Hintergrund: Der Phospholipase A2 Rezeptor 1 (PLA2R1) ist ein Typ 1 Transmembranrezeptor, welcher der Mannose-Rezeptor-Familie zugeordnet werden kann. Die Bedeutung von PLA2R1 für physiologische und pathologische Vorgänge ist noch weitestgehend unbekannt. Jedoch wird die Regulation wichtiger zellulärer Prozesse, wie Proliferation, Apoptose/ Seneszenz, Adhäsion, Migration/ Invasion und Inflammation im Zusammenhang mit dem Rezeptor diskutiert. Darüber hinaus ist eine Änderung der PLA2R1-Expression bei der Entstehung verschiedenster Krebserkrankung nachweisbar. Hierbei wird der Rezeptor einerseits mit einer pro-onkogenen und pro-migratorischen Wirkung in Verbindung gebracht. Andererseits ist ein tumorsuppressiver Effekt von PLA2R1 und eine Induktion der mitochondrialen Apoptose in Tumorzellen beschrieben. Zudem ist die Expression von PLA2R1 durch epigenetische Mechanismen kontrolliert und eine Promotor-Hypermethylierung ist assoziiert mit einer Repression der Rezeptor-Expression in der Prostatakarzinom (PCa)-Zelllinie LNCaP und der pädiatrischen, akuten lymphoblastischen Leukämie (ALL)-Zelllinie Jurkat. Vorangegangene Arbeiten zeigten eine Hypermethylierung innerhalb eines definierten Bereiches des PLA2R1-Promotors bei adulten Patienten mit akuter myeloischer Leukämie und Myelodysplastischem Syndrom (MDS) sowie eine Korrelation der PLA2R1-Promotormethylierung mit dem Krankheitsstadium und der Klassifizierung nach dem Internationalen Prognostischen Scoring System (IPSS). Fragestellung/ Hypothese: Das Ziel der vorliegenden Arbeit war einerseits die Untersuchung der Funktion von PLA2R1 in den PCa-Zelllinien LNCaP und PC-3. Während in LNCaP die Rezeptor-Expression durch Promotor-Hypermethylierung unterdrückt ist, kann in PC-3-Zellen eine Hochregulation von PLA2R1 im Vergleich zu normalen Prostataepithelzellen nachgewiesen werden. Durch in vitro Transfektionsexperimente sollte der Effekt einer Re-expression von PLA2R1 in LNCaP-Zellen sowie die Auswirkungen einer Reduktion der PLA2R1-Expression in PC-3-Zellen untersucht werden. Der Einfluss der veränderten PLA2R1-Expressionslevel auf wichtige Zellparameter wurde evaluiert. Die in vitro Daten der PCa-Zelllinien wurden mit den in vivo Ergebnissen des Tumorwachstums von transfizierten LNCaP- und PC-3-Zellen in Xenograft-Mausmodellen verglichen. Andererseits sollte basierend auf den Ergebnissen von adulten Patienten mit AML- und MDS-Diagnose und der dabei festgestellten Hypermethylierung des Rezeptor-Promotors der Methylierungsstatus des Rezeptors bei der pädiatrischen ALL untersucht werden. Überdies sollte die Eignung der PLA2R1-Methylierungsanalyse als sensitiver Biomarker für die Therapiekontrolle, Überwachung der minimalen Resterkrankung (MRD) und Risikostratifizierung der pädiatrischen ALL evaluiert werden. Die Funktion des Rezeptors im Kontext der pädiatrischen ALL wurde durch eine transfektionsbasierte Re-expression von PLA2R1 in der Jurkat-ALL-Zelllinie untersucht. Durch in vitro Experimente wurden die Auswirkungen der verschiedenen PLA2R1-Expressionslevel auf Proliferation und Apoptose/ Nekrose in transfizierten Jurkat-Zellen analysiert. Material und Methoden: Durch Transfektion mit einem PLA2R1-Expressionsvektor konnte eine stabile Überexpression des Rezeptors in LNCaP- (LNCaP-PLA2R1) und Jurkat-Zellen (Jurkat-PLA2R1) erreicht und die Ergebnisse mit Kontrollvektor-transfizierten LNCaP- (LNCaP-Ctrl) und Jurkat-Zellen (Jurkat-Ctrl) verglichen werden. Mittels CRISPR/Cas9-Knockdown konnte eine Verminderung der PLA2R1-Expression in PC-3-Zellen (PC-3-KD) im Vergleich zu Kontrollvektor-transfizierten PC-3-Zellen (PC-3-Ctrl) erreicht werden. Genexpressionsanalysen wurden mittels quantitativer PCR nach reverser Transkription (RT-qPCR) durchgeführt und die Proteinsynthese des Rezeptors durch Western Blot Analyse überprüft. In vitro sollten die Auswirkungen der differenziellen PLA2R1-Expression der transfizierten Zellen auf wichtige proliferative und metastatische Zellparameter untersucht werden. Die Zellviabilität/ Proliferation wurde mittels WST-1 Assay für adhärente Zellen und Zellwachstumskurven-Analyse mit Trypanblau-Färbung bei Suspensionszellen analysiert. Zellmotilität und Proliferation wurden bei transfizierten PCa-Zelllinien mithilfe des Wundheilungsassays beurteilt. Apoptose konnte durch Wasserstoffperoxid stimuliert und mittels Caspase-Glo® 3/7 Assay und RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay für transfizierte PCa-Zelllinien sowie durchflusszytometrische Analysen nach Annexin-V-FLUOS/ Hoechst 33258 Färbung für transfizierte Jurkat-Zellen untersucht werden. Die klonogene Überlebensrate und das Koloniewachstum der transfizierten PCa-Zelllinien sollten mithilfe des klonogenen Assays analysiert werden. In einer in vivo Pilotstudie wurde der Effekt von PLA2R1 auf das Tumorwachstum mittels Xenograft-Mausmodellen (männliche SCID/beige Mäuse) durch subkutane Injektion der transfizierten LNCaP- (n = 5) und PC-3-Zellen (n = 9) überprüft. Die PLA2R1-Promotormethylierung als sensitiver Biomarker für die pädiatrische ALL wurde durch Isolation und Bisulfit-Behandlung der genomischen DNA von Knochenmark (KM)-Aspiraten und Leukozyten des peripheren Blutes (PB) von ALL-diagnostizierten Kindern (n = 44) sowie einer anschließenden Analyse mittels digitaler PCR (dPCR) evaluiert. Die Ergebnisse konnten mit dem Methylierungsstatus einer gesunden Kontrollgruppe (n = 20) verglichen werden. Ergebnisse und Schlussfolgerungen: In LNCaP-PLA2R1 und Jurkat-PLA2R1 konnte im Gegensatz zu den dazugehörigen Kontrollzellen eine stabile Überexpression des Rezeptors auf Ebene der Genexpression und Proteinsynthese detektiert werden. Bei PC-3-KD-Zellen war eine Reduktion der PLA2R1-Genexpression und eine Repression der Proteinsynthese unterhalb der Nachweisgrenze des Western Blot Assays zu verzeichnen, während PC-3-Ctrl-Zellen eine Genexpression und Proteinsynthese des Rezeptors zeigten. Die Zellviabilität/ Proliferation und Motilität war signifikant erhöht in LNCaP-PLA2R1 und PC-3-Ctrl im Vergleich zu LNCaP-Ctrl- und PC-3-KD-Zellen. Demgegenüber war eine Verminderung von Apoptose und Koloniewachstum in LNCaP-PLA2R1 und PC-3-Ctrl-Zellen nachweisbar. Durch Genexpressionsanalysen konnte eine Induktion der Expression von Fibronektin 1 (FN1), TWIST Homolog 1 (TWIST1) und Cyclin-abhängige Kinase 6 (CDK6) in LNCaP-PLA2R1-Zellen identifiziert werden. In vivo schien die PLA2R1-abhängige negative Regulation des Koloniewachstums die pro-onkogenen Eigenschaften des Rezeptors zu überwiegen. Dies resultierte in einem verminderten Tumorwachstum von LNCaP-PLA2R1 und einer tumorsuppressiven Rolle des Rezeptors in dieser PCa-Zelllinie. Im Gegensatz dazu zeigten PC-3-Ctrl-Zellen ein schnelleres Tumorwachstum im Xenograft-Mausmodell, was für einen pro-onkogenen Effekt der endogenen PLA2R1-Expression in PC-3-Zellen sprechen würde. Der differenzielle Einfluss von PLA2R1 auf die Regulierung des Tumorzellwachstums könnte im Zusammenhang mit der veränderten Expression von FN1, TWIST1 und CDK6 stehen, jedoch sind weiterführende Experimente nötig, um die Beteiligung dieser Gene in der PLA2R1-Signaltransduktion zu untersuchen. Die Analyse der Zellwachstumskurve der transfizierten Jurkat-Zellen zeigte eine Abnahme der Proliferationsrate und eine Zunahme des Anteils an toten Zellen bei Jurkat-PLA2R1 im Vergleich zu Jurkat-Ctrl-Zellen. Durchflusszytometrische Analysen bestätigten eine Abnahme des Anteils gesunder sowie eine vermehrte Repräsentation von apoptotischen und nekrotischen Jurkat-PLA2R1-Zellen im Vergleich zur Kontrolle, was einen tumorsuppressiven Einfluss des Rezeptors bei der pädiatrischen ALL suggeriert. Die Funktion von PLA2R1 als Tumorsuppressor steht im Einklang mit der festgestellten Hypermethylierung des Rezeptor-Promotors in KM-Aspiraten und PB-Proben von pädiatrischen Patienten mit prä-B und common ALL zum Zeitpunkt der Diagnose der primären Krebserkrankung und des ALL-Rezidives im Vergleich zu der Kontrollgruppe. Der parallele Abfall der PLA2R1-Promotormethylierung und der relativen Blastenzahl im Verlauf der ALL-Induktionstherapie sowie eine signifikante, positive Korrelation beider Größen in KM- und PB-Proben ließen auf die leukämischen Blasten als Quelle der Hypermethylierung des PLA2R1-Promotors schließen. Überdies wiesen Hochrisikopatienten der pädiatrischen ALL eine signifikant höhere PLA2R1-Promotormethylierung am Tag 15 der ALL-Induktionstherapie auf im Vergleich zu Patienten mit einem geringeren Risiko. Zusammenfassend deuteten die in vitro und in vivo Daten auf eine wichtige Funktion des Rezeptors bei der Regulation von Proliferation und Apoptose bei der pädiatrischen ALL hin. Die Analyse der PLA2R1-Promotormethylierung könnte als sensitiver Biomarker zu einer verbesserten ALL-Therapiekontrolle, MRD-Überwachung und Risikostratifizierung während der ALL-Induktionstherapie beitragen.:Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung 4 2 Abstract 8 3 Einführung in die Thematik 11 4 Publikation 1: “Diverse Effects of Phospholipase A2 Receptor Expression on LNCaP and PC-3 Prostate Cancer Cell Growth in vitro and in vivo” 24 5 Publikation 2: “Methylation of the Phospholipase A2 Receptor 1 Promoter Region in Childhood B Cell Acute Lymphoblastic Leukaemia” 25 6 Diskussion und Ausblick 26 7 Literaturverzeichnis 32 8 Danksagung 41 9 Anlagen 42 / Background: The phospholipase A2 receptor 1 (PLA2R1) is a type I transmembrane receptor and a member of the mannose receptor family. Physiological and pathophysiological functions of PLA2R1 are still not completely understood. However, PLA2R1 expression is discussed to have an impact on proliferation, apoptosis/ senescence, adhesion, migration/ invasion as well as inflammatory cell responses and divergent PLA2R1 expression is detectable in different types of cancer compared to corresponding normal tissues. In this context, receptor expression is linked to both a pro-oncogenic/ pro-migratory and a tumour-suppressive/ pro-apoptotic impact in different cancer cells. Moreover, PLA2R1 expression is controlled by epigenetic mechanisms and hypermethylation of the PLA2R1 promoter is associated with silenced expression of the receptor in the prostate carcinoma (PCa) cell line LNCaP and the paediatric, acute lymphocytic leukaemia (ALL) cell line Jurkat. Previous work revealed a defined hypermethylated region of the PLA2R1 promoter in adult patients with acute leukaemia and myelodysplastic syndrome (MDS). PLA2R1 promoter methylation correlated with disease stage and International Prognostic Scoring System (IPSS) classification. Aim: The aim of the present study was to evaluate the function of PLA2R1 in PCa cell lines LNCaP and PC-3. The receptor expression is silenced in LNCaP but upregulated in PC-3 cells compared to normal prostate epithelial cells. A pilot in vivo study addressed the effects of PLA2R1 in mice xenografted with transfected LNCaP and PC-3 cells. Based on previous findings of PLA2R1 promoter hypermethylation in adult ALL and MDS patients, the aim of the present study was to analyse the methylation status of the PLA2R1 promoter in paediatric ALL patients compared to healthy individuals. PLA2R1 methylation analysis was evaluated as sensitive biomarker for ALL treatment response, minimal residual disease (MRD) monitoring, and risk stratification. The impact of the receptor in childhood ALL was investigated by transfection-based re-expression of PLA2R1 in the paediatric ALL cell line Jurkat and the effect of different PLA2R1 expression levels on proliferation and apoptosis/ necrosis was analysed in in vitro experiments. Material and Methods: Stable PLA2R1 overexpression was achieved by transfection of LNCaP (LNCaP-PLA2R1) and Jurkat cells (Jurkat-PLA2R1) with a PLA2R1 plasmid vector. Results were compared to control vector transfected LNCaP (LNCaP-Ctrl) and Jurkat cells (Jurkat-Ctrl). Alternatively, PLA2R1 was knocked down using CRISPR/Cas9 in PC-3 cells (PC-3-KD) and compared to the corresponding control-transfected cells (PC-3-Ctrl). Gene expression analysis was conducted by quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR). PLA2R1 protein synthesis was analysed by western blot. The impact of the differential PLA2R1 expression on proliferative and metastatic parameters of transfected cancer cells was investigated in vitro. Cell viability/ proliferation was assessed by means of WST-1 Assay for adherent cells and via cell growth curve analysis after trypan blue staining for suspension cells. Cell motility and proliferation of transfected PCa cell lines were estimated by wound healing assay. Hydrogen peroxide-stimulated apoptosis was analysed by Caspase-Glo® 3/7 Assay and RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay for transfected PCa cell lines and flow cytometric analysis after Annexin-V-FLUOS/ Hoechst 33258 staining for transfected Jurkat cells. Colony formation of transfected PCa cell lines was evaluated by clonogenic assay. A pilot in vivo study addressed the effects of PLA2R1 in mice xenografted with transfected LNCaP (n = 5) and PC-3 cells (n = 9). Evaluating PLA2R1 promoter methylation as sensitive biomarker for paediatric ALL, genomic DNA was isolated from bone marrow (BM) and peripheral blood (PB) of 44 paediatric ALL patients. After bisulfite treatment of isolated DNA samples, PLA2R1 methylation was analysed using digital PCR and compared to 20 healthy controls. Results and Conclusions: PLA2R1 gene expression and protein synthesis were detectable in LNCaP-PLA2R1, PC-3-Ctrl, and Jurkat-PLA2R1 cells but not in LNCaP-Ctrl and Jurkat-Ctrl cells. In PC-3-KD cells, PLA2R1 gene expression was significantly reduced compared to PC-3-Ctrl and PLA2R1 protein synthesis of PC-3-KD cells was below the limit of detection of western blot analysis. Cell viability/proliferation and motility were significantly increased in LNCaP-PLA2R1 and PC-3-Ctrl compared to LNCaP-Ctrl and PC-3-KD cells, respectively. However, levels of apoptosis and clonogenicity were reduced in LNCaP-PLA2R1 and PC-3-Ctrl cells. Gene expression analysis revealed an up-regulation of fibronectin 1 (FN1), TWIST homolog 1 (TWIST1), and cyclin-dependent kinase 6 (CDK6) in LNCaP-PLA2R1 compared to control cells. In LNCaP xenografts, PLA2R1-dependent regulation of clonogenicity appeared to outweigh the receptor’s pro-oncogenic properties, resulting in decreased tumour growth, supporting the tumour-suppressive role of PLA2R1. Alternatively, PC-3-Ctrl xenografts exhibited faster tumour growth compared to PC-3-KD cells, suggesting a pro-oncogenic effect of endogenous PLA2R1 expression. The differential growth-regulatory effects of PLA2R1 may be mediated by FN1, TWIST1, and CDK6 expression, although further investigation is required. Cell growth curve analyses of transfected Jurkat cells revealed a decreased proliferation and increased cell death of Jurkat-PLA2R1 compared to Jurkat-Ctrl cells. Flow cytometry confirmed the reduced fraction of healthy cells and an increase of the apoptotic and necrotic fractions in Jurkat-PLA2R1 cells compared to control cells, suggesting a tumour-suppressive effect of the receptor in paediatric ALL. PLA2R1’s tumour-suppressive function is in accordance with hypermethylation of the receptor promoter in BM aspirates and PB samples of paediatric patients diagnosed with pre-B and common ALL as well as in patients with disease relapse in comparison to healthy controls. PLA2R1 methylation decreased along with leukaemic blast cell reduction during ALL induction treatment and significant positive correlations between PLA2R1 methylation and leukaemic blast cell numbers of BM and PB samples were observable. Therefore, our data suggests that leukaemic blasts are the origin of PLA2R1 hypermethylation in BM and PB samples. Moreover, high risk paediatric ALL patients exhibited increased levels of PLA2R1 promoter methylation compared to non-high risk groups on day 15 of ALL induction treatment. Collected data indicates that PLA2R1 promoter methylation quantitation can be used as biomarker for ALL induction treatment control, risk stratification, and early detection of ALL relapse.:Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung 4 2 Abstract 8 3 Einführung in die Thematik 11 4 Publikation 1: “Diverse Effects of Phospholipase A2 Receptor Expression on LNCaP and PC-3 Prostate Cancer Cell Growth in vitro and in vivo” 24 5 Publikation 2: “Methylation of the Phospholipase A2 Receptor 1 Promoter Region in Childhood B Cell Acute Lymphoblastic Leukaemia” 25 6 Diskussion und Ausblick 26 7 Literaturverzeichnis 32 8 Danksagung 41 9 Anlagen 42

One of the biggest challenges in healthcare is Emergency Department (ED)crowding which creates high constraints on the whole healthcare system aswell as the resources within and can be the cause of many adverse events.Is is a well known problem were a lot of research has been done and a lotof solutions has been proposed, yet the problem still stands unsolved. Byanalysing Real-World Data (RWD), complex problems like ED crowding couldbe better understood. Currently very few applications of survival analysis hasbeen adopted for the use of production data in order to analyze the complexityof logistical problems. The aims for this thesis was to apply survival analysisthrough advanced Machine Learning (ML) models to RWD collected at aSwedish hospital too see how the Length Of Stay (LOS) until admission ordischarge were affected by different factors. This was done by formulating thecrowding in the ED for survival analysis through the use of the LOS as thetime and the decision regarding admission or discharge as the event in order tounfold the clinical complexity of the system and help impact clinical practiceand decision making.By formulating the research as time-to-event in combination with ML, thecomplexity and non linearity of the logistics in the ED is viewed from a timeperspective with the LOS acting as a Key Performance Indicator (KPI). Thisenables the researcher to look at the problem from a system perspective andshows how different features affect the time that the patient are processedin the ED, highlighting eventual problems and can therefore be useful forimproving clinical decision making. Five models: Cox Proportional Hazards(CPH), Random Survival Forests (RSF), Gradient Boosting (GB), ExtremeGradient Boosting (XGB) and DeepSurv were used and evaluated using theConcordance index (C-index) were GB were the best performing model witha C-index of 0.7825 showing that the ML models can perform better than thecommonly used CPH model. The models were then explained using SHapleyAdaptive exPlanations (SHAP) values were the importance of the featureswere shown together with how the different features impacted the LOS. TheSHAP also showed how the GB handled the non linearity of the features betterthan the CPH model. The five most important features impacting the LOS wereif the patient received a scan at the ED, if the visited and emergency room,age, triage level and the label indicating what type of medical team seemsmost fit for the patient. This is clinical information that could be implementedto reduce the crowding through correct decision making. These results show that ML based survival analysis models can be used for further investigationregarding the logistic challenges that healthcare faces and could be furtherused for data analysis with production data in similar cases. The ML survivalanalysis pipeline can also be used for further analysis and can act as a first stepin order to pinpoint important information in the data that could be interestingfor deeper data analysis, making the process more efficient. / En av de största utmaningarna inom vården är trängsel på akuten som skaparstora ansträngninar inom vårdsystemet samt på dess resurser och kan varaorsaken till många negativa händelser. Det är ett välkänt problem där mycketforskning har gjorts och många lösningar har föreslagits men problemetär fortfarande olöst. Genom att analysera verklig data så kan komplexaproblem som trängsel på akuten bli bättre förklarade. För närvarande harfå tillämpningar av överlevnadsanalys applicerats på produktionsdata för attanalysera komplexiteten av logistiska problem. Syftet med denna avhandlingvar att tillämpa överlevnadsanalys genom avancerade maskininlärningsmetoderpå verklig data insamlat på ett svenskt sjukhust för att se hur vistelsens längdför patienten fram till inläggning påverkades av olika faktorer. Detta gjordesgenom att applicera överlevnadsnanalys på trängsel på akuten genom attanvända vistelsens längd som tid och beslutet om intagning eller utskrivningsom händelsen. Detta för att kunna analysera systemets kliniska komplexitetoch bidra till att påverka klinisk praxis och beslutsfattande.Genom att formulera forskningsfrågan som en överlevnadsanalys i kombinationmed maskininlärning kan den komplexitet och icke-linjäritet som logistikenpå akuten innebär studeras genom ett tidsperspektiv där vistelsens längdfungerar som ett nyckeltal. Detta gör det möjligt för forskaren att ävenstudera problemet från ett systemperspektiv och visar hur olika egenskaperoch situationer påverkar den tid som patienten bearbetas på akuten. Detta uppmärksammar eventuella problem och kan därför vara användbart för attförbättra det kliniska beslutsfattandet. Fem olika modeller: CPH, RSF, GB,XGB och DeepSurv användes och utvärderades med hjälp av C-index där GBvar den bäst presterande modellen med ett C-index på 0.7825 vilket visar attmaskininlärningsmetoderna kan prestera bättre än den klassiska och vanligtförekommande CPH modellen. Modellerna förklarades sedan med hjälp utavSHAP värden där vikten utav de olika variablerna visades tillsammmans med deras påverkan. SHAP visade även att GB modellen hanterade icke-linjäriteten bättre än CPH modellen. De fem viktigaste variablerna som påverkade vistelsens längd till intagning var om patienten blev scannad påakutmottagningen, om de blev mottagna i ett akutrum, ålder, triagenivå ochvilket medicinskt team som ansågs bäst lämpat för patienten. Detta är kliniskinformation som skulle kunna implementeras genom beslutsfattande för attminska trängseln på akuten. Dessa resultat visar att maskininlärningsmetoderför överlevnadsanalys kan användas för vidare undersökning angående de logistiska utmaningar som sjukvården står inför och kan även användas ytterligareför datanalys med produktionsdata i liknande fall. Processen med överlevnadsanalys och ML kan även användas för vidare analys och kan agera som ett förstasteg för att framhäva viktig information i datan som skulle vara intressant fördjupare data analys. Detta skulle kunna göra processen mer effektiv.

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