestin postérieur de la Drosophile et favorise la migration trans-epithéliale des cellules germinales primordiales. Puis, on présente que, pendant la gastrulation, Neur module la contractilité de l'actomyosine dans le mésoderme, et indirectement dans l'ectoderme, pour contrôler la formation du sillon ventral. / Epithelial cells serve many biological functions: they act as a barrier to separate the interior from the exterior, and form a mechanical continuum through the junctions that interconnect them. During development, they undergo dramatic changes to shape the embryo: they change their shape, modify their relative position or lose their epithelial integrity. Most of these changes rely on the modulation of cortical and junctional actomyosin, and the regulation of the proteins that define and maintain the epithelial apical/basal polarity. Neuralized (Neur) is an E3 ubiquitin ligase conserved from nematodes to mammals. It was first discovered for its role in the regulation of Delta/Notch signalling. Here we describe two Notch independent roles of Neur in epithelial remodelling. First, we show that Neur negatively regulates the apical protein Crumbs though a specific isoform of Stardust. This allows the remodelling of the drosophila posterior midgut and favours the trans-epithelial migration of the primordial germ cells. Finally, we present that Neur modulates actomyosin contractility in the mesoderm, and indirectly in the ectoderm, to control ventral furrow formation during gastrulation.

Forces requises pour les changements de forme au cours de la morphogenèse des tissus sont générés par d’actine et de myosine. Durant ma thèse, je étudié le rôle de la réglementation MyoII par la voie Rho1-Rok durant l’élongation de l’ectoderme ventro-latéral par intercalation cellulaire. Les pulsations de MyoII médio-apicale se déplacent de manière anisotrope vers les jonctions parallèles avec l’axe dorso-ventral (ou jonctions verticales). Ceci provoque le rétrécissement graduel des jonctions qui sont stabilisées par une population de MyoII polarisée dans le plan du tissu et enrichie au niveau de ces jonctions. Les mécanismes cellulaires qui régulent la pulsatilité, la stabilité et la polarité de la myosine II restent à élucider. J’ai identifié deux propriétés cruciales de la dynamique de la myosine II régie par phospho- à savoir la cinétique d’échange gouvernée par les cycles de phosphorylation-déphosphorylation des chaines légères régulatrices de la MyoII (RLC) et l’advection due à la contraction des moteurs sur le réseau de F-actine. Contrôle spatial sur le chiffre d'affaires MyoII établit 2 régimes stables des taux élevés et faibles dissociation résultant dans MyoII polarité. Pulsatilité est un comportement auto-organisé qui émerge à taux de dissociation intermédiaires permettant d'advection MyoII et les régulateurs en amont. Dans la deuxième partie de ma thèse, je l'ai montré que la protéine GPCR- GRsmog et la brume, et la voie G-protéines en aval permettent l'activation progressive des MyoII, établissant pulsatilité et de la stabilité pour produire des déformations de forme polarisées cours de la morphogenèse. / Forces required to power shape changes during tissue morphogenesis are generated by non-muscle MyosinII (MyoII) pulling filamentous actin. During my PhD, I investigated the role of MyoII regulation through the conserved Rho1-Rok pathway during Drosophila germband extension. The morphogenetic process is powered by cell intercalation involving shrinkage of junctions in the dorsal-ventral axis (‘vertical junctions’) followed by junction extension in the anterior-posterior axis. Advances in light microscopy revealed that the actomyosin networks exhibit pulsed contractions to power junction shrinkage, and alternate with steps of stabilization by MyoII enriched on vertical junctions (planar-polarity) to result in irreversible shape changes. Although described in many different contexts, the underlying mechanisms of this ratchet-like behavior remained unclear. Using genetic and biophysical tools, quantitative imaging and subtle perturbations, I identified 2 critical properties underlying MyoII dynamics- turnover governed by phospho-cycling of the MyoII Regulatory Light Chain, and advection due to contraction of the motors on actin networks. Spatial control over MyoII turnover establishes 2 stable regimes of high and low dissociation rates resulting in MyoII planar polarity. Pulsatility is a self-organized behavior that emerges at intermediate dissociation rates enabling advection of MyoII and upstream regulators. In the second part of my thesis, I showed that G protein coupled receptors- GRsmog and Mist, and the downstream G-protein pathway allow step-wise activation of MyoII, establishing pulsatility and stability, to drive polarized shape deformations during morphogenesis.

La morphogenèse des tissus dans les organismes multicellulaires est très importante pour le développement et certaines pathologies. La morphogenèse tissulaire est dirigée par des forces bio-mécaniques générées par des moteurs moléculaires tels que la myosine et transmis via le cytosquelette et les structures d'adhésion à l'intérieur et entre les cellules. La contractilité de la myosine, souvent en mode oscillatoire, a été étudiée principalement au niveau du domaine apical des cellules épithéliales au cours du développement mais très peu au niveau de leur domaine basal. L'oscillation de la myosine basale est importante pour le contrôle de l'élongation du tissu durant l'oogenèse chez la Drosophile. Bien que la voie Rho1-ROCK-myosin-MBS soit connue pour contrôler l'activité de la myosine, le mécanisme précis de ce contrôle n'a pas été élucidé. Le but de mon projet de thèse est de répondre à deux questions : Quels sont les facteurs en amont de cette voie ? Comment cette voie de signalisation crée et maintient l'oscillation de la myosine ? 1) Contrairement à ce qui est déjà connu, Je me suis intéressé à l'effet des adhésions cellule-cellule et cellule-matrice dans le contrôle des voies de signalisation gouvernant l'oscillation de la myosine basale. Les adhésions cellule-matrice, mais pas les adhésions cellule-cellule, sont positivement corrélées avec l'intensité et la polarité dorso-ventrale de la myosine, indiquant que les adhésions cellule-matrice pourraient être les facteurs en amont de la voie Rho1-myosine. Les adhésions cellule-matrice régulent positivement l'activité de Rho1 près des jonctions et gouvernent les flux de ROCK et myosine à l'intérieur du domaine median, contrôlant ainsi l'élongation du tissu. D'une autre manière, les adhésions cellule-cellule affectent indirectement les flux de ROCK and myosine en contrôlant la distribution subcellulaire de ROCK et du réseau d'actomyosine. L'inhibition des adhésions cellule-cellule, qui a un effet mineur sur l'élongation du tissu, provoque la redistribution des adhésions cellule-matrice et des filaments F-actin entrainant le chargement de la myosine à différentes positions. 2) J'ai montré que l'oscillation de la myosine basale dépend peu de la tension corticale de l'actomyosine : l'inhibition du chargement de la myosine sur les filaments d'actine n'affecte pas le flux de myosine alors qu'il bloque fortement le cycle périodique des contractions/relaxations de la cellule indiquant que l'oscillation est principalement due à une réaction biochimique plutôt qu'à une tension corticale. Au cours de l'oscillation de la myosine, les protéines Rho1 et leur activité sont principalement distribuées et enrichies au niveau et près des jonctions basales, et le contrôle majeur de cette oscillation est le flux des signaux ROCK qui diffusent des jonctions basales au cortex medio-basal. Ce mouvement de ROCK est initié grâce à une interaction transitoire entre ROCK et Rho1 actif au niveau et près des jonctions basales, conduisant ainsi à l'ouverture et activation de la kinase ROCK. Au cours de ce mouvement, l'activation de ROCK permet l'accumulation et l'amplification des signaux ROCK; Cette amplification entraîne la phosphorylation de la myosine, qui ensuite génère la redistribution dynamique de la phosphatase MBS. Enfin, l'enrichissement des signaux MBS arrête les signaux ROCK et myosine. Dans ces deux études, nous avons construit un outil optogénétique confirmant les différentes étapes de l'oscillation de la myosine basale. L'ensemble de ces résultats démontrent que le mécanisme contrôlant l'oscillation de la myosine basale nécessite une réaction biochimique, et met en évidence deux contrôles diffèrent de cette oscillation par les adhésions cellule-cellule et les adhésions cellule-matrice. / Tissue morphogenesis in multicellular organisms is very important in both development and human disease. Tissue morphogenesis is driven by bio-mechanic force that is normally generated by molecular motors such as myosin and transmitted via cytoskeleton and adhesion structures within and between cells. Myosin contractility, often as an oscillatory pattern, has been studied mainly in apical but less in basal domains of epithelial cells during development. Basal myosin oscillation is important in control of tissue elongation during Drosophila oogenesis. Although a signal cascade (Rho1-ROCK-myosin-MBS) has been known to regulate myosin activity, the detailed controlling mechanism is unclear. My project is aimed to address two questions: first, what is the upstream factor of this signal cascade? Second, how does this signal cascade create and maintain basal myosin oscillation? For this first question, I am interested in the effect of cell-cell and cell-matrix adhesion in control of this signal cascade governing basal myosin oscillation. Cell-matrix adhesion (Integrin and Talin), but not cell-cell adhesion (E-cadherin), is positively correlated with the intensity and Dorsal-ventral (DV) axis polarity of basal myosin oscillation, indicating that cell-matrix adhesion might be the upstream control of Rho1-myosin signal cascade. Cell-matrix adhesion positively regulates the Rho1 activity near junction and governs the pulsed ROCK and myosin signals within basal-medial domain, thus strongly controlling tissue elongation. Differently, cell-cell adhesion indirectly affects the ROCK and myosin pulses through controlling the subcellular distribution of ROCK and actomyosin network. Inhibition of cell-cell adhesion results in the redistribution of cell-matrix adhesion and F-actin filaments leading to different position of myosin loading, which plays minor effect on tissue elongation. For the second question, I unraveled that basal myosin oscillation is barely dependent on actomyosin cortical tension: inhibition of myosin loading to F-actin filament seems not to affect basal pulsatile myosin flows, while it strongly blocks the periodic cycle of cell contraction and relaxation at basal surface, thus indicating that oscillation is mainly from biochemical reaction rather than cortical tension. This observation highlighted that biochemical reaction is the main control of oscillation occurrence. During basal myosin oscillation, Rho1 proteins and Rho1 activity are mainly distributed and enriched at and near basal junction and the major control of basal myosin oscillation is the flow movement of oscillatory ROCK signals from basal junction to medio-basal cortex. This ROCK flow movement is initiated from the transient interaction of ROCK with active Rho1 at and near basal junction, thus leading to the opening and activation of ROCK kinase capability. During the membrane-medial flow movement, ROCK kinase activity mediates the accumulation and thus the amplification of ROCK signals; this positive signal amplification turns on the phosphorylation of myosin regulatory light chain (MRLC), which governs the dynamic redistribution of MBS. Finally, enriched MBS signals shut off both ROCK and myosin signals. In both study, an optogenetic tool named as LARIAT was built up in vivo to confirm the various status of basal myosin oscillation. Altogether, these results demonstrated two different controls of basal actomyosin signals by cell-matrix adhesion and cell-cell adhesion, and further demonstrated the underlying mechanism of basal myosin oscillation at the biochemical levels.

Les cellules neuroendocrines possèdent d’une part la voie de sécrétion constitutive, existant dans tous les types cellulaires, qui permet le renouvellement continu de la membrane plasmique et de la matrice extracellulaire, et d’autre part la voie de sécrétion régulée, spécifique aux cellules sécrétrices, qui permet la sécrétion d’hormones suite à la stimulation de la cellule. Les organites impliqués dans cette dernière voie sont des granules de sécrétion à cœur dense (GS), sui stockent les hormones ainsi que les glycoprotéines solubles, les granines. Parmi ces dernières, la chromogranine A (CgA) joue un rôle majeur dans la biogénèse des GS mais les mécanismes moléculaires ne sont pas clairement définis. Dans une lignée de cellules non-endocrines COS7 (dépourvues de granines et donc de voie de sécrétion régulée), mon équipe d’accueil a démontré que l’expression de la CgA induit la formation de vésicules présentant une structure et des fonctions caractéristiques des GS. L’analyse du protéome des GS purifiés à partir d’une lignée de cellules COS7 exprimant de manière stable la CgA (COS7-CgA) a révélé la présence de protéines liant les éléments du cytosquelette et le calcium. Durant ma thèse, nous avons focalisé notre attention sur la myosine 1b (myo1b), l’actine et le complexe de nucléation de l’actine Arp2/3 du fait de leur capacité à induire le bourgeonnement de compartiments post-golgiens dans des cellules non-endocrines. Nous avons montré (i) que la myo1b contrôle la formation des GS ainsi que la sécrétion régulée au sein des cellules COS7-CgA et des cellules neuroendocriniennes PC12, et (ii) que la myo1b et le complexe Arp2/3 permettent le recrutement d’actine fibrillaire dans la région golgienne et la formation des GS. Ces travaux montrent pour la première fois l’implication du complexe actomyosine dans la formation des GS. Afin d’identifier le lien moléculaire entre la CgA luminale et la myo1b cytosolique, nous avons recherché les interactions potentielles de la CgA avec les lipides de la membrane du réseau trans-golgien (TGN). Nous avons montré (i) que la CgA interagit avec l’acide phosphatidique (PA), (ii) que les espèces de PA prédominantes sont communes dans les membranes golgienne et granulaire, (iii) que la CgA est capable d’interagir spécifiquement avec des espèces de PA intégrées avec des membranes artificielles et (iv) que l’inhibition de la production du PA au niveau golgien altère significativement la formation des GS et la sécrétion régulée dans les cellules neuroendocrines. L’ensemble des résultats obtenus dans le cadre de ma thèse suggère que l’interaction entre la CgA et le PA est cruciale pour la biogenèse de GS à partir de la membrane du TGN. Nous émettons l’hypothèse que cette interaction est à l’origine de la formation de microdomaines enrichis en PA qui contrôleraient la courbure de la membrane du TGN et le recrutement du complexe actomyosine. / Neuroendocrine cells exhibit the constitutive secretory pathway which is common all cell types and allows the continuous renewal of the plasma membrane and the extracellular matrix, and the regulated secretory pathway, which is specific to secretory cells and allows hormone secretion following cell stimulation. The organelles supporting the latter pathway are dense-core secretory granules (SG), which store hormones and soluble glycoproteins, called granins. Among these, chromogranin A (CgA) plays a major role in the biogenesis of SG but the molecular mechanisms underlying this process are not clearly understood. Using non-endocrine COS7 cell line (which are devoid of granins and regulated secretory pathway), my host team has demonstrated that the CgA expression induces the formation of vesicles with structural and functional characteristic of SG. The proteome analysis of purified SG from a COS7 cell line stably expressing CgA (COS7-CgA) revealed the presence of cytoskeleton- and calcium-binding proteins. During my thesis, we focused our attention on myosin 1b (myo1b), actin and actin nucleation complex Arp2/3 due to their ability to induce the budding of post-Golgi compartments in non-endocrine cells. We have shown (i) that myo1b controls SG formation as welle as the regulated secretion in COS7-CgA and PC12 neuroendocrine cells, (ii) that myo1b and Arp2/3 complex are required to recruit fibrillar actin (F-actin) to the Golgi region and to SG formation. These results highlight for the first time the involvement of the actomyosin complex in SG formation. In order to identify the molecular link between luminal CgA and Cytosolic myo1b, we investigated the potential interactions of CgA with lipids of the trans-Golgi network (TGN) membrane. We showed (i) that CgA interacts with phosphatidic acid (PA), (ii) that the predominant PA species are common in Golgi and granular membranes, (iii) that Cg Ais able to interact specifically with these PA species included in artificial membranes, and (iv) that inhibition of PA production at the Golgi level significantly alters SG formation and regulated secretion in neuroendocrine cells. All these results obtained during my thesis suggest that the interaction between CgA and PA is crucial for SG biogenesis from the TGN membrane. We suggest that this interaction is at the origin of the formation of PA-enriched microdomains that could control the curvature of the TGN membrane and the recruitment of the actomyosin complex.

Le complexe actomyosine, formé de l’association de la myosine II avec les filaments d’actine, stabilise le cytosquelette d’actine et génère la contraction cellulaire nécessaire à plusieurs processus comme la motilité et l’apoptose dans les cellules non-musculaires. La myosine II est un hexamère formé d’une paire de chaînes lourdes (MHCs) et de deux paires de chaînes légères MLC20 et MLC17. La régulation de l’activité de la myosine II, c'est-à-dire son interaction avec les filaments d’actine, est directement liée à l’état de phosphorylation des MLC20, mais il reste beaucoup à découvrir sur l’implication des MHCs. Il existe trois isoformes de MHCs de myosine II, MHCIIA, MHCIIB et MHCIIC qui possèdent des fonctions à la fois communes et distinctes. Notre but est de mettre en évidence les différences de fonction entre les isoformes de myosine II, au niveau structurale, dans la stabilisation du cytosquelette d’actine, et au niveau de leur activité contractile, dans la génération des forces de tension. Nous nous sommes intéressés au rôle des isoformes des MHCs dans l’activité du complexe actomyosine qui est sollicité durant le processus de contraction cellulaire de l’apoptose. Dans quatre lignées cellulaires différentes, le traitement conjoint au TNFα et à la cycloheximide causait la contraction et le rétrécissement des cellules suivi de leur détachement du support de culture. Par Western blot, nous avons confirmé que la phosphorylation des MLC20 est augmentée suite au clivage de ROCK1 par la caspase-3, permettant ainsi l’interaction entre la myosine II et les filaments d’actine et par conséquent, la contraction des cellules apoptotiques. Cette contraction est bloquée par l’inhibition des caspases et de ROCK1. MHCIIA est dégradée suite à l’activation de la caspase-3 alors que MHCIIB n’est pas affectée. En utilisant une lignée cellulaire déficiente en MHCIIB, ou MHCIIB (-/-), nous avons observé que la contraction et le détachement cellulaires durant l’induction de l’apoptose se produisaient moins rapidement que dans la lignée de type sauvage (Wt) ce qui suggère que l’isoforme B est impliquée dans la contraction des cellules apoptotiques. Parallèlement, la kinase atypique PKCζ, qui phosphoryle MHCIIB et non MHCIIA, est activée durant l’apoptose. PKCζ joue un rôle important puisque son inhibition bloque la contraction des cellules apoptotiques. Par la suite, nous nous sommes intéressés à la modulation de la morphologie cellulaire par la myosine II. Les fibroblastes MHCIIB (-/-), présentent un large lamellipode dont la formation semble dû uniquement à l’absence de l’isoforme MHCIIB, alors que les fibroblastes Wt ont une morphologie cellulaire étoilée. La formation du lamellipode dans les fibroblastes MHCIIB (-/-) est caractérisée par l’association de la cortactine avec la membrane plasmique. L’observation en microscopie confocale nous indique que MHCIIA interagit avec la cortactine dans les fibroblastes Wt mais très peu dans les fibroblastes MHCIIB (-/-). Le bFGF active la voie des MAP kinases dans les fibroblastes Wt et MHCIIB (-/-) et induit des extensions cellulaires aberrantes dans les fibroblastes MHCIIB (-/-). Nos résultats montrent que l’implication de l’isoforme B de la myosine II dans la modulation de la morphologie cellulaire. L’ensemble de nos résultats participe à distinguer la fonction structurale et contractile de chacune des isoformes de myosine II dans la physiologie cellulaire. / We are interested in studying the modulation of the actomyosin complex which is involved in different cellular processes such as cell locomotion and apoptosis. The actomyosin complex is formed by the association of actin filaments and myosin II. The non-muscle myosin II is a hexamer formed by one pair of heavy chains (MHCs) and two pairs of light chain (MLC20 and MLC17). The actomyosin activity is dependent on MLC20 and MHCs phosphorylation. There are three isoforms of MHCs (MHCIIA, MHCIIB and MHCIIC) which have common but also distinctive roles in several cellular processes. Our aim is to clarify the structural and contractile functions of each isoforme of myosin II in different cellular processes, in particular, cell contraction and cell morphology. First, we studied the implication of myosin II isoforms in cell shrinkage and detachment during apoptosis which are both dependent on actomyosin contractility. We treated four different cell lines with TNFα in combination with cycloheximide (CHX) to trigger apoptosis. We confirmed that TNFα induced caspase-3 activation, ROCK1 cleavage and increased MLC20 phosphorylation. We showed that TNFα/CHX induced the caspase-dependent MHCIIA degradation, whereas MHCIIB levels and association with the actin cytoskeleton remained virtually unchanged. Cell shrinkage and detachment were blocked by caspase and ROCK1 inhibitors. Using the MHCIIB (-/-) cell line, we observed that the absence of MHCIIB did not affect cell death rate. However, MHCIIB (-/-) fibroblasts showed more resistance to TNFα-induced actin disassembly, cell shrinkage and detachment than wild type (Wt) fibroblasts, indicating the participation of MHCIIB in these events. PKCζ, which only phosphorylates MHCIIB, was cleaved during apoptosis, co-immunoprecipitated preferentially with MHCIIB and, interestedly, PKCζ inhibition blocked TNFα-induced shrinkage and detachment. Our results demonstrate that MHCIIB, together with MLC phosphorylation and actin, constitute the actomyosin cytoskeleton that mediates contractility during apoptosis. Second, we studied the involvement of myosin II isoforms in cell shape modulation. Fibroblasts MHCIIB (-/-) spontaneously formed lamellipodia whereas Wt fibroblasts presented a stellate shape. Cortactin was associated with the leading edge of lamellipodia in MHCIIB (-/-) fibroblasts, but it localised diffusely in the cytoplasm or at the end of fine cellular projections in Wt fibroblasts. The levels of cortactin and cortactin phosphorylated in Tyr421 associated with membrane in MHCIIB (-/-) fibroblasts were higher than in Wt fibroblasts. Confocal microscopy showed cortactin/MHCIIA colocalization in wild type but not in MHCIIB (-/-) fibroblasts. bFGF activates Erk1/2 in wild type and MHCIIB (-/-) fibroblasts and induces the formation of aberrant membrane projections in MHCIIB (-/-) fibroblasts. In conclusion, our results contribute to characterize the structural and contractile role of each myosin II isoforms in the physiology of the cell.

No description available.

La cellule est l’unité à la base de la vie. Elle est généralement délimitée par sa membrane et contient un noyau et du cytoplasme en plus d’autres composantes. Les cellules se divisent afin de maintenir et de perpétuer la vie par duplication de leur matériel génétique et par leur séparation en deux cellules physiquement distinctes durant la cytocinèse. Cependant, la division cellulaire est parfois modifiée et aboutit à la formation d’un tissu contenant plusieurs noyaux bordés d’une membrane unique appelé syncytium. Les syncytia sont fréquemment retrouvés chez les organismes vivants, bien que leurs fonctions et mode de formation restent peu compris. L’organisation en syncytium est conservée chez tous les animaux étudiés à ce jour au niveau de la lignée germinale dans laquelle les cellules partagent un cytoplasme commun par l’intermédiaire d’un pont intercellulaire stable. Dans la majorité des lignées germinales étudiées, les cellules sont directement connectées l’une à l’autre par un pont intercellulaire stable qui émerge de cytocinèses incomplètes. Cependant, certaines lignées germinales sont organisées autour d’une cavité commune à laquelle chaque cellule germinale est connectée. Dans ces lignées germinales, les mécanismes qui mènent à l’expansion du syncytium sont peu compris. Ma thèse décrit l’utilisation de la lignée germinale primordiale de C. elegans à son premier stade larvaire pour mieux comprendre l’organisation, l’expansion et la fonction des lignées germinales syncytiales. En utilisant la microscopie électronique et confocale, j’ai découvert que l’organisation du syncytium est fixée au premier stade larvaire. En effet, les deux cellules germinales primordiales (CGP) sont chacune individuellement connectée à une cavité cytoplasmique centrale par le biais de ponts intercellulaires stables. Nous avons nommé cette cavité le proto-rachis car l’organisation des CGP est identique à l’organisation de la gonade adulte. Chez l’adulte, les ponts intercellulaires qui connectent les cellules germinales au rachis sont stabilisés par des régulateurs d’actomyosine. Nous avons vérifié si cela était également le cas dans la gonade au premier stade larvaire. Tous les régulateurs présents dans la gonade adulte, sont aussi présent dans les ponts intercellulaires des CGP, mais la lignée germinale primordiale est réfractaire à la perturbation de la fonction de ces régulateurs. Ce résultat suggère que les régulateurs d’actomyosine sont organisés de manière très stable au premier stade larvaire. Afin de mieux comprendre comment le syncytium se développe dans la lignée germinale de C. elegans, j’ai ensuite suivi la première division des CGP par microscopie à temps réel. J’ai mis en évidence que l’anneau de cytocinèse se stabilise, puis se déplace vers le proto-rachis jusqu’à qu’il s’y intègre. Ces résultats indiquent que le syncytium se développe par cytocynèse incomplète. De plus, mes résultats montrent que la connexion au proto-rachis est maintenue durant la division des CGP. C’est pourquoi nous proposons un modèle pour l’expansion du syncytium dans lequel l’anneau de cytocinèse stabilise pour connecter une des cellules filles au proto-rachis, tandis que l’autre cellule fille est connecté par l’anneau stable qu’elle aura hérité de la cellule mère. Enfin, pour s’assurer que les mécanismes d’expansion du syncytium observés durant la division des CGP sont conservés au cours du développement de la gonade, j’ai conceptualisé et créé un dispositif de micro-fluidique qui en théorie permettrait de suivre plusieurs séries de division des CGP. En somme, mon travail de doctorat a fourni une caractérisation détaillée de la structure du syncytium dans la lignée germinale de C. elegans au premier stade larvaire, ainsi qu’un modèle pour l’expansion du syncytium. Mes découvertes indiquent que malgré des différences dans l’organisation des syncytia, la cytocinèse incomplète est un mécanisme conservé dans toutes les lignées germinales animales. Des travaux futurs seront nécessaires pour découvrir quelles voies de signalisation moléculaires sont sous-jacentes aux mécanismes de formation des syncytia, et ainsi de mieux comprendre quelle est la fonction de ces structures fascinantes. / The cell constitutes the basic unit of life. It is generally delimited by its membrane and contains a nucleus and cytoplasm amongst other components. To maintain and perpetuate life, cells divide by duplicating their genetic material, and by physically separating into two distinct cells during the process called cytokinesis. However, cell division is sometimes modified and leads to the formation of a tissue in which several nuclei are delimited by a single membrane, called a syncytium. Syncytial tissues are common amongst living organisms, but why and how they form remains unclear. The syncytial architecture is conserved in all studied animal germlines where germ cells share a common cytoplasm through stable intercellular bridges. In most animal germlines, the germ cells are directly connected with one another, and the stable intercellular bridges that connect the cells are known to arise from regulated incomplete cytokinesis. However, some germlines are organized around a central common cavity to which each germ cell is connected. In such germlines, the mechanisms of syncytium expansions remain unknown. My thesis describes the use of the C. elegans germline primordium at the first larval stage to better understand the organization, the expansion, and the function of germline syncytia. Using electron and confocal microscopy I found that the organization of the syncytium is established at the first larval stage. The two germ cells called the primordial germ cells (PGCs) each connect to a central cytoplasmic cavity through stable intercellular bridges. Because this organization is identical to the adult germline where each germ cell is connected to the central rachis, we termed the cavity between the PGCs proto-rachis. In the adult gonad, the intercellular bridges that connect the germ cells to the rachis are stabilized by actomyosin regulators, so I verified if this was also the case in the first larval stage gonad. All the regulators that localize to adult intercellular bridges were also present between the PGCs, but the primordial germ line is refractory to perturbation of these regulators. This suggests that the actomyosin regulators are organized in a very stable manner in the first larval stage germline. I next tracked the first division of the PGCs with live imaging to better understand how the syncytium expands in the C. elegans germline. I found that the cytokinetic ring stabilizes, then displaces towards the proto-rachis until it integrates into the syncytial structures. This finding suggests the syncytium expands by incomplete cytokinesis. In addition, my results indicate that the connection to the proto-rachis was maintained during PGCs division. We therefore propose a model in which the cytokinetic ring stabilizes and connects one of the daughter cells to the proto- rachis while the other cell is connected through the inherited stable ring from the mother cell. Finally, I designed and a created a microfluidic device that in theory would allow us to live image several rounds of PGCs division. This would confirm if the mechanisms of syncytium expansion that we observed during the first division of the PGCs are conserved in further development. My work has provided a detailed characterization of the syncytial structure in the C. elegans germline primordium as well as a model for syncytium expansion. My findings indicate that despite differences in the organization of the syncytium, incomplete cytokinesis is conserved as the mechanism for syncytium expansion in all animal germlines. Further research will be necessary to bring to light the molecular pathways underlying syncytium formation to have a better understanding of the function of these fascinating structures.