Thesis (doctoral)--Rijksuniversiteit te Groningen.

Techn. Universiẗat, Diss., 2002--Berlin.

Die Hypophosphatasie (HPP) ist eine seltene Erberkrankung, welche durch compound-heterozygote oder dominant negative heterozygote Mutationen des ALPL Gens zu einem Funktionsverlust der gewebeunspezifischen Alkalischen Phosphatase (TNAP) führt. Die daraus resultierenden Mineralisierungsstörungen betreffen sowohl den Knochen als auch in milderen Ausprägungsformen die Zähne und den Zahnhalteapparat. Das zahnmedizinische Leitsymptom und in vielen Fällen das erste Anzeichen der HPP ist dabei der vorzeitige Verlust der Milchzähne ohne physiologische Wurzelresorption. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene TNAP defiziente immortalisierte Zellen des parodontalen Ligaments (PDL) mittels der CRISPR/Cas9 Methode generiert und anschließend fünf Zelllinien charakterisiert. Die dabei entstandenen Mutationen variierten von einer moderaten heterozygoten Punktmutation zu einer schwerwiegenden homozygoten Deletion eines einzelnen Nukleotids, welche in einem vorzeitigen Stopcodon resultierte. Analysen der ALPL Expression (qPCR), TNAP Aktivitätsmessungen (CSPD Assay) und TNAP Färbungen zeigten einen signifikanten Rückgang in allen TNAP-defizienten Zelllinien mit einer starken Korrelation zwischen der Restaktivität und dem Ausmaß der Mutation, welche in Einklang mit der komplexen Genotyp-Phänotyp Korrelation bei HPP zu bringen ist. Das Potential der osteogenen Differenzierung der hTERT PDL Zellen wurde in der homozygot mutierten Zelllinie komplett unterdrückt. Mögliche Mechanismen des vorzeitigen Zahnverlustes bei HPP Patienten ist die geminderte Formation und Mineralisation des Wurzelzements und die fehlerhafte Insertion der parodontalen Fasern. Die hier erstmalig etablierten Zellkulturmodelle liefern ein valides spenderunabhängiges in vitro Modell der HPP, welches dazu beitragen kann, die molekularbiologischen Zusammenhänge der dentalen Aspekte der Hypophosphatasie zu ergründen und daraus gegebenenfalls neue Therapieansätze abzuleiten. / Hypophosphatasia (HPP) is a rare inherited disorder caused by loss-of-function mutations in the ALPL gene encoding the Tissue Nonspecific Alkaline Phosphatase (TNAP). Besides skeletal symptoms, some patients also present dental abnormalities like for example the premature loss of deciduous teeth. Here we generated and characterized five different TNAP-deficient periodontal ligament (PDL) derived cell lines using the method of CRISPR-Cas9. The mutations varied from a moderate heterozygous point mutation to a severe homozygous deletion leading to a premature stop codon. Analysis of the ALPL expression and TNAP activity measurements in CSPD Assays and TNAP stainings revealed a decrease for all TNAP-deficient cell lines with a strong correlation between the residual activity and the extend of the mutation. The already limited differentiation capacity of immortalized hTERT (human telomerase reverse transcriptase) PDL cells is completely abolished in the homozygously mutated cell line. Putative key mechanisms for the premature exfoliation in HPP are the restricted formation and mineralization of the cementum and the impaired insertion of elastic dental fibers. The newly generated TNAP-deficient cell lines provide a promising and donor independent in vitro model to gain better understanding of the molecular mechanisms of dental problems in HPP.

Hypophosphatasie (HPP) beschreibt eine seltene Erbkrankheit, die hauptsächlich durch heterozygote Mutationen im ALPL-Gen verursacht wird. Diese führen zu einer verminderten Aktivität der gewebeunspezifischen alkalischen Phosphatase (TNAP). Neben skelettalen Symptomen sind Zahnanomalien wie der vorzeitige Verlust von Milchzähnen ohne resorbierte Wurzel sowie eine gestörte Mineralisierung der Zahnhart-substanzen ein typisches Merkmal der HPP. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind bisher noch nicht vollständig verstanden. In der vorliegenden Arbeit wurden Zelllinien des parodontalen Ligaments mit Mutationen im ALPL-Gen charakterisiert, um anschließend mögliche Therapiestrategien für die HPP auf molekularer Ebene zu untersuchen. Im Rahmen der basalen Charakterisierung wurden die Zelllinien hinsichtlich der TNAP-Expression (Immunhistochemie, Western Blot), des Stoffwechselprofils (ATP-Assay) und des osteogenen Differenzierungspotenzials (Alizarin-Färbung) analysiert. Von Interesse war auch, ob durch CRISPR/Cas9-basiertes Genediting Off-Target Mutationen entstanden sind. Zur Untersuchung der molekularen Auswirkungen von PTH, welches die ALPL-Expression steigern kann, wurden zwei Protokolle etabliert, die eine kontinuier-liche, kurzzeitige bzw. intermittierende Präsenz von PTH in-vitro imitieren. Anschließend wurde die ALPL-Expression (qPCR) sowie TNAP-Aktivität (CSPD-Assay) ermittelt. Die basale TNAP-Expression war variabel und reichte vom völligen Fehlen in den Zell-linien mit Deletionen bis hin zu einer starken TNAP-Expression in der Zelllinie mit einer heterogenen Punktmutation. Eine niedrige Expression ging mit einer verringerten Zell-proliferation sowie extrazellulären ATP einher. Es zeigte sich ein unterschiedliches Mineralisierungspotenzial, das hauptsächlich das TNAP-Expressionsniveau in den verschiedenen Zelllinien widerspiegelt, während die PTH-Stimulation keine Wirkung auf die Differenzierung hatte. Im Gegensatz zu klinischen Beobachtungen deuten die Ergebnisse auf eine hohe Korrelation zwischen Genotyp und Phänotyp in-vitro hin, die in-vivo noch bestätigt werden müssen. Die Sequenzierung bestätigte, dass durch die Geneditierung keine Off-Target Mutationen aufgetreten sind, welche somit keinen limitierenden Faktor hinsichtlich der Differenzierungskapazität darstellen können. Die Stimulation mit PTH führte zwar nicht zu einer gesteigerten ALPL-Expression, doch konnte die TNAP-Aktivität in den ALPL-defizienten Zelllinien punktuell gesteigert werden und bildet somit eine solide Basis für weitere Experimente, die zur Therapieentwicklung für die Odonto-HPP beitragen können. / Hypophosphatasia (HPP) describes a rare inherited disorder caused mainly by heterozygous mutations in the ALPL gene. These lead to impaired activity of tissue non-specific alkaline phosphatase (TNAP). In addition to skeletal symptoms, dental abnormalities such as premature loss of deciduous teeth without resorption of the roots and impaired mineralization of tooth hard tissues are typical features of HPP. The underlying molecular mechanisms are not yet fully understood. In the present study, cell lines of the periodontal ligament with mutations in the ALPL gene were characterized to subsequently investigate potential therapeutic strategies for HPP at the molecular level. As part of the basal characterization, the cell lines were analyzed with respect to TNAP expression (immunohistochemistry, Western blot), metabolic profile (ATP assay) and osteogenic differentiation potential (alizarin staining). Also of interest was whether off-target mutations resulted from CRISPR/Cas9-based gene editing. To investigate the molecular effects of Parathyroid Hormone (PTH), which can increase ALPL expression, two protocols were established that mimic continuous, short-term, and intermittent presence of PTH in-vitro. ALPL gene expression (qPCR), as well as TNAP activity (CSPD assay) were then determined. Basal TNAP expression was variable, ranging from complete absence in the cell lines with deletions to strong TNAP expression in the cell line with a heterogeneous point mutation. Low expression was associated with decreased cell proliferation as well as extracellular ATP. There was a differential mineralization potential mainly reflecting the TNAP expression level in the different cell lines, whereas PTH stimulation had no effect on differentiation. In contrast to clinical observations, the results indicate a high correlation between genotype and phenotype in-vitro, which remains to be confirmed in-vivo. Sequencing confirmed that no off-target mutations occurred as a result of gene editing, which thus cannot be a limiting factor with respect to differentiation capacity. Although stimulation with PTH did not result in increased ALPL expression, TNAP activity was selectively increased in the ALPL-deficient cell lines, providing a solid basis for further experiments that may contribute to therapy development for Odonto-HPP.

Ziel dieser Arbeit ist die Abtrennung von monovalenten Anionen wie Chlorid, Fluorid, Bromid und Nitrat aus hochkonzentrierten alkalischen wässrigen Lösungen, die als Matrix zweiwertigen Anionen (Carbonat und Sulfat) besitzen. Nach Auswertung der Literatur eignen sich vor allem die Verfahren Ionenaustausch und Nanofiltration für diesen Zweck. Die untersuchten Ionenaustauscher weisen eine geringe Selektivität für die einwertigen Anionen auf, so dass die für einwertige Anionen nutzbare Kapazität mit steigendem Gehalt an zweiwertigen Anionen sinkt. Dabei steigt die Kapazität in der Reihenfolge Fluorid→Chlorid→Bromid→Nitrat. Die beobachteten Selektivitäten bei der Nanofiltration steigen in der gleichen Reihenfolge, wobei die Trennrate zwischen ein- und zweiwertigen Anionen vom Membrantyp abhängt. Es konnte ein Zusammenhang zwischen den Kapazitäten der untersuchten stark basischen Anionenaustauscher für monovalente Anionen und den Rückhalten für diese Anionen bei den Nanofiltrationsmembranen mit den Ionenhydratationsparametern festgestellt werden.

Zugl.: Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2008.

Tübingen, Univ., Diss., 2003.

Techn. Universiẗat, Diss., 2004--Clausthal.

Bei der adulten Form der Hypophosphatasie (HPP) handelt es sich um eine seltene genetisch bedingte Erkrankung des Knochen- und Mineralstoffwechsels, welche laborchemisch durch eine persistierende Verminderung der Alkalischen Phosphatase (AP) im Serum gekennzeichnet ist. Die Differentialdiagnosen einer verminderten AP-Serumaktivität sind zahlreich und eine HPP als Ursache wird nur selten in Betracht gezogen. In der Literatur finden sich mehrere Fallberichte über Insuffizienzfrakturen bei bestehender HPP. Diese Patienten wiesen AP-Serumkonzentrationen < 0,35 µkat/L auf. Daraus ergab sich das Primärziel der vorliegenden Arbeit, Patienten mit einer adulten Form der Hypophosphatasie im Patientenkollektiv eines Krankenhauses der Maximalversorgung (Universitätsklinikum Leipzig, UKL) zu identifizieren. Der Studienschwellenwert von 0,35 µkat/L wurde zur Erhöhung der diagnostischen Spezifität von Patienten mit einer HPP und möglichen Frakturen in der Anamnese gewählt (Leung et al. 2008; Iqbal et al. 2017). Hierfür wurden die Labordaten der Jahre 2000 bis 2015 des UKL analysiert. Bei 0,1 % der Patienten mit mindestens einer AP-Messung konnte eine Serumkonzentration ≤0,35 µkat/L gemessen werden. Dies entspricht 204 Patienten, welche in die Studie eingeschlossen wurden. Von diesen wiesen 11 % (N=22) eine persistierende Hypophosphatasämie und 24 % (N=48) eine einmalige Bestimmung der AP-Serumaktivität, welche dabei unter dem Studienschwellenwert lag, auf. 66 % (N=134) der Fälle wiesen in der AP-Historie AP-Serumaktivitäten im Referenzbereich auf, sodass eine HPP mit hoher Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen werden konnte. 20 Patienten von 70 Verdachtsfällen waren bereit, an der Studie teilzunehmen. Die Bestimmung des Studienwertes für die AP ergab in 90 % (N=18) dieser Fälle erneut eine verminderte AP-Serumaktivität. Da diese zudem klinische Symptome einer HPP zeigten, wurde die Diagnose einer HPP gestellt. Lediglich in einem Fall der nachuntersuchten Patienten erfolgte im Vorfeld der Studie eine HPP-spezifische Diagnostik, welche die Diagnose einer HPP ergab. Die Ergebnisse bestätigen die Literatur dahingehend, dass die Diagnose einer HPP bei unerklärter HPÄ oft nicht in Betracht gezogen wird, jedoch bei gezielter Diagnostik bestätigt werden kann. Eine einmalige Verminderung der AP-Serumaktivität sollte nicht per se als HPP gewertet werden. Eine Beurteilung der AP-Serumaktivität im Hinblick auf eine HPP sollte unter Berücksichtigung der klinischen Diagnose und weiterer Biomarker anderer Organfunktionen erfolgen. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die AP-Serumaktivität, die Hämoglobin-, Kalzium-, Albumin- und Gesamteiweißkonzentration im Rahmen einer transienten HPÄ signifikant niedriger und die CRP-Serumkonzentration signifikant höher im Vergleich zu Patienten mit einer gesicherten HPP sind. Daher wurden diese als relevante Biomarker bei der Beurteilung der AP im Hinblick auf eine HPP bewertet. Zunächst ist eine Therapie infrage kommender Differentialdiagnosen zur Normalisierung der relevanten Biomarker angezeigt. Nachfolgend sollte eine Verlaufskontrolle der AP-Serumaktivität inklusive der Bestimmung der relevanten Biomarker (Hb-, Kalzium-, Albumin-, Gesamteiweiß- und CRP-Konzentration) durchgeführt werden. Bei persistierender HPÄ sollte eine HPP-spezifische Diagnostik mittels Bestimmung der BAP- und PLP-Serumkonzentration erfolgen. Als „Basis-Profil Hypophosphatasie“ kann anhand der Ergebnisse das verwendete Follow-up-Labor vorgeschlagen werden. Im Vergleich mit der Literatur war der Anteil der identifizierten HPP-Patienten mit rezidivierenden Beschwerden des Muskel-Skelettapparates in der Anamnese in der vorliegenden Arbeit mit 94% erhöht bei im Vergleich niedrigerer durchschnittlicher AP-Serumaktivität von 0,37 µkat/L. Dies unterstützt veröffentlichte Berichte über einen möglichen Zusammenhang von Beschwerdehäufigkeit und der Höhe der AP-Serumaktivität. Für die kindliche Form der HPP konnte solch ein Zusammenhang dargestellt werden, für die adulten Formen ist dies jedoch noch nicht abschließend geklärt. Zusammenfassend sollte im Rahmen einer unerklärten HPÄ eine initiale Diagnostik mit dem verwendeten Follow-up-Labor im Hinblick auf eine Hypophosphatasie, insbesondere zur Vermeidung einer Fehltherapie, erfolgen. Betroffene Patienten sollten in einem spezialisierten Zentrum individuell beurteilt und therapiert werden. Eine Therapie von Begleiterkrankungen sollte unter Berücksichtigung der HPP-spezifischen Biomarker und Pathomechanismen durchgeführt werden.:1.Einleitung 8 Definition und Begriffserklärung 8 Definition Hypophosphatasie 8 Definition der Hypophosphatasämie und deren Verläufe 8 Epidemiologie 9 Hypophosphatasämie 9 Hypophosphatasie 10 Struktur der gewebeunspezifischen Alkalischen Phosphatase (TNAP) 10 Ätiologie 11 Funktion der TNAP im Knochenstoffwechsel 13 Pathomechanismus der Hypophosphatasie, ossäre und extraossäre Manifestation 14 Ossäre Manifestation 14 Extraossäre Manifestation 15 Klinische Manifestation der adulten Hypophosphatasie 16 Klinische Manifestation am Muskel-Skelett-Apparat 16 Klinische Manifestation außerhalb des Muskel-Skelett-Apparates 17 Klinische Manifestation der Odontohypophosphatasie 17 Diagnostik der adulten Hypophosphatasie 17 Laborchemische Untersuchung 18 Genetische Untersuchung 19 Bildgebung 20 Weitere Diagnostik 20 Differentialdiagnosen der verminderten AP-Serumaktivität 20 2.Zielstellung 23 3.Patienten und Methodik 24 Studiendesign 24 Identifizierung von Patienten mit einer Hypophosphatasie am UKL 24 Retrospektive Analyse am UKL vorhandener Biomarker in Hinblick auf eine Hypophosphatasämie 24 4.Gruppe I oder persistierende Hypophosphatasämie: Fälle mit mehrfachen Bestimmungen der AP-Serumaktivität, welche ausschließlich unter dem Referenzbereich (siehe belle 1, (Beck et al. 2009b)) lagen. 25 5.Gruppe II oder einmalige Hypophosphatasämie: In dieser Gruppe wurden alle Fälle mit einer einmaligen AP-Bestimmung am UKL mit einer Aktivität ≤0,35 µkat/L zusammengefasst. 25 6.Gruppe III oder transiente Hypophosphatasämie („Kontrollgruppe“): Diese Gruppe umfasste Fälle mit transienten oder akuten Hypophosphatasämien. In diesen Fällen lagen am UKL AP-Serumaktivitäten im Referenzbereich vor, was eine HPP mit hoher Wahrscheinlichkeit ausschloss. Diese wurde somit als „Kontrollgruppe“ definiert. 25 Nachuntersuchung (Follow-up) von Patienten mit einer Hypophosphatasie 25 Ablauf der Nachuntersuchung („Follow-up-Studie“) 26 Biomarker der Follow-up-Studie 27 Analytik 27 Definition Follow-up-Labor und Basis-Labor 29 Genetische Diagnostik 30 Dual-Röntgen-Absorptiometrie (Knochendichtemessung) 31 Statistische Methoden 32 7.Ergebnisse 33 Retrospektive Analyse, deskriptive Statistik der AP-Serumaktivitäten der Gesamtkohorte 33 Follow-up-Studie, deskriptive Statistik der Gruppe I + II 35 Deskriptive Darstellung der Hypophosphatasie-Patienten 36 Frakturanamnese der Hypophosphatasie-Patienten 39 Statistische Analyse der Biomarker der Hypophosphatasie-Patienten 42 Basisprofil der Hypophosphatasie-Patienten 42 Gibt es Unterschiede der Serumlevel der Biomarker zwischen HPP-Patienten und Patienten mit einer transienten Hypophosphatasämie „Kontrollgruppe“? 45 Könnte mit dem HPP-Profil retrospektiv eine Hypophosphatasie vermutet werden? 48 Darstellung der Biomarker des Nadir-Labors der Hypophosphatasie-Patienten 49 Einordnung der AP-Serumaktivität des Follow-up-Labors in die Hypophosphatasie-spezifischen Biomarker 49 Einordnung der Follow-up-AP in die osteologischen Basisprofil-Biomarker der HPP-Patienten 54 Der Einfluss der Hypophosphatasie auf die Messwerte der DXA 55 Genetische Diagnostik 57 8.Diskussion 60 Epidemiologische Daten der Gesamtkohorte, Häufigkeit einer Hypophosphatasämie 60 Häufigkeit der HPP 63 Relevante Biomarker bei der Bewertung der AP-Serumaktivität im Kontext einer Hypophosphatasämie 64 Erneute retrospektive Beurteilung der Gruppe I und II in Hinblick auf eine HPP unter Berücksichtigung der identifizierten relevanten Biomarker 67 HPP-Labor 67 Manifestation der HPP am Muskel-Skelett-Apparat und Korrelation dieser mit den HPP-spezifischen Biomarkern 70 Hypophosphatasie im Kontext möglicher osteologischer Differentialdiagnosen 73 Der Einfluss der Hypophosphatasie auf die Messwerte der DXA 75 HPP-Mutationen 76 Einordnung der erhobenen Befunde in die aktuellen Therapieoptionen und Falldiskussion 79 Limitationen 86 9.Schlussfolgerungen 88 10.Zusammenfassung der Arbeit 89 11.Literaturverzeichnis 92 12.Tabellenverzeichnis 101 13.Abbildungsverzeichnis 101 14.Anlagenverzeichnis 101 15.Anlagen 101

Die Gebärparese gehört trotz umfangreicher pathophysiologischer Kenntnisse immer noch zu den häufigsten und wirtschaftlich bedeutensten peripartalen Erkrankungen bei Milchkühen. Ziel dieser retrospektiven Studie war, zu untersuchen, ob es bereits im antepartalen Zeitraum möglich ist, anhand von Blut- und Harnparametern eine mögliche Prädisposition für Hochleistungskühe, an Gebärparese zu erkranken, festzustellen. Zur Verfügung standen Blut- und teilweise Harnproben von Beginn des Trockenstehens bis kurz nach dem Abkalben von insgesamt 53 post partum (p.p.) festliegenden Kühen (VT). Untersucht wurden Parameter des Energie- und Fettstoffwechsels, des Leber-, Muskel- und Knochenstoffwechsels, des Eiweißstoffwechsels und des Mineral- und Spurenelementstoffwechsels. Zusätzlich wurde bei 20 dieser Kühe die fraktionelle Elimination (FE) von Calcium, Phosphat, Magnesium, Natrium und Kalium berechnet. Signifikante Differenzen ergaben sich vor allem bei der Alkalischen Phosphatase (AP), die im gesamten antepartalen Meßzeitraum signifikant erniedrigte Aktivitäten bei den VT aufwies. Desweiteren wurde eine im entsprechenenden Zeitraum durchweg erhöhte Calcium-Ausscheidung bei gleichzeitig erhöhter FE Calcium bei den VT beobachtet. Nach der ROC (Receiver Operator Characteristics)-Analyse weisen AP-Aktivitäten im Blut unter 45 U/L in der Trockenstehphase mit einer Sensitivität von etwa 80 % auf ein erhöhtes Gebärpareserisiko p.p. hin. Anhand dieser Ergebnisse kann die AP-Aktivität im Blut während der Trockenstehperiode als frühdiagnostischer Indikator für eine p.p. bestehende Gebärparesegefährdung genutzt werden.