Ulm, Univ., Diss., 2001.

Zugl.: Leipzig, Universiẗat, Diss., 2006.

Les chimiokines sont un élément essentiel du trafic cellulaire aussi bien homéostatique que dans des situations pathologiques. Outre cette fonction chimiotactique spécifique à ce type de molécules, on leur a récemment attribué une implication dans le profil de polarisation de la réponse adaptative spécifique, en agissant directement sur les lymphocytes T (Lc T) ou indirectement par le biais des cellules dendritiques (DC). CCL18 est une chimiokine exprimé préférentiellement au niveau pulmonaire et de façon moindre au niveau ganglionnaire, capable d’attirer les DC et les Lc T, elle est induite par les cytokines de type Th2 telle que l'IL-4, l'IL-13, mais aussi par la cytokine immunomodulatrice l'IL-10, son récepteur est inconnu à ce jour. Au laboratoire il a été montré une implication du CCL18 dans l’asthme allergique (de Nadai, JI, 2006), et cette chimiokine a été associée à différentes pathologies à tropisme pulmonaire ou non avec un rôle pas toujours très clair. L'objectif de ce travail a été d’étudier l’effet immunitaire de cette chimiokine, en base et en situation atopique. L'effet direct du CCL18 a été évalué sur la polarisation de la réponse T. Le prétraitement des Lc T mémoire CD4+ CD25-, de sujets non allergiques, avec le CCL18 conduit à leur transformation en Lc T régulateurs CD4+ CD25+ Foxp3+ produisant de l’IL-10 et du TGF-b capables d'inhiber la prolifération des Lc T effecteurs, à la fois par un mécanisme cytokine et contact dépendant. Cependant, cet effet de régulation de CCL18 est perdu lorsque les cellules T proviennent de sujets allergiques (Chang Y et al., FASEB J, 2010). L’effet indirect du CCL18 a été évalué sur la réponse immune via les DC. La différenciation de monocytes de sujets sains en présence de GM-SCF et CCL18 conduit au développement de DC de phénotype semi-mature, expriment le CCR7, produisant de l’IL10 et l’enzyme 2,3-indoleamine dioxigenase et induisant le développent de Lc T régulateurs de type Tr1 produisant de l’IL-10 capables d’inhiber la prolifération de Lc T effecteurs, par un mécanisme cytokine dépendant. Étonnamment, lorsque les monocytes proviennent de patients allergiques, l'effet tolérogène de CCL18 est perdu en liaison avec la diminution de la fixation de CCL18 à son récepteur putatif (Azzaoui I et al., en révision Blood). Par ailleurs, CCL18 pourrait également jouer un rôle dans la résolution de la réaction allergique par un effet chimiotactique vis-à-vis d’une sous population de LcT régulateurs CD4+CD25highCD127lowLAP+ (Chenivesse C et al., en révision JI). L'effet de corticoïdes sur l'expression de CCL18 a ensuite été analysé. Il a été montré que la sécrétion de CCL18 induite par les cytokines IL-4 et IL-10 est potentialisée par la dexaméthasone, ce qui confirme que CCL18 est plutôt une chimiokine à activité anti inflammatoire (Chabrol J et al., en préparation). La dernière étude concerne une approche dans un modèle murin d'asthme allergique, induit par l'ovalbumine chez la souris Balb/cBYJ. D'un point de vue fonctionnel, l'administration de CCL18 recombinant par voie intratrachéale à des animaux sensibilises permet d'inhiber le développement de la réaction asthmatique, en diminuant l'inflammation pulmonaire (réduction de l'infiltration éosinophilique, inhibition de la production locale de cytokines Th2) et protège ces derniers contre l'altération de leur fonction respiratoire (protection contre l'hyperréactivité bronchique, avec inhibition de l'hypersécrétion de mucus). Toutefois, les mécanismes cellulaires à l'origine de cette protection semblent indépendants de grandes voies de régulation de la réaction (Gilet J et al., en préparation). L'ensemble de ces études montre, et pour la première, qu’une chimiokine est capable d’induire le développement d’une réponse tolérogénique. / Chemokines are a key component of homeostatic cell traffic and involved in pathological situations. In addition to this chemotactic function, specific to these molecules, they have been recently assigned an involvement in specific adaptive response polarization, by acting directly on T cells (T Lc) or indirectly through dendritic cells (DC). CCL18 is a chemokine preferentially expressed in lung and lymph nodes, able to attract DCs and T Lc, induced by Th2 cytokines such as IL-4, IL-13 but also by the immunomodulatory cytokine IL-10, and its receptor is still unknown. In our laboratory it was shown an involvement of CCL18 in allergic asthma (de Nadai, JI, 2006), and this chemokine has also been associated with various pathologies without areal clear described role. The purpose of this work was to evaluate the immune effect of CCL18 at baseline and in atopic situation. The direct effect of CCL18 was evaluated on T cell polarization. Pretreatment of memory T cells CD4+CD25-, from non allergic subjects, with CCL18 led to their switch to regulatory CD4+CD25+ Foxp3+ cells, able to produce IL-10 and TGF-b and inhibit effectors T cell proliferation, by a contact and cytokine dependent mechanism. However, this regulatory effect of CCL18 was lost when T cells were derived from allergic subjects (Chang Y et al., FASEB J, 2010). The indirect effect of CCL18 has been assessed on the immune response through DC. Monocyte, from healthy subjects, differentiated in DC with GM-CFS and CCL18 led to development of semi-mature DC, that expressed CCR7 and produced IL10 and the enzyme indoleamine 2,3-inducing dioxigenase. These cells primed regulatory Tr1 cells able to produce IL-10 and to suppress LcT effectors proliferation by a cytokine dependent mechanism. Surprisingly, when monocytes were derived from allergic patients, the tolerogenic effect of CCL18 was lost, in association with a decreased binding of CCL18 to its putative receptor (Azzaoui I and al., in revision Blood) Moreover, we have shown that CCL18 may also play a role in the resolution of the allergic reaction with a chemotactic effect, by recruitment of a subpopulation of regulatory T cells CD4+CD25highCD127lowLAP+ (Chenivesse C et al., in revision JI). The effect of corticosteroids on CCL18 expression was analyzed. These results showed that the secretion of CCL18 induced by cytokines IL-4 and IL-10 is potentiated by dexamethasone (Chabrol J et al., in preparation) which confirms the anti inflammatory role of CCL18. The last study was an approach in a murine model of allergic asthma induced by ovalbumin in mice Balb/cByJ. Intratracheal administration of recombinant CCL18 to sensitized animals, inhibits asthmatic reaction development, by decreasing pulmonary inflammation (reduced eosinophil infiltration, and inhibition of local production of Th2 cytokine) and protects them against the deterioration of their respiratory function (protection against bronchial hyperresponsiveness, and inhibition of mucus hypersecretion). However, the cellular mechanisms behind this protection appear independent of major regulatory pathways of the reaction (J Gilet et al., in preparation). All these studies show, for the first time, that a chemokine is able to induce a tolerogenic response. However, this feature is absent in allergic donors who exhibit a defect in the binding of CCL18 to its putative receptor. This may participate to the lack of tolerance response observed in allergic diseases. This data suggest that CCL18 and its putative receptor may represent therapeutic targets.

La première partie de la thèse traite de la recherche de biomarqueurs du cancer. Lors de la transcription, il apparaît que certains nucléotides peuvent être remplacés par un autre nucléotide. On s'intéresse alors à la comparaison des probabilités de survenue de ces infidélités de transcription dans des ARNm cancéreux et dans des ARNm sains. Pour cela, une procédure de tests multiples menée sur les positions des séquences de référence de 17 gènes est réalisée via les EST (Expressed Sequence Tag). On constate alors que ces erreurs de transcription sont majoritairement plus fréquentes dans les tissus cancéreux que dans les tissus sains. Ce phénomène conduirait ainsi à la production de protéines dites aberrantes, dont la mesure permettrait par la suite de détecter les patients atteints de formes précoces de cancer. La deuxième partie de la thèse s'attache à l'étude de l'allergie à l'arachide. Afin de diagnostiquer l'allergie à l'arachide et de mesurer la sévérité des symptômes, un TPO (Test de Provocation Orale) est réalisé en clinique. Le protocole consiste à faire ingérer des doses croissantes d'arachide au patient jusqu'à l'apparition de symptômes objectifs. Le TPO pouvant se révéler dangereux pour le patient, des analyses discriminantes de l'allergie à l'arachide, du score du TPO, du score du premier accident et de la dose réactogène sont menées à partir d'un échantillon de 243 patients, recrutés dans deux centres différents, et sur lesquels sont mesurés 6 dosages immunologiques et 30 tests cutanés. Les facteurs issus d'une Analyse Factorielle Multiple sont également utilisés comme prédicteurs. De plus, un algorithme regroupant simultanément en classes des intervalles comprenant les doses réactogènes et sélectionnant des variables explicatives est proposé, afin de mettre ensuite en compétition des règles de classement. La principale conclusion de cette étude est que les mesures de certains anticorps peuvent apporter de l'information sur l'allergie à l'arachide et sa sévérité, en particulier ceux dirigés contre rAra-h1, rAra-h2 et rAra-h3. / The first part of this doctoral dissertation deals with the research of cancer biomarkers. During transcription it was observed that some nucleotides are replaced mistakenly by others. We sought to compare the probabilities of these transcription infidelities in mRNA originating from normal and cancerous tissues. To do this, a multiple testing procedure was performed on the positions of 17 genes by considering their ESTs (Expressed Sequence Tag). The conclusion was reached that the proportions of these transcription errors are mainly increased in cancer tissues as compared to normal ones. This phenomenon would lead to the translation of aberrant proteins, whose detection could help in identifying patients with cancer. The main goals of the second part are the diagnosis of peanut allergy and the prediction of its severity. Diagnosing peanut allergy and evaluating the intensity of the symptoms are currently accomplished with a double blind placebo controlled food challenge (DBPCFC). Patients are given increasing peanut doses until the first clinical reaction appears. Since DBPCFC can result in life-threatening responses, we propose an alternate procedure with the long term goal of replacing invasive allergy tests. Discriminant analyses of peanut allergy, DBPCFC score, the eliciting dose and the first accidental exposure score were performed in 243 allergic patients using 6 immunoassays and 30 skin prick tests. A Multiple Factorial Analysis was performed to use new factors as predictors. We also developed an algorithm for simultaneously clustering eliciting dose values and selecting discriminant variables. Our main conclusion is that antibody measurements provide information on the allergy and its severity, especially those directed against the peanut allergens rAra-h1, rAra-h2 and rAra-h3.

Der Transkriptionsfaktor Stat6 vermittelt zentrale Wirkungen von IL-4 und IL-13, die in der Pathologie atopischer Erkrankungen eine Rolle spielen. Seine Spezifität für diese beiden allergieassoziierten Cytokine ist eine wesentliche Motivation ihn näher zu untersuchen. In dieser Arbeit sollte mehr über die Funktion von Stat6 herausgefunden werden. Außerdem wurden Möglichkeiten untersucht dieses Verhalten zu beinflussen. Einen Schwerpunkt der Arbeit bildete die Regulation des Eotaxin-1-Promotors. Eotaxin-1 ist einer der stärksten Rekrutierungsfaktoren für Eosinophile, die eine zentrale Rolle bei der Immunpathologie allergischer Erkrankungen spielen. Mit Hilfe der Daten konnte eine neue Hypothese zur Regulation des Eotaxin-1-Promotors entwickelt werden. Zum Vergleich wurde mit der Untersuchung des Promotors eines weiteren Chemokins, des MCP-4, begonnen. In Zusammenarbeit mit Dr. Sascha Stolzenberger wurde ein Weg untersucht den Stat6-Signalweg zu hemmen. Dabei wurden mit Hilfe des Antennapedia-Peptides Stat6-Bindepeptide in die Zelle transportiert, um dort über eine kompetitive Hemmung die Signaltransduktion zu unterbinden. Ergebnis dieser Arbeiten ist ein hochspezifischer, aber nur transient wirkender Stat6 Inhibitor. Die Stat6/DNA-Wechselwirkung wurde mit der Magnetobead-Technik untersucht. Dabei werden Promotorfragmente an Magnetkügelchen gekoppelt und unter Ausnutzung der Magnetisierung an die DNA bindende Proteine isoliert und über SDS-PAGE/Immunoblotanalyse untersucht. Mit dem Verfahren konnte die Stat6-Bindung an acht verschiedene Promotoren nachgewiesen werden. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Pallardy aus Paris wurde die Wechselwirkung von Stat6 mit dem Glucocorticoid-Rezeptor untersucht. Glucocorticoide kontrollieren Entzündungen und Interaktionen des aktivierten Rezeptors mit anderen Proteinen aus der Stat-Familie sind seit längerem bekannt. Wie in dieser Arbeit gezeigt wurde, interagiert Stat6 mit dem Glucocorticoidrezeptor unabhängig von einer Bindung an DNA. Zusätzlich wurde der Mucin-2-Promotor auf Stat6-Regulierung untersucht. Mucine sind wichtige Bestandteile des Schleimes. Verstärkte Schleim-Sekretion ist ein klinisches Symptom asthmatischer Erkrankungen und trägt zur Zerstörung der Lunge bei. Ein potentiell Stat6 reguliertes Fragment aus dem Mucinpromoter wurde mit Hilfe von PCR-Techniken isoliert und in Reportergenvektoren kloniert. / The transcriptionfactor Stat6 mediates central effects of the interleukins (IL)-4 and -13, that play important roles in the pathology of Allergy and Asthma. The specificity of these both Allergy-associated cytokines is a strong motivation to investigate the detailed functions of Stat6 and to search for possibilities to influence the behaviour of this transcriptionfactor. The main focus of this work was the regulation of the Eotaxin-1-promoter. The Eotaxin-1 chemokine is one of the most potent recruiting factors for eosinophils, that play a central role in the immunopathology of allergic diseases. On the basis of these data a new model for the regulation was created. In addition to this the investigation of another chemokine promoter, the MCP-4-promoter, was started. In another part of this work a specific Stat6-binding-peptide to inhibit the IL-4 signaltransduction pathway was established. Using the Antennapedia-carrier-peptide allowed to shuttle Stat6-binding peptides into cells where they prevented Stat6 mediated signalling by competitive inhibition. Thus the Stat6-binding-peptide came out to be a transient Stat6 inhibitor with high specificity. The Stat6/DNA-interaction was investigated by DNA-pull-down assays with magnetobeads. Fragments of different promoters are linked to magnetobeads and by using magnetic forces the DNA binding proteins are isolated. This application was used to show Stat6-binding to 8 different promoters. Another subject of this work was the interaction of Stat6 with the glucocorticoid receptor. It is well known that glucocorticoids control inflammation and that the activated receptor interacts with different proteins of the Stat-family. In collaboration with the group of Marc Pallardy in Paris we were able to show that Stat6 interacts with the glucocorticoid receptor independently of DNA binding. In association with Stat6 the regulation of the Mucin-2-promoter seemed to be an interesting aspect. Mucins are essential components of mucus (slime). Enhanced mucus-secretion is a symptom of asthmatic diseases and contributes to the destruction of the lung. A potentially Stat6 regulated fragment was isolated by PCR-techniques and cloned into reportergene vectors.

L'allergie alimentaire est actuellement inquiétante par sa fréquence dans les pays industrialisés. En effet, son incidence est en constante et rapide augmentation. Parmi les allergènes majeurs: l'arachide, le poisson, l'oeuf et le lait de vache sont couramment trouvés dans de nombreux produits agro-alimentaires (farines, vins...) d'où l'obligation d'un étiquetage systématique. Notre objectif était d'établir des modèles de souris allergiques, à certaines protéines alimentaires (arachide, colle de poisson, albumine et caséine), caractérisés par la production in vivo d'IgE et d'IgG1 sériques spécifiques de ces protéines et par les manifestations cliniques suites aux tests de provocation avec ces mêmes protéines. Nous avons étudié, tout d'abord, l'allergénicité des vins sur quatre souches de souris (C3H, CBA, DAB/2 et SJL) après les différentes étapes du collage et nous avons montré que la décantation, la filtration et le vieillissement sont des étapes importantes pour l'élimination des produits utilisés pour la clarification des vins. Ensuite, nous avons étudié la réaction croisée arachide-lupin chez les souris C3H, CBA, SJL et BALB/c sensibilisées à l'arachide et nous avons montré que la réaction croisée arachidelupin in vitro n'implique pas une allergie croisée arachide-lupin. Enfin, nous avons, expérimenté et comparé plusieurs approches et voies de sensibilisation pour identifier les facteurs environnementaux nécessaires à la manifestation de la réponse allergique. Nous avons conclu que la sensibilisation avec l'arachide par voie orale naturelle sur un modèle de souris sensibilisable (C3H et CBA), en présence et en absence d'adjuvant, ne provoque pas d'allergie. En conclusion, la voie intrapéritonéale en présence d'adjuvant reste le moyen le plus rapide et le plus efficace pour obtenir un modèle de souris allergiques.

Bien que la plupart des études se focalisent sur les lymphocytes T CD4+ régulateurs, il a été observé que les lymphocytes T CD8+ régulateurs peuvent jouer un rôle important dans l’induction et le maintien de la tolérance immunitaire. Le transfert adoptif chez la souris et l’induction chez l’homme de lymphocytes T CD8+ régulateurs peuvent inhiber le rejet d’allogreffes et le développement de pathologies autoimmunes. Ces observations suggèrent que l’induction de ces populations peut avoir un potentiel thérapeutique. Des études supplémentaires sont encore nécessaires pour définir les conditions optimales de leur induction. Tant les nouveaux nés humains que murins ont une plus forte capacité que l’adulte à développer des lymphocytes T CD4+ régulateurs induits par une reconnaissance antigénique. La période néonatale serait donc particulièrement appropriée à l’induction de circuits régulateurs. Dans le cadre de ce travail, nous avons étudié le rôle des lymphocytes T CD8+, induits à la naissance, dans le contrôle de la réponse des lymphocytes T CD4+ de type Th2. Des souris BALB/c sont immunisées à la naissance à l’aide de cellules spléniques semi-allogéniques hybrides F1 (AJAX x BALB/c). Ces cellules persistent dans l’animal, au sein des organes lymphoïdes et stimulent ainsi de manière chronique les lymphocytes T CD4+ et T CD8+ du receveur et induisent une réponse de type Th2. Suite à l’injection des cellules spléniques semi-allogéniques au nouveau né de souris, nous avons observé l’expansion d’une population de lymphocytes T CD8+CD25+, dont le phénotype se caractérise par l’expression de Foxp3 et la production conjointe d’IFN- et l’IL-10. Nous avons pu observer que ces cellules sont capables d’inhiber la production de cytokines Th2 produites par les lymphocytes T CD4+ allospécifiques activés. Par contre, ces cellules régulatrices aggravent des réponses Th2 non apparentées. En effet, suite à une sensibilisation à l’ovalbumine, à l’âge adulte, ces souris développent de plus fortes réponses asthmatiques. D’autre part, les nouveaux nés de souris BALB/c ont été immunisés à la naissance à l’aide de cellules dendritiques semi-allogéniques hybrides F1 (AJAX x BALB/c) qui activent de manière aigüe leurs lymphocytes T. Ces souris présentent une forte réponse Th1 et Tc1/Tc2 spécifique de l’alloantigène et sont protégées contre le développement d’un asthme induit. Il a aussi été montré dans ce travail que suite à l’immunisation néonatale à l’aide de cellules dendritiques semi-allogéniques, le nombre de lymphocytes T CD8+CD44high, CD8+CD62Lhigh et CD8+CD25+ producteurs d’IFN- augmente significativement. L’IFN- produit par ces cellules contrôle l’hyperproduction des IgE spécifiques de l’allergène et la synthèse d’ARNm de l’IL-4 et de l’IL-13 induite dans les poumons des souris allergiques. Des études supplémentaires sont nécessaires pour mieux comprendre comment des lymphocytes T CD8+ régulateurs induits lors de stimulations antigéniques aigües ou chroniques en début de vie peuvent être capables de contrôler l’apparition de pathologies allergiques. De plus, le développement de vaccins capables de cibler les lymphocytes T CD8+ chez le jeune enfant pourrait contribuer à la recherche de nouveaux traitements des allergies et de l’asthme.

L'engagement des récepteurs de forte affinité pour les IgE (RFcγI), qui contiennent des motifs d'activation nommés ITAM, induit l'activation des mastocytes et des basophiles. Les récepteurs de faible affinité pour les IgG (RFcγIIB) contiennent des motifs d'inhibition nommés ITIM et inhibent l'activation cellulaire lorsqu'ils sont coagrégés aux récepteurs à ITAM. Les RFcγIIB inhibent également la prolifération cellulaire induite par les récepteurs à activité tyrosine kinase comme Kit. Les propriétés inhibitrices des RFcγIIB reposent sur le recrutement de l'inositol phosphatase SHIP1, qui dégrade le Phosphatidyl Inositol tri-phosphate PI(3,4,5)P3, une molécule impliquée dans de nombreuses voies de signalisation. Au cours de ma thèse, j'ai montré que lorsqu'ils sont coagrégés avec les RFcγI, les RFcγIIB, inhibent non seulement l'activation induite par ces RFcγI (cis-inhibition), mais aussi l'activation induite par d'autres RFcγI et la prolifération induite par Kit. Nous avons appelé cette nouvelle propriété, la trans-inhibition. De même, la coagrégation de Kit avec les RFcγIIB inhibe l'activation des mastocytes induite par les RFcγI. La trans-inhibition peut être également induite dans les basophiles murins et humains. Finalement, la coagrégation de Kit et des RFcyIIB inhibe la prolifération, dépendante de l'oncogène Abl, d'un mastocytome murin. En conclusion, la trans-inhibition est un nouveau mécanisme de régulation, dépendant de SHIP1, qui induit un état d'anergie de la cellule, l'empêchant de répondre à des signaux d'activation et de prolifération

Thèse doctorat : Sciences de la vie et de la santé : Paris 12 : 2003. / Version électronique uniquement consultable au sein de l'Université Paris 12 (Intranet). Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. : 119 réf.

Thèse doctorat : Sciences du vivant : pharmacologie et toxicologie : Strasbourg 1 : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 41 p.