A developmentally regulated cyclic AMP-dependent protein kinase has been recently reported in Dictyostelium discoideum. This report describes some of the physical and kinetic properties of the cAMP-dependent holoenzyme and its subunits. Gel filtration data suggests a holoenzyme Mr of 170,000-190,000, and catalytic and regulatory subunit Mrs of 40,000 and 49,000, respectively. These molecular weight determinations are compatible with an R₂C₂ subunit arrangement of the holoenzyme. Kinase activity required the presence of Mg²⁺ but cAMP binding to the enzyme was not dependent on divalent metal ions. The pH optimum for kinase activity was 7.5; the cAMP binding activity was not affected over a pH range of 5.0-10.0. The holoenzyme and isolated regulatory subunit had identical cAMP Kds of 28 nM. Cyclic AMP was able to dissociate the subunits when analyzed by density gradient centrifugation. Histone VII-S activated the subunits in the absence of cAMP but did not produce their dissociation. In contrast to the gel filtration data, sedimentation values indicated a dimeric holoenzyme structure. Reassociation of the subunits in the absence of cAMP occurred rapidly and was not dependent upon a preincubation with MgATP. High NaCl and low pH depressed both the total kinase activity and the ability of the subunits to reassociate as determined by activity ratio. MgATP did not decrease the ability of the holoenzyme to bind cAMP, neither did the holoenzyme possess a high affinity MgATP binding site. By the use of microdissection techniques holoenzyme levels were determined in individuals at each stage of development and in each cell type during development. Kinase activity was low and non-cAMP dependent in early aggregates but increased and became cAMP-dependent in later aggregates. Maximum activity and cAMP-dependency occurred during the slug and culmination stages. The only differential distribution of the kinase within a single-stage occurred during culmination when the activity in the stalks was approximately one-fourth that in the prespore mass. Preliminary evidence indicates that this difference is not due to an inhibitor. / Ph. D. / incomplete_metadata

La progression à travers le cycle cellulaire est assurée par l’activation séquentielle d’une série de complexes cycline-CDK. Les complexes cycline D-CDK4 assurent la progression au cours de la phase G1 du cycle cellulaire en phosphorylant les protéines « antioncogéniques » de la famille Rb. L’activation de la CDK4 nécessite son association à une cycline D et sa phosphorylation sur Thr172 par la CAK nucléaire (CDK activating kinase). Le rôle essentiel des protéines de la famille Cip/Kip dans la régulation de l’activité de ces complexes reste controversé. Les protéines de cette famille (comprenant p27 et p21) ont initialement été identifiées comme des inhibiteurs puissants des complexes cycline-CDK et comme les intermédiaires de l’action antimitogénique de différents signaux intra ou extra-cellulaires. Il a été proposé que la liaison de la p27 ou de la p21 aux complexes cycline D-CDK4 empêche leur phosphorylation activatrice par la CAK et leur activité pRb kinase. Cependant, l’observation que des complexes cycline D-CDK4 associés à p21/p27 possèdent une activité pRb kinase a donné naissance à une seconde hypothèse sur la régulation de ces complexes par la p27 ou la p21. Ces « inhibiteurs » ont été paradoxalement proposés comme facteurs nécessaires et suffisants d’assemblage et de localisation nucléaire des complexes cycline D-CDK4. Dans le modèle physiologiquement relevant des thyrocytes de chien en culture primaire, la mitogénèse dépendante de l’AMPc activée par la TSH diffère des cascades des facteurs de croissance puisqu’elle n’induit pas les cyclines D mais au contraire augmente l’accumulation de l’«inhibiteur» de CDK p27. L’AMPc stimule l’assemblage des complexes cycline D3-CDK4, leur translocation nucléaire et leur association à p27. Dans ce modèle, le TGF&61538; inhibe la mitogénèse dépendante de l’AMPc en inhibant la translocation nucléaire des complexes cycline D3-CDK4 et leur association à la p27.<p><p>Nous avons étudié l’activité catalytique et l’activation des complexes cycline D3-CDK4-p27 issus des thyrocytes de chien en culture primaire ou produits en cellules d’eucaryotes supérieurs (CHO et Sf9). Nous avons pu montrer que les complexes cycline D3-CDK4-p27 issus des thyrocytes de chien stimulés par la TSH présentent une activité pRb-kinase qui est inhibée par le TGF&61538; En outre, la production des complexes cycline D3-CDK4-p27 en cellules CHO ou Sf9 nous a permis de montrer que l’impact de la p27 sur l’activité catalytique des complexes cycline D3-CDK4 dépend de sa stoechiométrie de liaison à ces complexes. L’analyse du profil de séparation par électrophorèse bidimensionnelle de la CDK4 issue de ces trois systèmes montre que la p27 n’empêche pas la phosphorylation activatrice de la CDK4, même aux concentrations de p27 qui empêchent l’activité pRb kinase du complexe cycline D3-CDK4. Nous avons également montré dans les cellules CHO que la p27 détermine la localisation nucléaire des complexes cycline D3-CDK4, ceux-ci étant relocalisés dans le cytoplasme par la transfection d’un mutant de la p27 dépourvu de son signal de localisation nucléaire. Ces résultats valident les observations réalisées par immunofluorescence dans les thyrocytes de chien dans lesquels nous avons mis en évidence une étroite corrélation au niveau des cellules individuelles stimulées par la TSH entre la translocation nucléaire de la CDK4 et l’apparition de la p27 nucléaire. Cette colocalisation est partiellement inhibée par le TGF&61538; Ces observations renforcent l’hypothèse d’un rôle de la p27 dans l’ancrage nucléaire des complexes cycline D3-CDK4. <p><p>Alors que la localisation de la CAK est considérée comme exclusivement nucléaire et son activité catalytique constitutive, nous avons pu montrer que la phosphorylation activatrice de la CDK4 associée à la cycline D3 n’est pas affectée par sa localisation sub-cellulaire et qu’elle est régulée par le TGF&61538; dans les thyrocytes de chien et par le sérum dans les cellules T98G indépendamment de l’association de la CDK4 à la p27. De plus, la phosphorylation de la CDK4 sur Thr172 dans les cellules T98G est stimulée par le sérum, alors que la phosphorylation activatrice de la CDK6, son homologue fonctionnel, ne l’est pas. La comparaison de la séquence de ces deux CDKs à proximité des Thr phosphorylées (Thr177 pour la CDK6) révèle, outre une forte similarité de séquence, une différence au niveau de l’acide aminé situé en aval de la thréonine :il s’agit d’une proline dans la CDK4 et d’une sérine dans la CDK6. La mutation P173S de la CDK4 abolit la phosphorylation sur Thr172 et l’activité de la CDK4 associée à la cycline D3 dans les cellules CHO, mais n’affecte pas la phosphorylation et l’activation de la CDK4 par la CAK recombinante in vitro. L’ensemble de ces résultats suggère que la/les CAKs régulée(s) responsables de l’activation de la CDK4 n’ont pas encore été identifiées et que la proline située en aval de la Thr172 de la CDK4 est essentielle pour sa phosphorylation activatrice et son activité pRb kinase.<p> / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La progression dans le cycle cellulaire est gouvernée par l’activation séquentielle d’une série de complexes cycline/CDK. La CDK4 initie le passage du point de restriction (point R, à partir duquel l’achèvement du cycle cellulaire devient indépendant des facteurs extracellulaires) en phosphorylant les protéines « antioncogéniques » de la famille pRb. Dans les thyrocytes de chien en culture primaire, l’AMPc (TSH ou forskoline) induit la prolifération et la différenciation alors que la voie mitogénique des facteurs de croissance (l’EGF, par exemple) est associée à une dédifférenciation. Dans ce modèle physiologiquement relevant, la stimulation mitogénique par l’AMPc diffère des cascades des facteurs de croissance puisqu'elle n’induit pas les cyclines D mais au contraire augmente l’accumulation de l’inhibiteur de CDK p27 kip1. Le contrôle positif du cycle cellulaire par l’AMPc requiert néanmoins l’activité de la CDK4. L’AMPc stimule l’assemblage des complexes cycline D3-CDK4 ainsi que leur translocation nucléaire associée à leur liaison à p27. Notre but était d’élucider les différents mécanismes menant au passage du point de restriction dans les cellules épithéliales thyroïdiennes stimulées par l’AMPc ou les facteurs de croissance. <p>Dans ce travail, nous montrons que l’arrêt de la stimulation des thyrocytes de chien par l’AMPc entraîne une diminution rapide de la phosphorylation de pRb et de l’activité de la CDK4 sans affecter la formation des complexes cycline D3-CDK4-p27. Par une approche utilisant le haut pouvoir de résolution de l’électrophorèse bidimensionnelle, nous avons identifié la phosphorylation activatrice de la CDK4 comme cible du contrôle par l’AMPc du passage du point de restriction. Ceci constitue un premier exemple d’une régulation de la phosphorylation et de l’activité de la CDK4 indépendante de son association avec une cycline ou un inhibiteur de CDK. Ces résultats contrastent avec l’absence de modulation d’expression, de localisation subcellulaire et d’assemblage des complexes cycline H-CDK7-Mat1, la CAK considérée comme responsable de la phosphorylation activatrice de la CDK4. Ceci suggère que les CAKs régulées activant la CDK4 n’ont pas encore été identifiées.<p>D’autre part, alors que la TSH induit une accumulation de p27, nous montrons à présent que l’expression de la p21 apparentée est augmentée par l’EGF + sérum et réprimée par la TSH. En réponse à l’EGF + sérum ou à la TSH, respectivement, la p21 ou la p27 supportent la localisation nucléaire, la phosphorylation et l’activité de la CDK4. Les « inhibiteurs » de CDK p21 et p27 pourraient donc être utilisés différentiellement comme régulateurs positifs de la CDK4 lors des stimulations des cellules épithéliales thyroïdiennes de chien par la TSH (p27) ou par l’EGF + sérum (p21). <p>Nous avons également montré que les complexes cycline D1-CDK4 et cycline D3-CDK4 phosphorylent pRb sur des sites partiellement différents. Cette nouvelle observation a été reproduite pour des complexes cycline D-CDK4 surexprimés en cellules CHO ainsi que pour des complexes exprimés de manière endogène dans différents types cellulaires. Cette différence de spécificité de substrat entre la cycline D1 et la cycline D3 conduit à différents profils de phosphorylation de pRb dans les thyrocytes de chien stimulés par la TSH ou les facteurs de croissance, ce qui est dû à l’utilisation préférentielle de la cycline D3 dans les thyrocytes stimulés par la TSH alors que les facteurs de croissance induisent surtout la cycline D1. Comme différentes fonctions de pRb sont régulées par phosphorylation sur différents résidus, ce résultat indique que les complexes cycline D1-CDK et cycline D3-CDK pourraient affecter de manière partiellement différente la fonction de cette protéine. <p>Enfin, nous avons comparé les stimulations mitogéniques par la TSH ou l’EGF + sérum dans les thyrocytes humains normaux en culture primaire. En accord avec leurs modulations différentes, la cycline D3 et la cycline D1 sont utilisées différentiellement dans les voies mitogéniques stimulées par la TSH ou l’EGF + sérum respectivement. De plus, ce système nous a permis de confirmer la régulation de l’activité de la CDK4 au niveau de sa phosphorylation activatrice comme mécanisme déterminant de la réponse mitogénique.<p><p> / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Wong Cheuk Ying. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2006. / Includes bibliographical references (leaves 101-124). / Abstracts in English and Chinese. / Abstract --- p.i / 摘要 --- p.iv / Acknowledgement --- p.vi / List of Abbreviations --- p.vii / Chapter Chapter 1. --- General Introduction --- p.1 / Chapter Chapter 2. --- Methods --- p.4 / Chapter 2.1 --- Measurement of cAMP and cGMP in VSMCs --- p.4 / Chapter 2.1.1 --- Cell culture --- p.4 / Chapter 2.1.2 --- Enzyme-immunoassay colorimetric measurement for cAMP and cGMP --- p.5 / Chapter 2.1.3 --- Statistical analysis --- p.6 / Chapter 2.2 --- Measurement of apoptosis in VSMCs and bone marrow-derived stem cells --- p.6 / Chapter 2.2.1 --- Cell culture --- p.6 / Chapter 2.2.2 --- Hoechst33258 --- p.7 / Chapter 2.2.3 --- Cell Death ELISA plus --- p.7 / Chapter 2.2.4 --- Protein extraction and Western blot analysis of PKG expression --- p.8 / Chapter 2.2.5 --- Statistical analysis --- p.9 / Chapter 2.3 --- Measurement of cell proliferation in VSMCs and bone marrow-derived stem cells --- p.9 / Chapter 2.3.1 --- Cell culture --- p.9 / Chapter 2.3.2 --- Cell count --- p.10 / Chapter 2.3.3 --- MTT assay --- p.11 / Chapter 2.3.4 --- BrdU-(5`Bromo-2-deoxyuridine) ELISA colorimetric assay --- p.11 / Chapter 2.3.5 --- Statistical analysis --- p.12 / Chapter Chapter 3. --- Effects of hyperglycemia on CGRP-induced cAMP response in VSMCs / Chapter 3.1 --- Introduction --- p.13 / Chapter 3.2 --- Results --- p.18 / Chapter 3.3 --- Discussion --- p.22 / Chapter Chapter 4. --- Role of cGMP and protein kinase G in regulation of apoptosis in VSMCs / Chapter 4.1 --- Introduction --- p.26 / Chapter 4.2 --- Results --- p.30 / Chapter 4.3 --- Discussion --- p.44 / Chapter Chapter 5. --- Role of protein kinase G in regulation of proliferation in VSMCs / Chapter 5.1 --- Introduction --- p.55 / Chapter 5.2 --- Results --- p.58 / Chapter 5.3 --- Discussion --- p.67 / Chapter Chapter 6. --- Effects of aging and eNOS- and iNOS-gene deletion (using eNOS- and iNOS-knockout mice) on apoptosis of VSMCs / Chapter 6.1 --- Introduction --- p.73 / Chapter 6.2 --- Results --- p.76 / Chapter 6.3 --- Discussion --- p.79 / Chapter Chapter 7. --- Role of protein kinase G in regulation of apoptosis and proliferation of bone marrow stromal stem cells / Chapter 7.1 --- Introduction --- p.81 / Chapter 7.2 --- Results --- p.84 / Chapter 7.3 --- Discussion --- p.92 / Chapter Chapter 8. --- Overall discussion --- p.95 / Chapter Chapter 9. --- References --- p.101