Regensburg, Univ., Diss., 2008

Thesis (doctoral)--Universiẗat, Marburg, 2004.

Dendritische Zellen stellen eine Gruppe morphologisch, phänotypisch und funktionell einzigartiger Leukozyten dar, die eine zentrale Rolle bei der Regu-lation des Immunsystems spielen. Als die mit Abstand effektivsten antigen-präsentierenden Zellen besteht ihre Funktion sowohl in der Auslösung als auch in der Verhinderung spezifischer Immunantworten, wobei diese Fähigkeiten von ihrem jeweiligen Reifungsstadium abhängig sind. In der vorliegenden Arbeit wurden Dendritische Zellen aus Milzen von Mäusen verschiedener Linien mit¬tels Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung von OptiPrep (Iodixanol) isoliert und phänotypisch sowie funktionell charakterisiert. Die gewonnenen Zellsuspensionen bestanden durchschnittlich zu 41 Prozent aus residenten konventionellen Dendritischen Zellen. Die isolierten Dendritischen Zellen waren unabhängig von der untersuchten Mauslinie bis zu 26 Prozent CD8α-positiv und bis zu 81 Prozent CD8α-negativ. Dendritische Zellen wiesen unmittelbar nach der Zellgewinnung einen unreifen Phänotyp auf mit starker Expression von MHC-Klasse-II, aber schwacher bis fehlender Expression der kostimulato¬rischen Moleküle CD80, CD86 und CD40. Eine 24- bzw. 48-stündige Kulti¬vierung in vitro führte zur Reifung der Dendritischen Zellen mit Zunahme der Expression von MHC-Klasse-II, CD80, CD86 und CD40 um den Faktor 2 bis 4. Diese Zellen wiesen zudem immunstimulatorische Eigenschaften in der gemischten (allogenen) Leukozytenkultur auf. Dendritische Zellen der Mauslinie NMRInude exprimierten nach der In-vitro-Kultur ebenfalls zahlreiche Ober¬flächenmarker, darunter die Reifungsmarker. Die Stärke der Expression war jedoch um bis zu 50 Prozent schwächer als bei Dendritischen Zellen der anderen Mauslinien. Dieser Befund weist auf potentielle Unterschiede zwischen Dendritischen Zellen der thymuslosen Mauslinie NMRInude und Dendritischen Zellen von Wildtyp-Mäusen hin. Es wurde gezeigt, dass OptiPrep zur Isolierung Dendritischer Zellen aus Mäusemilzen bei geringem Arbeitsaufwand und niedrigen Kosten verwendet werden kann. Die isolierten Dendritischen Zellen weisen die zu erwartenden phänotypischen und funktionellen Eigenschaften auf und scheinen somit für den Einsatz in weiterführenden Experimenten geeignet. / Dendritic cells represent a group of morphologically, phenotypically and functionally unique leukocytes that play a pivotal role in regulating the immune system. By far the most effective antigen-presenting cells, their function consists of both triggering and inhibiting specific immune responses, whereby the actual effect depends on the maturation state of the dendritic cells. In the present study, dendritic cells were isolated from spleens of different mouse lines by density gradient centrifugation using OptiPrep (iodixanol) and subsequently characterised phenotypically and functionally. The yielded cell suspensions consisted of 41 per cent resident conventional dendritic cells on average. Irrespective of the mouse line tested, up to 26 per cent of the isolated dendritic cells were CD8α-positive and up to 81 per cent were CD8α-negative. Freshly isolated dendritic cells displayed an immature phenotype with high expression of MHC class II, but low or no expression of the costimulatory molecules CD80, CD86 and CD40. Culturing dendritic cells in vitro for 24 or 48 hours, respectively, caused their maturation as determined by a 2- to 4-fold increase in the expression of MHC class II, CD80, CD86 and CD40. Additionally, these cells displayed immunostimulatory properties in the (allogeneic) mixed leukocyte culture. In vitro-cultured dendritic cells from mouse line NMRInude also expressed several surface markers, the maturation markers among them. However, the expression levels of these markers were up to 50 per cent lower than in dendritic cells from the other mouse lines investigated. This finding suggests potential differences between dendritic cells from the athymic mouse line NMRInude and dendritic cells from wild-type mice. The present study shows that the isolation of dendritic cells from murine spleens with OptiPrep requires little effort and minimal costs. The isolated dendritic cells exhibited the expected phenotypic and functional properties and, therefore, seem suitable for further experimental usage.

In dieser Arbeit wurde in einem Maus Tumormodell untersucht, ob durch eine intraoperative Vakzination mit gentechnisch modifizierten autologen Tumorzellen ein antitumoraler Effekt erzielt werden kann. Das Experiment erfolgte mit zwei Tumorzelllinien (B16 Melanom und Lewis Lung Karzinom). Nach Implantation der Tumorzellen in C57/BL 6 Mäuse wurden diese chirurgisch entfernt. Intraoperativ erhielten die Mäuse eine Vakzination. Dazu wurden folgende Impfstoffe verwendet: 1. subletal bestrahlte mIL-12 transfizierte Tumorzellen, 2. subletal bestrahlte pRSC transfizierte Tumorzellen und 3. frostgeschockte Tumorzellen. Die Impfung erfolgte entweder subcutan oder direkt in die Milz. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine Injektion in die Milz und eine Modifikation mit IL-12 den besten Effekt erzielt. Eine Kontrollgruppe blieb ohne Vakzin. Beobachtet wurde das Tumorwachstum, der Zeitpunkt bis zum makroskopischen Wiederauftreten eines Tumors, Überlebenszeit und die Metastasierungsrate. Versuchstiere ohne Rezidivtumor erhielten erneut einen Tumor. Es erfolgte eine erneute Evaluation des Tumorwachstums, des Zeitpunktes bis zum makroskopischen Wiederauftreten eines Tumors, der Überlebenszeit und der Metastasierungsrate. In beiden Tumorzelllinien profitierten alle Therapiegruppen nach Tumorresektion und Vakzination bezüglich Tumorrezidivrate, Zeit bis zum makroskopischenWiederauftreten des Tumors, Überlebenszeit, Metastasierungsrate und Tumorwachstumsgeschwindigkeit gegenüber der Kontrollgruppe. Vereinzelt konnten signifikante Vorteile für die direkt in die Milz applizierte Vakzine bezüglich der Tumorwachstumsgeschwindigkeit aufgezeigt werden. Weiterhin ergab sich eine geringere Tumorrezidivrate, wenn IL-12 modifizierte autologe Tumorzellen nach R0 Resektion direkt in die Milz appliziert wurden. Auch nach Tumorreimplantation konnte bezüglich Überlebenszeit und Tumorwachstumsgeschwindigkeit ein Vorteil für alle Therapiegruppen gegenüber der Kontrollgruppe herausgearbeitet werden. Nach Impfung in die Milz zeigte sich tendenziell eine geringere Metastasierungsrate. Intraoperative autologe Tumorzellvakzinationen konnten im Tiermodell in einem adjuvanten Setting einen antitumoralen Effekt auslösen. Möglicherweise kann diese Art der Impfung eine zusätzlich hilfreiche Behandlungsform zu den bisherigen adjuvanten Chemotherapeutika werden.

Die Pathophysiologie der akuten Pankreatitis ist durch eine immunologische Dysregulation gekennzeichnet, deren genaue Mechanismen unvollständig verstanden sind. Zur Untersuchung des Einflusses des Stressproteins p8 wurde die akute experimentelle Pankreatitis in einer p8-defizienten Mauslinie induziert und das Immunsystem phänotypisiert. Auf die Entwicklung des Immun- und Organsystems hat eine p8-Deletion keinen Einfluss, jedoch ist die Immunseneszenz verbunden mit einer Splenomegalie, Milzsiderose und extramedullärer Hämatopoese. Die akute Pankreatitis verläuft bei Fehlen von p8 wesentlich schwerer, begleitet von einem stärkeren Verlust an CD4+ T-Zellen in Blut und Milz. In der Phase der Rekonvaleszenz kommt es unter p8-Defizienz zu einem gehäuften Auftreten lymphozytärer Apoptosen in der Milz, begleitet von einer schweren Mikroarchitekturstörung und Verlust von Lymphfollikeln. Es kann erstmals eine antiapoptotische Wirkung von p8 auf aktivierte Milzlymphozyten während der postinflammatorischen Immunrekonstitution postuliert werden, wobei die involvierten Signalwege weiter untersucht werden müssen.

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In dieser Arbeit wurde in einem Maus Tumormodell untersucht, ob durch eine intraoperative Vakzination mit gentechnisch modifizierten autologen Tumorzellen ein antitumoraler Effekt erzielt werden kann. Das Experiment erfolgte mit zwei Tumorzelllinien (B16 Melanom und Lewis Lung Karzinom). Nach Implantation der Tumorzellen in C57/BL 6 Mäuse wurden diese chirurgisch entfernt. Intraoperativ erhielten die Mäuse eine Vakzination. Dazu wurden folgende Impfstoffe verwendet: 1. subletal bestrahlte mIL-12 transfizierte Tumorzellen, 2. subletal bestrahlte pRSC transfizierte Tumorzellen und 3. frostgeschockte Tumorzellen. Die Impfung erfolgte entweder subcutan oder direkt in die Milz. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine Injektion in die Milz und eine Modifikation mit IL-12 den besten Effekt erzielt. Eine Kontrollgruppe blieb ohne Vakzin. Beobachtet wurde das Tumorwachstum, der Zeitpunkt bis zum makroskopischen Wiederauftreten eines Tumors, Überlebenszeit und die Metastasierungsrate. Versuchstiere ohne Rezidivtumor erhielten erneut einen Tumor. Es erfolgte eine erneute Evaluation des Tumorwachstums, des Zeitpunktes bis zum makroskopischen Wiederauftreten eines Tumors, der Überlebenszeit und der Metastasierungsrate. In beiden Tumorzelllinien profitierten alle Therapiegruppen nach Tumorresektion und Vakzination bezüglich Tumorrezidivrate, Zeit bis zum makroskopischenWiederauftreten des Tumors, Überlebenszeit, Metastasierungsrate und Tumorwachstumsgeschwindigkeit gegenüber der Kontrollgruppe. Vereinzelt konnten signifikante Vorteile für die direkt in die Milz applizierte Vakzine bezüglich der Tumorwachstumsgeschwindigkeit aufgezeigt werden. Weiterhin ergab sich eine geringere Tumorrezidivrate, wenn IL-12 modifizierte autologe Tumorzellen nach R0 Resektion direkt in die Milz appliziert wurden. Auch nach Tumorreimplantation konnte bezüglich Überlebenszeit und Tumorwachstumsgeschwindigkeit ein Vorteil für alle Therapiegruppen gegenüber der Kontrollgruppe herausgearbeitet werden. Nach Impfung in die Milz zeigte sich tendenziell eine geringere Metastasierungsrate. Intraoperative autologe Tumorzellvakzinationen konnten im Tiermodell in einem adjuvanten Setting einen antitumoralen Effekt auslösen. Möglicherweise kann diese Art der Impfung eine zusätzlich hilfreiche Behandlungsform zu den bisherigen adjuvanten Chemotherapeutika werden.

Hämangiosarkome, maligne endotheliale Neoplasien, werden bei den Haussäugetieren am häufigsten beim Hund beobachtet und treten bei diesem vor allem in Milz und rechtem Herzohr auf. Anhand ihrer Wachstumsmuster werden sie in kapilläre, kavernöse und solide wachsende Tumoren eingeteilt (PULLEY u. STANNARD 1990, HARRY u. PALEOLOG 2003). Die Prognose kaniner Hämangiosarkome der Milz ist schlecht, wobei in der Literatur nach Splenektomie mediane Überlebenszeiten von 19-240 Tagen angegeben werden (JOHNSON et al. 1989, OGILVIE et al. 1996, SPANGLER u. KASS 1997, WOOD et al. 1998) und auch Praktiker von sehr stark variierenden Überlebenszeiten berichten. Die Eignung verschiedener Parameter (z.B. adjuvante Chemotherapie, klinisches Staging) zur prognostischen Beurteilung wurde bereits von zahlreichen Autoren untersucht (BROWN et al. 1985, SORENMO et al. 1993, WOOD et al. 1998). Studien zum eventuellen Einfluss des Wachstumsmusters auf die Variabilität der Überlebenszeiten existieren bisher jedoch nicht. Darüber hinaus können Hämangiosarkome der Milz auch diagnostisch eine Herausforderung darstellen. Dies ist zum Einen bedingt durch die hohe Anfälligkeit der Milz gegenüber einer raschen Autolyse, zum Anderen erschwert die sehr variable Histomorphologie in einigen Fällen eine sichere Diagnosestellung. Mit dem immunhistologischen Nachweis klassischer Endothelzellmarker wie von Willebrand Faktor und CD31 kann in den meisten Fällen die Diagnose gesichert werden. Besonders bei schlecht differenzierten Hämangiosarkomen, erweisen sich die genannten Marker oftmals als z. T. unzuverlässig (VON BEUST et al. 1988, GAMLEM u. NORDSTOGA 2008). Bei rein solide wachsenden Neoplasien kann der Transkriptionsfaktor Fli-1 hilfreich bei der Diagnose sein (STEIGER et al. 2003). Pro- und anti-angiogene Faktoren steuern in einem streng regulierten, stufenweise ablaufenden Prozess die Entstehung neuer Blutgefäße aus präexistenten Gefäßen – die Angiogenese (KERBEL et al. 1998, CARMELIET et al. 1998, RAK et al. 2000, JOUSSEN et al. 2003, DISTLER et al. 2003). Diese Faktoren konnten u.a. in Neoplasien und deren versorgenden Gefäßen nachgewiesen werden (RESTUCCI et al. 2002, RESTUCCI et al. 2004). Ziel der Studie ist (I) die Untersuchung der Überlebenszeiten von Hunden mit lienalen Hämangiosarkomen unter Berücksichtigung des Wachstumsmusters und weiterer Parameter, (II) wird mittels vergleichender immunhistologischer Untersuchungen die Eignung klassischer Endothelzellmarker sowie angiogener Faktoren und deren Rezeptoren zum Nachweis neoplastischer Endothelzellen überprüft. Der Vergleich des Expressionsverhaltens der genannten Marker zwischen Hämangiosarkomen und nicht-neoplastischen Endothelzellen gibt eventuell Hinweise auf die biologische Wertigkeit der Neoplasien.

Die Pathophysiologie der akuten Pankreatitis ist durch eine immunologische Dysregulation gekennzeichnet, deren genaue Mechanismen unvollständig verstanden sind. Zur Untersuchung des Einflusses des Stressproteins p8 wurde die akute experimentelle Pankreatitis in einer p8-defizienten Mauslinie induziert und das Immunsystem phänotypisiert. Auf die Entwicklung des Immun- und Organsystems hat eine p8-Deletion keinen Einfluss, jedoch ist die Immunseneszenz verbunden mit einer Splenomegalie, Milzsiderose und extramedullärer Hämatopoese. Die akute Pankreatitis verläuft bei Fehlen von p8 wesentlich schwerer, begleitet von einem stärkeren Verlust an CD4+ T-Zellen in Blut und Milz. In der Phase der Rekonvaleszenz kommt es unter p8-Defizienz zu einem gehäuften Auftreten lymphozytärer Apoptosen in der Milz, begleitet von einer schweren Mikroarchitekturstörung und Verlust von Lymphfollikeln. Es kann erstmals eine antiapoptotische Wirkung von p8 auf aktivierte Milzlymphozyten während der postinflammatorischen Immunrekonstitution postuliert werden, wobei die involvierten Signalwege weiter untersucht werden müssen.

Die histologische Diagnostik stellt in der Hämatologie und Onkologie die Voraussetzung einer differenzierten Therapie dar. Minimal-invasive Eingriffe mittels sonographisch-gesteuerter Punktion zur Gewinnung von zytologischen oder histologischen Material bedeutet sowohl einen zeitlichen Gewinn, als auch eine Herabsetzung des Risikos eines operativen Eingriffs. Mit dem gewonnenen Gewebe werden auch immunhistologische Untersuchungen möglich, die z.B. bei Non-Hodgkin Lymphomen notwendig sind. Zur intensiven Polychemotherapie bei malignen Erkrankungen werden oft zentral-venöse Katheter bzw. Port-Anlagen in große Venen eingeführt. Die Komplikationen und deren Management werden aufgezeigt und diskutiert. Eine sonographisch-gesteuerte Venenpunktionstechnik stellt eine Methode dar, die für die Patienten einen risikoarmen und schnelleren Weg bedeuten und als neu-entwickelte Ein-Personen-Technik auch für den Arzt ein innovatives Vorgehen bei einem potentiell komplikationsträchtigen Eingriff mit größerer Sicherheit durchzuführen. / In hematology and oncology histological diagnosis is an important requirement before differential chemotherapy. Sonographically guided puncture techniques achieving cytological and histological material is a time-saving process with moderate risks for the patients. With this material even immunhistological procedures in malignancies like Non-Hodgkin lymphoma are possible. For intensified chemotherapies in malignant diseases central venous catheter such as port catheters are requiriered. In this thesis complications and their management are shown and discussed. The ultrasounically guided central venous puncture represents a method for fast and low risk procedure for our patients. The one-operator technique represents an innovative and save intervention in a potentially risky procedure for physicians.