Die Regulation des Kohlenstoffkatabolismus erfolgt in Escherichia coli wesentlich über den Einfluss der intrazellulären cAMP-Konzentration auf die Expression der Gene des crpA-Modulon. cAMP wird durch die Adenylatzyklase CyaA synthetisiert, die wiederum durch phosphoryliertes IIACrr aktiviert wird. Im Rahmen eines Stoffwechselmodellierungsprojektes sollten durch die Entwicklung von Systemen zur quantitativen Messung der intrazellulären cAMP-Konzentration und des Phosphorylierungszustands von IIACrr zwei entscheidende Parameter dieses Regulationsnetzwerkes untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde ein System zur reproduzierbaren, direkten Messung der intrazellulären cAMP-Konzentration in E. coli etabliert. Zur in vivo Bestimmung der intrazellulären cAMP-Konzentration wurden zwei verschiedene durch cAMP·CrpA regulierte Promotoren mit den Reportergenen für ß-Galaktosidase oder Aequorin (grün fluoreszierendes Protein) fusioniert und in drei verschiedenen Messkonstrukten untersucht. Die Zugabe von Pyruvat zu gehungerten Zellen führte zu einer Desphosphorylierung von IIACrr. Der so direkt gezeigte Einfluss des PEP/Pyruvat Verhältnisses auf das Phosphorylierungsgleichgewicht von IIACrr zeigt einen Mechanismus, über den PTS-unabhängige Substrate den Phosphorylierungszustand von IIACrr verändern und somit die Aktivität der Adenylatzyklase beeinflussen können. Bei der Untersuchung zur zellulären Lokalisation der Adenylatzyklase in E. coli mit Hilfe einer CyaA-Aequorin-Fusion wurde nach Überexpression des Fusionsproteins eine lokale Anhäufung der Fluoreszenz an den Zellpolen beobachtet. Da bei geringerer Expression der Fusion kein Fluoreszenzsignal mehr erfasst werden konnte, war eine endgültige Lokalisierung der Adenylatzklase mit dieser Methode nicht möglich.

In der Optogenetik werden genetisch codierbare Photorezeptorproteine in Zellen eingebracht, um spezifische Parameter durch Licht zu kontrollieren. Um den sekundären Botenstoff zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) zugänglich zu machen, haben wir vier neu identifizierte photoaktivierte Adenylatzyklasen untersucht. Die vier Gene stammen aus einem Sulfid oxidierenden Bakterium Beggiatoa und aus einem Amoeboflagellaten Naegleria gruberi. Sie codieren für 350 bis 489 Aminosäuren lange Proteine und enthalten eine Blaulicht wahrnehmende BLUF- (blue light sensors using FAD) und eine Adenylatzyklasedomäne. Zellbasierte Funktionstests in E. coli, Xenopus Oozyten und CHO Zellen sowie die Bestimmung der Adenylatzyklase-Aktivität in vitro zeigen, dass alle vier PACs lichtaktiviert arbeiten. Dabei besitzt die bakterielle PAC (bPAC) das größte Potenzial für eine optogenetische Anwendung, da sie eine hohe Lichtaktivität und ein große Licht-zu-Dunkel-Aktivitätsverhältnis besitzt. Um den Vorteil bPACs gegenüber PACalpha aus Euglena zu demonstrieren, verglichen wir beide PACS in Xenopus Oozyten, in Ratten Neuronen und in Drosophila Fliegen. Gegenüber PACalpha besitzt bPAC eine geringere Aktivität im Dunkeln, eine höhere Lichtsensitivität und einen breiteren dynamischen Bereiche und ist damit für viele Anwendungen die bevorzugte PAC. In einem analytischen Ansatz untersuchten wir die Bedeutung der BLUF-Domänen für die Regulation von bPAC. Nach Entfernen der BLUF-Domänen verblieb nur die inaktive Zyklase. Mutationen innerhalb der BLUF-Domäne, die die Photochemie oder die Signaltransduktion beeinflussten, führten zur Ausbildung eines partiell aktiven Rezeptorgrundzustandes. Dies verdeutlicht die Bedeutung eines intakten Wasserstoffbrückennetzwerkes für die funktionelle Regulation von bPAC. Als Ergenbis einer anwendungsorientierten Optimierung wurden eine bPAC Variante mit reduzierter Dunkelaktivität sowie eine Variante erhalten, die ein stabiles, neutrales Flavinradikal ausbildet. / Optogenetics represents the use of genetically encoded photoreceptor proteins to control specific parameters of cells by light. To particularly access optic control of the second messenger cyclic adenosine monophosphate (cAMP) we tested the suitability of four newly identified photoactivated adenylyl cyclases (PAC). Their genes originate from a soil bacterium Beggiatoa sp. and from an amoeboflagellate Naegleria gruberi. They code for 350 to 489 aa small proteins consisting of one blue light sensing BLUF (blue light sensors using FAD) and one adenylyl cyclase domain. Cell based functional assays in E. coli, Xenopus oocytes and CHO cells as well as in vitro analysis of recombinant protein reveal that all four PACs are light activated adenylyl cyclases. Moreover the bacterial PAC (bPAC) has the highest potential for an optogenetic application due to its high activity in light and low activity in the dark. To demonstrate the advantage of bPAC over the established Euglena PACalpha we compared both proteins in Xenopus oocytes, rat neurons and Drosophila fruit flies. It appears that bPAC features a lower activity in the dark, a higher light sensitivity and a broader dynamic range. Therefore bPAC is the superior optogenetic tool for many applications. In an analytical approach we investigated the impact of the BLUF domains on regulation of the cyclase. Removal of the BLUF domains left the bPAC cyclase in an inactive state. Mutating BLUF residues, which are involved either in photochemistry or signal transduction, resulted in a partially active dark state and reduced light activation of bPAC. Thus the integrity of the BLUF domain hydrogen bond network is essential for functional regulation of bPAC. As a result from application oriented optimization a bPAC variant with reduced dark activity as well as a variant that forms a stable neutral flavin radical was obtained.

The soluble form of ADCYs, ADCY10, is ubiquitously expressed in the cytoplasm and distinct organelles including cell nucleus. In contrast to its membrane-associated isoforms (ADCY1-9) which are stimulated by G-protein-coupled receptors, ADCY10 is activated by bicarbonate (HCO3-) and can form cAMP in nearly all cell compartments. ADCY10 is involved in a variety of physiological as well as pathological processes including cell cycle control in tumor cells. However, the underlying mechanism is still unclear. Here the role of ADCY10 in cell cycle control and cell proliferation is studied in endothelial cells from human umbilical veins (HUVECs). The current study reveals that ADCY10 and α-Tubulin translocate and colocalize during mitosis suggesting a role of ADCY10 in cell division. In addition, FACS analysis demonstrated that ADCY10 plays a role in cell proliferation by modulating cell cycle control. Inhibition of ADCY10 by 0 mM HCO3- or 10 μM KH7 (specific ADCY10 inhibitor) induced cell accumulation in G2 phase rather than M phase determined by decreased mitotic indicator cyclin B1 level. Thus, ADCY10 inhibition leads to decreased cell proliferation. The known cAMP effectors, Epac and PKA, were assessed as possible downstream targets of ADCY10 in cell proliferation. It was shown that ADCY10 and Epac induce cell proliferation via ERK1/2-MAPK pathway. Inhibition of Epac was associated with suppressed cell proliferation. However, an arrest of cell cycle after Epac inhibition was observed in G0/G1 phases rather than S or G2/M phases. Thus, Epac inhibition causes a different arrest of cell cycle compared to ADCY10 inhibition. Regarding PKA, it was demonstrated that deficiency of PKA might play a role in either activation or inhibition of cell proliferation. However, direct inhibition of PKA by PKI and H-89 did not lead to cell accumulation in G2. This effect might be associated with broadened roles of PKA in different pathways. In contrast, direct stimulation of PKA under ADCY10 inhibition revealed that PKA is a downstream molecule of ADCY10 as a regulator of cell cycle transition from G2 to mitotic phase. However, the underlying pathway remains to be investigated. The cell cycle transition of G2/M phase is regulated by an auto-amplification loop of cyclin B1/CDK1, which is controlled by the kinase WEE1 and the phosphatase PP2A. WEE1 content was regulated via ADCY10 but was independent of PKA or Epac. Direct inhibition of PP2A showed a suppression of cell proliferation and induced cell cycle arrest in G2. These results were in accordance with those observed after the ADCY10. Furthermore, inhibition of ADCY10 had no effect on PP2A expression level but rather affected PP2A activity and was independent of Epac and PKA. Therefore, this data provides evidence that ADCY10 controls cell proliferation and cell cycle regulation via PP2A. Taken together, ADCY10 coordinates the cell cycle progression in a complex framework. Downstream of ADCY10, Epac promotes G1/S transition, whereas PKA mediates cell cycle transition of G2/M.