Einleitung: / Introduction:

In the heart the β\(_1\)-adrenergic receptor (AR) and the β\(_2\)-AR, two prototypical G protein-coupled receptors (GPCRs), are both activated by the same hormones, namely adrenaline and noradrenaline. Both receptors couple to stimulatory G\(_s\) proteins, mediate an increase in cyclic adenosine monophosphate (cAMP) and influence the contractility and frequency of the heart upon stimulation. However, activation of the β\(_1\)-AR, not the β\(_2\)-AR, lead to other additional effects, such as changes in gene transcription resulting in cardiac hypertrophy, leading to speculations on how distinct effects can arise from receptors coupled to the same downstream signaling pathway. In this thesis the question of whether this distinct behavior may originate from a differential localization of these two receptors in adult cardiomyocytes is addressed. Therefore, fluorescence spectroscopy tools are developed and implemented in order to elucidate the presence and dynamics of these endogenous receptors at the outer plasma membrane as well as on the T-tubular network of intact adult cardiomyocytes. This allows the visualization of confined localization and diffusion of the β\(_2\)-AR to the T-tubular network at endogenous expression. In contrast, the β\(_1\)-AR is found diffusing at both the outer plasma membrane and the T-tubules. Upon overexpression of the β\(_2\)-AR in adult transgenic cardiomyocytes, the receptors experience a loss of this compartmentalization and are also found at the cell surface. These data suggest that distinct signaling and functional effects can be controlled by specific cell surface targeting of the receptor subtypes. The tools at the basis of this thesis work are a fluorescent adrenergic antagonist in combination of fluorescence fluctuation spectroscopy to monitor the localization and dynamics of the lowly expressed adrenergic receptors. Along the way to optimizing these approaches, I worked on combining widefield and confocal imaging in one setup, as well as implementing a stable autofocus mechanism using electrically tunable lenses. / Im Herzen werden der β\(_1\)-adrenerge Rezeptor (AR) und der β\(_2\)-AR, zwei prototypische GPCR, durch die Hormone Adrenalin und Noradrenalin aktiviert. Dabei interagieren beide Rezeptoren mit dem stimulatorischen G\(_s\) Protein, bewirken eine Erhöhung des cyclischen Adenosinmonophosphates (cAMP) und beeinflussen die Kontraktionskraft und Frequenz des Herzens nach einem Stimulus. Jedoch hat die Aktivierung des β\(_1\)-ARs, nicht des β\(_2\)-ARs, auch weitere Effekte, wie z.B. Veränderungen in der Transkription von Genen. Dies wiederum führt zu Spekulationen, wie solch unterschiedliche Effekte von Rezeptoren hervorgerufen werden können, die gleiche Signalwege bedienen. In dieser Arbeit wird untersucht, ob dieses unterschiedliche Verhalten durch eine ungleiche Verteilung dieser beiden Rezeptoren in adulten Kardiomyozyten hervorgerufen werden könnte. Dazu wird die Lokalisation und die Dynamik dieser endogenen Rezeptoren in der Plasmamembran sowie im T-tubulären Netzwerk von intakten adulten Kardiomyozyten, unter Entwicklung und Verwendung hochsensitiver Fluoreszenzspektroskopiemethoden, bestimmt. Dies ermöglicht die örtliche und dynamische Eingrenzung des β\(_2\)-adrenergen Rezeptors unter endogener Expression ausschließlich auf das T-tubuläre Netzwerk. Dementgegen stellt sich heraus, dass sich der β\(_1\)-adrenerge Rezeptor ubiquitär auf der äußeren Membran und den T-Tubuli befindet und diffundiert. In β\(_2\)-AR überexprimierenden transgenen Kardiomyozyten hingegen werden diese Kompartments nicht beibehalten und es findet eine Umverteilung der Rezeptoren, auch unter Einbezug der Zelloberfläche, statt. Diese Daten können stärker darauf hindeuten, dass einige Rezeptorsubtypen sich gezielt und spezifisch bestimmte Zelloberflächen aussuchen, um somit ihre verschiedenen Signale und funktionären Effekte erzeugen zu können. Zu den Techniken, die in dieser Arbeit die Bestimmung der Lokalisation und der Dynamiken der niedrig exprimierten adrenergen Rezeptoren zulassen, gehört die Anwendung von Fluoreszenzspektroskopiemethoden in Kombination mit einem fluoreszierenden β-adrenergen Antagonisten. Weitere Techniken, die im Rahmen dieser Arbeit entwickelt wurden und in weiterführenden Studien aufschlussreiche Erkenntnisse liefern könnten, umfassen die Entwicklung eines Setups aus einer Kombination aus Weitfeld- und Konfokalmikroskopie und die Implementierung eines stabilen Autofokus mit Hilfe einer elektrisch veränderbaren Linse.

Einleitung: / Introduction:

Einleitung: Equines Asthma ist eine herausfordernde Erkrankung der Pferde. Gekennzeichnet ist sie durch verengte Atemwege mit massiver Schleimansammlung mit einhergehender Leistungsinsuffizienz des Pferdes. Eines der Therapieziele ist der β2-Adrenozeptor (β2AR) in den Atemwegen, der nach Aktivierung durch β-selektive Pharmaka zur Bronchienerweiterung und verbesserten Ventilation der Lunge führt. Eine Langzeitapplikation dieser Therapeutika führt jedoch zur Downregulation der Rezeptoranzahl mit korrespondierender Abschwächung des Therapieerfolges, wobei es Unterschiede im Ausmaß dieses Effektes zwischen den Pharmaka zu geben scheint. Der genaue Mechanismus dahinter ist nicht geklärt. Ziel der Untersuchung: Die vorliegende Arbeit entwickelt zwei neue In-vitro-Zellsysteme, in denen der equine β2AR stabil transfiziert wird und dessen Genexpression (ADRB2) durch Doxycyclin steuerbar ist. Nach Etablierung der reproduzierbaren Anwendbarkeit wird eines der Systeme unter Zugabe von β-selektiven Agonisten genutzt, um den Einfluss der Pharmaka auf die Rezeptor-Signalkaskade und Downregulation zeit- und dosisabhängig zu bestimmen. Material und Methoden: ADRB2 wurde in den Vektor pSBtet_GP kloniert und HEK293T- und COS-7-Zellen mit dem Konstrukt stabil transfiziert. Zur Bestimmung der Parameter für eine adäquate Genexpression wurden die Zellen mit verschiedenen Doxycyclin-Konzentrationen und Inkubationszeiten induziert und die Rezeptor-mRNA-Bildung, -anzahl und -funktion mittels qPCR, Iodocyanopindolol (ICYP)-Bindungsstudien und AlphaScreen cAMP-Assay bestimmt. Anschließend wurden dem HEK-Zellsystem Agonisten (Isoproterenol, Epinephrin, Norepinephrin, Clenbuterol, Salbutamol, Salmeterol), ebenfalls in zeit- und konzentrationsabhängigen Versuchen, zugegeben. Die Entwicklung der Rezeptor-mRNA und -anzahl wurde mittels qPCR und ICYP-Bindungsstudien verfolgt. Zusätzliche Verdrängungsexperimente wurden zur Affinitätsbestimmung einiger Agonisten zum equinen β2AR genutzt. Der Einfluss von Zeit und Dosis von Doxycyclin wurde mittels Two-way-ANOVA mit Bonferroni-Korrektion ermittelt, wobei das Signifikanzniveau bei p < 0,05 festgelegt wurde. Ergebnisse: Die Bildung von Rezeptor-mRNA konnte über alle Doxycyclin-Konzentrationen hinweg mit einer 48-stündigen Inkubation am besten generiert werden, weshalb weitere Experimente mit dieser Induktionsdauer durchgeführt wurden. qPCR und ICYP-Bindungsstudien zeigten eine maximale mRNA- und Rezeptorproteinbildung bei 8,0 µg/ml Doxycyclin, wohingegen die Rezeptorfunktion in Form von Bildung des second messengers cAMP bei niedrigeren Doxycyclin-Konzentrationen (COS: 2,0 µg/ml; HEK: 0,5 µg/ml) gegeben war. Daher entschieden wir uns für eine Induktion mit 1,0 µg/ml Doxycyclin für 48 Stunden, welche dann als Startpunkt für die anschließende 72-stündige Agonistenzugabe genutzt wurde. Alle Agonisten induzierten nach 8-stündiger Inkubation eine gesteigerte Rezeptor-Genexpression, die jedoch meist nach 24 Stunden unter das Startniveau sank und dort auf einem niedrigen Level bis zum Betrachtungsende verblieb. Korrespondierend dazu stieg zeitversetzt die durch ICYP-Bindungsstudien bestimmte Rezeptoranzahl bis 48 Stunden an, zeigte danach unter Salmeterol und Salbutamol, jedoch nicht unter Clenbuterol, eine leichte Abnahme, ohne unter das Ausgangsniveau zu sinken. Die Affinität der Agonisten zum equinen β2AR zeigte folgende Reihenfolge: Salmeterol > Clenbuterol > Isoproterenol > Salbutamol. Schlussfolgerungen: Beide Zellmodelle eignen sich zur weiteren Erforschung der Rezeptorregulation des equinen β2AR mit den ermittelten Parametern für eine stabile Genexpression. Im HEK-System konnte erstmalig nach Agonisten-Zugabe gezeigt werden, dass es einen pharmakainduzierten Zusammenhang zwischen Rezeptor-mRNA-Bildung und dichte gibt, bevor die downregulierenden Prozesse unter Dauertherapie die Überhand bekommen. Salmeterol zeigte dabei schon in geringen Konzentrationen Effekte. Clenbuterol regulierte in unserem Modell jedoch die Rezeptoranzahl nach 72-stündiger Agonisten-Zugabe nicht herunter, was im Kontrast zu bisherigen Ergebnissen steht und zelltypabhängig zu sein scheint.