Thèse de doctorat : Biophysique moléculaire : Orléans : 2009. / Titre provenant de l'écran-titre.

Thèse de doctorat : Sciences de la vie : Lyon, École normale supérieure (sciences) : 2006. / Bibliogr. p. 206-235.

L'ADN topoisomérase II (TOP2) joue un rôle critique dans les processus métaboliques de l'ADN. Elle catalyse le passage d'un segment d'ADN intact à travers un second via une cassure double brin transitoire. L'objectif de cette étude in vitro était de déterminer le rôle des distorsions de structure et . de la torsion superhélicoïdale comme déterminants potentiels des clivages induits par les TOP2a humaine (hTOP2a) et TOP2 de drosophile (DmTOP2). Nous avons utilisé un plasmide (pBS-SAR) contenant un segment de SAR du gène interféron-~ 1 humain comme substrat. La spécificité des sites de clivage induits par les TOP2 a été analysée par extension-ligation-mediated-PCR (ELMPCR). Cette technique détecte des cassures d'ADN dépourvues d'extrémité 5' -phosphate, telles que les extrémités bloquées produites par les TOP2. Des cinétiques de relaxation ont révélé que la hTOP2a était au moins 10 fois plus active sur le SAR que sur l'ADN plasmidique. Nous avons montré qu'en présence d'étoposide et d'un rapport enzyme:DNA bas, la hTOP2a induit deux clivages forts dans le plasmide surenroulé mais aucun dans le plasmide relaxé. Ceux-ci ont été localisés en bordure de zones dont l'hypersensibilité à la bléomycine et la nucléase SIest accentuée par la torsion, suggérant que la reconnaissance d'une altération de structure induite par superhélicité est requise pour un clivage TOP2 efficace, dans ces conditions. Avec un rapport enzyme:ADN élevé, les patrons de clivage du pBS-SAR surenroulé par hTOP2a et DmTOP2 étaient similaires. Par contre, la reconnaissance de particularités intrinsèques à la structure de l'ADN linéaire semble suffire au clivage induit par hTOP2a mais non DmTOP2. En absence d'étoposide, et en présence d'ATPyS substituant l'ATP, la DmTOP2 et la hTOP2a clivent l'ADN dans les zones du SAR qui sont intrinsèquement hypersensibles à la nucléase SI et au KMn04, à des sites distincts des principaux clivages induits par étoposide. En conclusion, nos résultats supportent un modèle dans lequel des distorsions intrinsèques à la structure primaire du SAR, qui peuvent être accentuées par des altérations de structure induites par torsion superhélicoïdale, conjointement avec les interactions drogue-enzyme, agissent comme signaux de reconnaissance des sites de clivage des TOP2, et possiblement comme catalyseurs de la réaction de clivage.

Thèses (Ph.D.)--Université de Sherbrooke (Canada), 1998. / Titre de l'écran-titre (visionné le 20 juin 2006). Publié aussi en version papier.

Thèses (M.Sc.)--Université de Sherbrooke (Canada), 1998. / Titre de l'écran-titre (visionné le 20 juillet 2006). Publié aussi en version papier.

Thèses (M.Sc.)--Université de Sherbrooke (Canada), 2001. / Titre de l'écran-titre (visionné le 20 juin 2006). Publié aussi en version papier.

El 1 ,3-dinitronaftaleno, previamente identificado en polvo ambiental, forma aductos covalentes con nucleótidos del DNA a temperatura ambiente fácilmente. La potencia mutagénica de un hidrocarburo aromático policíclico dinitrado (HAPDN), el 1, 3-dinitrofluoranteno, es prácticamente independiente de la cepa de Salmonella Typhimurium (TA98, TA98NR y TA98/1, 8DNP6) empleada en el Test de Ames. Este comportamiento poco usual sugiere que este HAPDN no requeriría de la activación metabólica vía la "nitroreductasa clásica" y/o de la acetilasa El hecho de que el 1, 3- dinitronaftaleno forma aductos covalentes con nucleótidos del DNA rápidamente está de acuerdo con que HAPDN meta disubstituídos podrían prescindir de las rutas usuales de activación metabólica. / 1,3-Dinitronaphthalene, previous1y identified in particulate organic matter, easily forms covalent adducts with DNA nucleotides at room temperature. The mutagenic potency of a related dinitropolycyclic aromatic hydrocarbon (dinitroPAH) with meta disubstitution, namely 1,3-dinitrofluoranthene, is rather independent of the Salmonella Typhimurium tester strain (TA98, TA98NR and TA98/l, 8DNP6) when assayed according to the Ames Test. This unusual behavior suggests that it does not require metabolic activation via the "classical nitroreductase" and/or the acetylase. The fact that 1,3--dinitronaphthalene readily forms covalent adducts with DNA nucleotides further suggests that dinitroPAH with meta nitro-groups may not require the usual metabolic activation pathways.

Cette thèse de doctorat présente 3 études reliées à l’hybridation d’ADN fixée à un support solide et les phénomènes qui y sont associés. L’hybridation d’ADN en phase aqueuse est bien caractérisée, cependant plusieurs phénomènes et paramètres restent encore à déterminer lorsqu’un des brins est fixé sur un support solide. Un de ces paramètres est l’influence du brin complémentaire en fonction de la longueur de l’extrémité d’ADN cible immobilisée exposée à la phase aqueuse. Pour mieux comprendre ce phénomène, nous avons établi une méthode pour digérer spécifiquement le brin d’ADN complémentaire pour simplifier l’hybridation sur support solide. La combinaison d’une molécule favorisant la digestion du brin complémentaire et d’une molécule bloquant la digestion du brin cible a permis de produire un ADN cible simple brin à l’aide de l’exonucléase Lambda, permettant d’obtenir des signaux d’hybridation supérieurs à ceux obtenus avec des ADN doubles brins. Ensuite, l’observation en temps réel de l’hybridation d’amplicons simples brins et doubles brins a permis de mieux comprendre les phénomènes de compétition entre le brin complémentaire et la cible. Finalement, les conclusions des deux premières études nous ont permis d’inventer une technologie tirant profit de la compétition entre le brin complémentaire et la sonde de capture et de l’activité exonucléase pour réaliser l’amplification PCR et l’hybridation sur biopuce en un seul site réactionnel et dans un seul tampon réactionnel. La combinaison de ces techniques aura pour effet une simplification des dispositifs et une diminution du nombre de réactifs permettant la fabrication de tests diagnostiques automatisés à moindre coûts. Les travaux de cette thèse ont permis d’approfondir nos connaissances sur les phénomènes reliés à l’hybridation sur support solide et de concevoir une technologie faisant l’objet d’une demande de brevet. La suite logique de ces travaux serait de poursuivre le développement et l’optimisation de la technologie pour augmenter ses capacités de multiplexage tout en l’intégrant à un dispositif microfluidique et à un instrument de détection qui combine amplification PCR et hybridation sur biopuce dans une seule réaction réalisée en une seule étape. / This thesis presents three studies related to the phenomenon related to DNA hybridization onto capture probes attached to solid support. The work was carried out in the context of infectious diseases detection, but the conclusions are of interest to any test based on the recognition of genetic material by solid support immobilized capture probes. DNA hybridization in aqueous phase is well characterised, however several parameters and phenomena related to hybridization onto solid supports are still to be determined. One of these parameters is the influence of the complementary strand in relation with the length of the solvent-exposed immobilized target strand. To better understand this phenomenon, we established a method to specifically digest the complementary DNA strands to simplify hybridization onto solid support. The presence of a molecule favorising digestion on the complementary strand and a blocking molecule on the target strand enabled selective digestion of the complementary strand using Lambda exonuclease in PCR buffer. Hybridization of single-stranded target DNA generated this way resulted in significantly higher fluorescence signals than those obtained with double stranded hybridization. Afterwards, observation of real-time hybridization of single-stranded amplicons and double-stranded amplicons to capture probes fixed onto solid support allowed for a better understanding of the competition phenomena between the complementary strand and the capture probe. Finally, the knowledge gained with the first two studies was used to invent a technology taking advantage of the competition between the complementary strand and the capture probe and exonuclease activity to perform single vessel and single buffer PCR amplification and microarray hybridization. The combination of these techniques will simplify devices and require fewer reagents storage and handling, facilitating production of automated diagnostic tests at lower costs. The works of this thesis have expended our understanding of the phenomena associated with hybridization onto a solid support and also resulted in the creation of a new technology covered by a patent application. The logical progression of this work is to further develop and optimize this technology by integrating it into a microfluidic device and an instrument compatible with the detection of microarrays to increase the multiplexing capabilities of molecular diagnostics.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2003. / Bibliogr.: f. 86-90. Publié aussi en version électronique.

Le cancer est une maladie majeure ayant un taux de mortalité élevé dans le monde et au Canada. C'est pourquoi notre équipe de recherche développe de nouvelles classes d'agents anticancéreux, notamment les phényl 4-(2-oxoimidazolidin-1-yl)benzènesulfonates (PIB-SOs) et les N-phényl ureidobenzènesulfonates (PUB-SOs). Les PIB-SOs et les PUB-SOs sont constitués de deux cycles aromatiques identifiés A et B reliés entre eux par un pont sulfonate. Les PIB-SOs sont principalement caractérisés par un groupement imidazolidin-2-one sur le cycle aromatique A alors que les PUB-SOs possèdent un groupement 2-chloroéthylurée ou éthylurée sur ce cycle. D'un côté, les PIB-SOs montrent une activité antiproliférative sur des cellules cancéreuses de l'ordre du nanomolaire, arrêtent le cycle cellulaire en phase G2/M et ciblent les microtubules dans le site de liaison de la colchicine (C-BS). D'un autre côté, les PUB-SOs ont une activité antiproliférative de l'ordre du bas micromolaire sur des lignées cellulaires cancéreuses. Selon leur structure, ils peuvent soit arrêter le cycle cellulaire en phase G2/M et cibler le C-BS des microtubules lorsqu'ils sont substitués en position 3, 4 et/ou 5 sur le cycle aromatique B ou soit arrêter le cycle cellulaire en phase S et cibler les mécanismes de réparation et de réplication de l'ADN lorsque le cycle aromatique B est substitué en position 2 par des halogènes ou de courtes chaînes alkyles. Les travaux de mon doctorat avaient pour objectif général d'optimiser les propriétés physicochimiques, pharmacologiques et pharmacocinétiques des PIB-SOs et des PUB-SOs. À cet effet, 187 nouveaux dérivés et analogues des PIB-SOs et des PUB-SOs ont été préparés, purifiés, caractérisés et évalués biologiquement. Les nouveaux dérivés et analogues des PIB-SOs sont divisés en neuf familles principales caractérisées par la substitution du groupement imidazolidin-2-one par un groupement lactame, imidazolidin-2,4-dione, imidazolidin-2,5-dione, éthyl 2-uréidoacétate, butyramide, éthylurée, 2-chloroéthylurée, éthylthiourée ou phénylurée. L'activité antiproliférative des familles peuvent être divisée en trois catégories : (1) très active (ordre du nanomolaire), (2) modérément active (ordre du micromolaire) et (3) peu ou non active (supérieure à 100 μM). Les familles de composés possédant le groupement lactame, imidazolidin-2,4-dione ou imidazolidin-2-one intègrent la catégorie très active. Les familles de composés ayant les groupements butyramide, éthylurée, 2-chloroéthylurée, éthylthiourée ou phénylurée sont dans la catégorie modérément active et finalement, ceux portant les groupements imidazolidin-2,5-dione ou éthyl 2-uréidoacétate sont dans la catégorie peu ou non active. Les composés les plus puissants des familles très actives et modérément actives arrêtent la progression du cycle cellulaire en phase G2/M, inhibent la polymérisation des microtubules et perturbent le cytosquelette en se liant au C-BS. Ils sont aussi actifs sur des lignées cellulaires résistantes au paclitaxel, à la vinblastine et sur une lignée cellulaire surexprimant la glycoprotéine P. Ils ne sont pas ou seulement faiblement toxiques sur le modèle d'embryons de poulet et ils montrent des propriétés physicochimiques et pharmacocinétiques théoriques prometteuses en plus de respecter les filtres de biodisponibilité per os. Les dérivés et analogues des PUB-SOs sont divisés en deux familles principales en remplaçant le groupement 2-chloroéthylurée soit par différents groupements amides ou soit par différents groupements urées. L'activité antiproliférative de ces nouveaux dérivés et analogues des PUB-SOs est généralement plus puissante avec les groupements urées qu'avec les groupements amides et elle se situe entre la centaine de nanomolaire et le bas micromolaire. Les relations structure-activité des composés les plus puissants montrent que l'arrêt de la progression du cycle cellulaire en phase S survient seulement lorsque le cycle aromatique B est substitué en position 2 par des halogènes ou de courtes chaînes alkyles ; les composés ayant un autre patron de substitution sur le cycle aromatique B arrêtent la progression du cycle cellulaire en phase G2/M et perturbent les microtubules. Les composés les plus puissants arrêtant le cycle cellulaire en phase S induisent la phosphorylation de l'histone 2AX, un marqueur de stress réplicatifs. Des essais de cinétique d'alkylation démontrent que leur activité biologique n'est pas causée par leur potentiel alkylant. Les nouveaux analogues ne sont pas ou seulement faiblement toxiques sur le modèle d'embryons de poulet et ont également des propriétés physicochimiques et pharmacocinétiques théoriques prometteuses tout en respectant les filtres biodisponibilité per os. Les dérivés et analogues des PIB-SOs et des PUB-SOs composent donc de nouvelles familles d'agents anticancéreux prometteurs pour des études précliniques plus poussées. / Cancer is a major disease leading to a high mortality rate worldwide and in Canada. As a result, our research team develops new anticancer agent classes notably phenyl 4-(2-oxoimidazolidin-1-yl)benzenesulfonates (PIB-SOs) and phenyl ureidobenzenesulfonates (PUB-SOs). PIB-SOs and PUB-SOs consist of two aromatic rings named A and B connected together by a sulfonate bridge. PIB-SOs are mainly characterized by an imidazolidin-2-one moiety on the aromatic ring A while PUB-SOs bear a 2-chloroethylurea or an ethylurea on this ring. On the one hand, PIB-SOs show antiproliferative activity in the nanomolar range towards cancer cells, block cell cycle progression in G2/M phase and target microtubules in the colchicine-binding site (C-BS). On the other hand, PUB-SOs exhibit antiproliferative activity in the low micromolar on cancer cell lines. Depending on their structures, they either stop the cell cycle progression in the G2/M phase and target the C-BS of microtubules when they bear substituents at position 3, 4 and/or 5 on the aromatic ring B or they arrest the cell cycle progression in the S phase and target the DNA repair and replication mechanisms when they bear halogens or short alkyl chains at position 2 on the aromatic ring B. The general objective of my doctoral work was to optimize the physicochemical, pharmacological and pharmacokinetic properties of PIB-SOs and PUB-SOs. To this end, 187 new derivatives and analogues of PIB-SOs and PUB-SOs were prepared, purified, characterized and biologically evaluated. New PIB-SOs are divided into nine families of compounds characterized by the replacement of the imidazolidin-2-one moiety by lactam, imidazolidin-2,4-dione, imidazolidin-2,5-dione, ethyl 2-ureidoacetate, butyramide, ethylurea, 2-chloroethylurea, thioethylurea or phenylurea group. The antiproliferative activity of these families can be divided into 3 categories: (1) very active (nanomolar range), (2) moderately active (micromolar range) and (3) weakly or not active (over 100 μM). Families of compounds having a lactam, an imidazolidin-2,4-dione or an imidazolidin-2-one are in the very active category. Families bearing a butyramide, an ethylurea, a 2-chloroethylurea, a thioethylurea or a phenylurea group are in the moderately active category while those bearing an imidazolidin-2,5-dione or an ethyl 2-ureidoacetate are in the weakly or not active category. The most potent compounds of the most and moderately active families arrest the cell cycle progression in G2/M phase, inhibit microtubule polymerization and disrupt the cytoskeleton by binding to the C-BS. They are also active in paclitaxel- and vinblastine-resistant cell lines and on a cell line overexpressing the P-glycoprotein. Moreover, they are not or only weakly toxic on the chick embryos model and they exhibit promising theoretical physicochemical and pharmacokinetic properties in addition to respecting oral bioavailability filters. Derivatives and analogues of PUB-SOs are divided into two main families by replacing the 2-chloroethylurea moiety either by various amide groups or by different urea moieties. The antiproliferative activity of these new derivatives and analogues of PUB-SOs is generally more potent when they are substituted with a urea group than by an amide group and is between the hundred nanomolar to low micromolar. The structure-activity relationships with the most potent derivatives show that the arrest of the cell cycle progression in S phase occurs only when the aromatic ring B is substituted at position 2 by halogens or short alkyl chains; compounds bearing other substitution patterns on the aromatic ring B arrest the cell cycle progression in G2/M phase and disrupt microtubules. Moreover, the most potent compounds blocking the cell cycle progression in S phase induce the phosphorylation of the histone 2AX, a marker of the replicative stress. Alkylation kinetic assays show that their biological activity is not related to their alkylating potency. Moreover, they are not or only weakly toxic on the chick embryos model and they exhibit promising theoretical physicochemical and pharmacokinetic properties in addition to complying oral bioavailability filters. The derivatives and analogues of PIB-SOs and PUB-SO constitute new families of anticancer agents promising for further preclinical studies.