O presente estudo teve como objetivo caracterizar o genoma de estirpes de Leptospira isoladas no Brasil e realizar a análise comparativa destes com os genomas disponíveis no banco de dados GenBank. Foram caracterizadas 17 estirpes isoladas de distintas espécies animais, em diferentes regiões do Brasil, no período de 1998 a 2012. Estas foram previamente tipificadas por sequenciamento do gene 16S rRNA e soroaglutinção microscópica em seis espécies (L. interrogans, L. santarosai, L. inadai, L. kirschneri, L. borgpetersenii e L. noguchii) e mais de oito sorogrupos. Foi realizado o sequenciamento em plataforma Illumina™ MiSeq e montagem dos genomas com algoritmo ab initio. Para ordenação e anotação foram utilizados genomas de referência das respectivas espécies estudadas. Foi realizada a análise in silico da Tipagem por Sequenciamento de Multilocus (MLST) para os três protocolos vigentes de Leptospira. A análise comparativa dos genomas, incluindo wgSNP, foi realizada intra-espécie avaliando as variações existentes entre os sorogrupos das espécies de Leptospira estudadas. As estirpes de L. interrogans apresentaram resultados na MLST congruentes com a sua identificação prévia. No caso de L. kirschneri, apenas uma estirpe apresentou novos alelos nos três protocolos de MLST e se distancia das demais estirpes brasileiras de L. kirschneri. As estirpes de L. santarosai, assim como as de L. borgpetersenii e L. noguchii, possuem novos alelos e/ou perfis alélicos para pelo menos dois dos protocolos vigentes de MLST, sendo que ainda se destacam em um agrupamento próprio de origem brasileira. Os genomas de L. interrogans apesar de apresentarem alta identidade e sintenia com a referência sorovar Copenhageni, também apresentaram regiões de diferença entre os respectivos sorogrupos. Os genomas dos sorogrupos Australis e Serjoe se destacaram por apresentarem inserções e deleções, respectivamente, principalmente no cromossomo 2. O genoma de L. borgpetersenii também apresentou grande variação de composição, como esperado para espécie, sendo esta proporcionada por sequências de inserção e transposição de elementos móveis. Os sorogrupos Canicola e Pomona apresentaram maior proximidade entre si na análise wgSNP. Também foram identificados dois plasmídeos nos genomas do sorogrupo Canicola com alta identidade aos plasmídeos descritos na estirpe chinesa do mesmo sorovar. Na espécie L. kirschneri, a estirpe 47 (M36/05) apresentou alta identidade e sintenia com os genomas do sorovar Mozdok, como esperado, incluindo a estirpe brasileira de origem humana. Já a estirpe 55 (M110/06) se diferenciou dos demais genomas de L. kirschneri tanto no MLST quanto no wgSNP. O genoma brasileiro de L. inadai apresentou alta identidade à referência americana de origem humana, incluindo a presença de um bacteriófago próprio da espécie. A distinção das estirpes brasileiras de L. santarosai na MLST, também foi evidenciada na análise comparativa e no wgSNP, sendo que a estirpe 68 (M52/8-19), que não apresentou reatividade aos sorogrupos testados, ainda se diferencia das demais reafirmando a possibilidade de novo sorogrupo/sorovar. Dessa forma, o estudo genômico possibilitou a identificação de particularidades das estirpes brasileiras de Leptospira, incluindo a existência de elementos extra-cromossomais, proximidade com estirpes de origem humana indicando maior risco para saúde pública, além da possibilidade de novo sorogrupo de L. santarosai. / The present study aimed to characterize the genome of Leptospira strains isolated in Brazil and to perform their comparative analysis with GenBank available genomes. 17 strains isolated from distinct species, in different regions of Brazil, from 1998 to 2012 were characterized. These were previously typified through 16S rRNA sequencing and microscopic agglutination into six species (L. interrogans, L. santarosai, L. inadai, L. kirschneri, L. borgpetersenii and L. noguchii) and over eight serogroups. Illumina™ MiSeq sequencing and genome assembly with ab initio algorithm were performed. For ordering and annotation, reference genomes of the respective species were used. The in silico analysis of Multilocus Sequencing Typing (MLST) was performed for the three current Leptospira protocols. The comparative genomic analysis, including wgSNP, was performed intra-species evaluating the existing variations between the serogroups of the studied Leptospira species. The L. interrogans strains presented MLST results congruent with their previous identification. In the case of L. kirschneri, only one strain presented new alleles in the three MLST protocols and distanced itself from the other Brazilian L. kirschneri strains. The L. santarosai strains, as well as L. borgpetersenii and L. noguchii, presented new alleles and/or allelic profiles for at least two of the current MLST protocols, and still stand out in a separate group of Brazilian origin. Even though the L. interrogans genomes presented high identity and synteny with serovar Copenhageni reference, they also presented regions of difference between the respective serogroups. Serogroups Australis and Serjoe genomes stood out for having insertions and deletions, respectively, mainly in chromosome 2. The L. borgpetersenii genome also presented great variation of composition, as expected for the species, which is provided by insertion sequences and transposition of mobile elements. The serogroups Canicola and Pomona presented higher proximity in the wgSNP analysis. Two plasmids were also identified in the serogroup Canicola genomes with high identity to the plasmids described in the Chinese strain of the same serovar. In the L. kirschneri species, the strain 47 (M36/05) presented high identity and synteny with the serovar Mozdok genomes, as expected, including the Brazilian strain of human origin. The strain 55 (M110/06) differed from other L. kirschneri genomes in both MLST and wgSNP. The Brazilian L. inadai genome presented high identity to the American reference of human origin including the presence of bacteriophage specific for the species. The distinction of the Brazilian L. santarosai strains in the MLST was also evidenced in the comparative analysis and in the wgSNP, and the strain 68 (M52 / 8-19), which showed no reactivity to the tested serogroups, also differs from the others reaffirming the possibility of a new serogroup/serovar. Therefore, the genomic study allowed the identification of particularities of Brazilian Leptospira strains, including the existence of extrachromosomal elements, proximity to strains of human origin indicating a greater risk for public health, in addition to the possibility of a new L. santarosai serogroup.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2590.pdf: 1752867 bytes, checksum: 7dd2196f0a9d489b35a0759a6cc018c6 (MD5) Previous issue date: 2009-09-04 / Pipeline systems for genomic and transcriptomic analysis aim to create communication bridges among the existing analysis tools, therefore reducing researchers efforts. Most of the pipelines found in the literature lack important features which would be useful to the development of genome or transcriptome sequencing projects. Among them, the capacity of tracking the project results along its development, including the generation of partial reports; the presence of a collaborative environment where the involved laboratories can contribute with new data and chromatograms; the possibility to configure analysis parameters; multiple pipeline support and the possibility to include new tools and modules. In this work, a pipeline prototype was developed to overcome these shortcomings. Sequencing projects progresses are tracked along all over their developments. Chromatograms are progressively received along the development of the project and partial reports over newly received data are generated. The communication with the processing server is done via Web service, which offers a universal language interface, allowing client applications in heterogeneous platforms to submit data and execute operations and queries. Pipelines are configured in XML documents written in a predefined format, through which the researchers choose the tools and parameters to be used. The prototype offers support to multiple pipelines executed simultaneously in the same project. Pipelines are executed in parallel by the means of thread pools, what increases efficiency by distributing the workload in multiprocessed systems. Another feature of the prototype is the extensibility as each pipeline step is wrapped in a module. New modules can be easily inserted in the system through the implementation of a programming interface, therefore without the needing of recompilation. Module insertions are done in a declarative way through XML documents. A client application was also developed in the collaborative platform Sakai, allowing different research groups involved in a sequencing project to create pipelines, view results and exchange information on the project current status. To evaluate the efficiency of the prototype, a case study was carried out. Sequences generated from sequencing of Sphenophorus levis transcriptome were submitted and a pipeline was configured to analyze the data. The case study has pointed out that the prototype is efficient and produces good results. / Sistemas de pipeline para análise de genomas e transcriptomas têm o objetivo de criar pontes de comunicação entre as diferentes ferramentas no intuito de reduzir os esforços do pesquisador no processo de análise. A maioria dos pipelines descritos na literatura carece de funcionalidades importantes para o desenvolvimento de projetos de sequenciamento. Entre elas, a capacidade de acompanhar e gerar resultados parciais das análises ao longo do desenvolvimento do projeto; a presença de um ambiente colaborativo onde os diferentes laboratórios envolvidos possam contribuir com novos dados e cromatogramas; a possibilidade da configuração dos parâmetros da análise; o suporte a múltiplos pipelines com diferentes configurações; e o suporte à inclusão de novos programas e módulos. Neste trabalho, foi desenvolvido um protótipo que supre essas deficiências. O progresso dos projetos é acompanhado ao longo de todo o seu desenvolvimento. Para isso, recebe dados brutos de cromatogramas, realiza análises dos dados parciais e emite relatórios com os resultados. A comunicação com o servidor de processamento é realizada via Web service, oferecendo uma interface na linguagem universal XML que permite que aplicações cliente em plataformas heterogêneas submetam dados e realizem operações e consultas. Os pipelines são configurados através de arquivos XML em formato específico, no qual o pesquisador define os programas a parâmetros a utilizar. O protótipo dá suporte a múltiplos pipelines com execução simultânea em um mesmo projeto. A execução dos pipelines é realizada em paralelo por meio de um pool de threads, o que aumenta a eficiência dividindo a carga de processamento em servidores com mais de um núcleo. Uma aplicação cliente foi desenvolvida na plataforma colaborativa, permitindo que os diferentes grupos de pesquisa envolvidos no sequenciamento criem pipelines, visualizem resultados e troquem informações sobre o andamento do projeto. Outro diferencial do protótipo desenvolvido é a extensibilidade. Cada etapa do pipeline é encapsulada em um módulo. Novos módulos podem ser facilmente inseridos sem a necessidade de recompilação de todo o sistema, bastando para isso que o mesmo implemente uma interface específica. A inserção no sistema é realizada declarativamente em arquivos XML. Um estudo de caso foi realizado com a submissão de cromatogramas a partir do sequenciamento de ESTs (Expressed Sequence Tags) de Sphenophorus Levis. Um pipeline foi configurado para o estudo, e sua execução mostrou que o sistema é eficiente e apresenta bons resultados.

Submitted by Maike Costa (maiksebas@gmail.com) on 2017-07-03T13:42:30Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2175297 bytes, checksum: 0d32244b68ce823204f52f4f1ca022de (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-03T13:42:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2175297 bytes, checksum: 0d32244b68ce823204f52f4f1ca022de (MD5) Previous issue date: 2017-02-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Genomic islands (GIs) are regions of the bacterial and archaeal genomes that were acquired through the phenomenon of horizontal transfer. Usually, these regions provide important adaptations to these organisms, such as antibiotic resistance and pathogenicity, whose effects can be harmful to other species. For these reasons, many computational methodologies have been proposed for their prediction, however, none of them are capable to precisely identify the whole repertoire of islands present in a given genomic sequence. Therefore, the development of new approaches that explore different aspects of these regions is timely, allowing the identification of those not known. In this paper, it is proposed a novel method for the identification of GIs, built based on mean shift clustering algorithm, with the automatic bandwidth calculation, necessary to its operation. Test results with genomic island inserted in bacterial genomes show that the method is capable of identifying these regions, with sensitivity rates above 99%. Tests performed with bacterial genomes with known GIs revealed the potential of the method for their identification and for the discovery of new island. The detailed study of the new islands content pointed the presence of typical GIs elements, confirming its effectiveness in the prediction of these regions. / Ilhas genômicas (IGs) são regiões do genoma de bactérias e arqueas adquiridas por meio do fenômeno da transferência horizontal. Frequentemente, essas regiões proporcionam importantes adaptações a esses organismos, como resistência a antibióticos e patogenicidade, cujos efeitos podem ser danosos a outras espécies. Por essa razão, diversas metodologias computacionais foram propostas para a sua predição, porém nenhuma capaz de identificar o repertório completo de ilhas presentes em uma determinada sequência genômica. Portanto, torna-se oportuno o desenvolvimento de novas abordagens que explorem diferentes aspectos dessas regiões, permitindo a identificação daquelas não conhecidas. Nesse trabalho, propõe-se um novo método para a identificação de IGs, construído com base no algoritmo de agrupamento mean shift, com o cálculo automático da largura de banda, indispensável para o seu funcionamento. Resultados dos testes com ilhas genômicas inseridas em genomas de bactérias mostram que o método é capaz de identificar essas regiões com taxas de acerto acima de 99%. Testes realizados com genomas de bactérias com IGs conhecidas revelaram o potencial do método para a sua identificação e para a descoberta de novas ilhas. O estudo detalhado do conteúdo das novas ilhas apontou a presença de elementos típicos de IGs, confirmando a eficácia do método na predição dessas regiões.

O presente estudo teve como objetivo caracterizar o genoma de estirpes de Leptospira isoladas no Brasil e realizar a análise comparativa destes com os genomas disponíveis no banco de dados GenBank. Foram caracterizadas 17 estirpes isoladas de distintas espécies animais, em diferentes regiões do Brasil, no período de 1998 a 2012. Estas foram previamente tipificadas por sequenciamento do gene 16S rRNA e soroaglutinção microscópica em seis espécies (L. interrogans, L. santarosai, L. inadai, L. kirschneri, L. borgpetersenii e L. noguchii) e mais de oito sorogrupos. Foi realizado o sequenciamento em plataforma Illumina™ MiSeq e montagem dos genomas com algoritmo ab initio. Para ordenação e anotação foram utilizados genomas de referência das respectivas espécies estudadas. Foi realizada a análise in silico da Tipagem por Sequenciamento de Multilocus (MLST) para os três protocolos vigentes de Leptospira. A análise comparativa dos genomas, incluindo wgSNP, foi realizada intra-espécie avaliando as variações existentes entre os sorogrupos das espécies de Leptospira estudadas. As estirpes de L. interrogans apresentaram resultados na MLST congruentes com a sua identificação prévia. No caso de L. kirschneri, apenas uma estirpe apresentou novos alelos nos três protocolos de MLST e se distancia das demais estirpes brasileiras de L. kirschneri. As estirpes de L. santarosai, assim como as de L. borgpetersenii e L. noguchii, possuem novos alelos e/ou perfis alélicos para pelo menos dois dos protocolos vigentes de MLST, sendo que ainda se destacam em um agrupamento próprio de origem brasileira. Os genomas de L. interrogans apesar de apresentarem alta identidade e sintenia com a referência sorovar Copenhageni, também apresentaram regiões de diferença entre os respectivos sorogrupos. Os genomas dos sorogrupos Australis e Serjoe se destacaram por apresentarem inserções e deleções, respectivamente, principalmente no cromossomo 2. O genoma de L. borgpetersenii também apresentou grande variação de composição, como esperado para espécie, sendo esta proporcionada por sequências de inserção e transposição de elementos móveis. Os sorogrupos Canicola e Pomona apresentaram maior proximidade entre si na análise wgSNP. Também foram identificados dois plasmídeos nos genomas do sorogrupo Canicola com alta identidade aos plasmídeos descritos na estirpe chinesa do mesmo sorovar. Na espécie L. kirschneri, a estirpe 47 (M36/05) apresentou alta identidade e sintenia com os genomas do sorovar Mozdok, como esperado, incluindo a estirpe brasileira de origem humana. Já a estirpe 55 (M110/06) se diferenciou dos demais genomas de L. kirschneri tanto no MLST quanto no wgSNP. O genoma brasileiro de L. inadai apresentou alta identidade à referência americana de origem humana, incluindo a presença de um bacteriófago próprio da espécie. A distinção das estirpes brasileiras de L. santarosai na MLST, também foi evidenciada na análise comparativa e no wgSNP, sendo que a estirpe 68 (M52/8-19), que não apresentou reatividade aos sorogrupos testados, ainda se diferencia das demais reafirmando a possibilidade de novo sorogrupo/sorovar. Dessa forma, o estudo genômico possibilitou a identificação de particularidades das estirpes brasileiras de Leptospira, incluindo a existência de elementos extra-cromossomais, proximidade com estirpes de origem humana indicando maior risco para saúde pública, além da possibilidade de novo sorogrupo de L. santarosai. / The present study aimed to characterize the genome of Leptospira strains isolated in Brazil and to perform their comparative analysis with GenBank available genomes. 17 strains isolated from distinct species, in different regions of Brazil, from 1998 to 2012 were characterized. These were previously typified through 16S rRNA sequencing and microscopic agglutination into six species (L. interrogans, L. santarosai, L. inadai, L. kirschneri, L. borgpetersenii and L. noguchii) and over eight serogroups. Illumina™ MiSeq sequencing and genome assembly with ab initio algorithm were performed. For ordering and annotation, reference genomes of the respective species were used. The in silico analysis of Multilocus Sequencing Typing (MLST) was performed for the three current Leptospira protocols. The comparative genomic analysis, including wgSNP, was performed intra-species evaluating the existing variations between the serogroups of the studied Leptospira species. The L. interrogans strains presented MLST results congruent with their previous identification. In the case of L. kirschneri, only one strain presented new alleles in the three MLST protocols and distanced itself from the other Brazilian L. kirschneri strains. The L. santarosai strains, as well as L. borgpetersenii and L. noguchii, presented new alleles and/or allelic profiles for at least two of the current MLST protocols, and still stand out in a separate group of Brazilian origin. Even though the L. interrogans genomes presented high identity and synteny with serovar Copenhageni reference, they also presented regions of difference between the respective serogroups. Serogroups Australis and Serjoe genomes stood out for having insertions and deletions, respectively, mainly in chromosome 2. The L. borgpetersenii genome also presented great variation of composition, as expected for the species, which is provided by insertion sequences and transposition of mobile elements. The serogroups Canicola and Pomona presented higher proximity in the wgSNP analysis. Two plasmids were also identified in the serogroup Canicola genomes with high identity to the plasmids described in the Chinese strain of the same serovar. In the L. kirschneri species, the strain 47 (M36/05) presented high identity and synteny with the serovar Mozdok genomes, as expected, including the Brazilian strain of human origin. The strain 55 (M110/06) differed from other L. kirschneri genomes in both MLST and wgSNP. The Brazilian L. inadai genome presented high identity to the American reference of human origin including the presence of bacteriophage specific for the species. The distinction of the Brazilian L. santarosai strains in the MLST was also evidenced in the comparative analysis and in the wgSNP, and the strain 68 (M52 / 8-19), which showed no reactivity to the tested serogroups, also differs from the others reaffirming the possibility of a new serogroup/serovar. Therefore, the genomic study allowed the identification of particularities of Brazilian Leptospira strains, including the existence of extrachromosomal elements, proximity to strains of human origin indicating a greater risk for public health, in addition to the possibility of a new L. santarosai serogroup.