El presente trabajo está centrado en el análisis y modelización del metabolismo central de la levadura Pichia pastoris. Concretamente, el objetivo de este trabajo consistió en analizar la distribución de flujos en las principales vías metabólicas del metabolismo central de esta levadura mediante distintas aproximaciones experimentales y matemáticas basadas en un modelo metabólico estequiométrico y compartimentalizado. Los datos experimentales fueron obtenidos en su mayor parte del trabajo de tesis de A. Solà (Solà, 2004, tesis doctoral, Universitat Autònoma de Barcelona), centrado en experimentos de marcaje isotópico con 13C de cultivos de P. pastoris operados en quimiostato a μ=0,05 y 0,16 h-1 con diferentes fuentes de carbono (glucosa, glicerol, metanol y mezclas de glicerol/metanol). Los datos fisiológicos experimentalmente obtenidos en dicho estudio se han reconciliado a través de ecuaciones de balances elementales y por grado de reductancia; además, se ha propuesto una ecuación estequiométrica para la formación de biomasa para cada condición de cultivo estudiada. Los datos reconciliados a través de ecuaciones de balances elementales se han usado para el análisis de flujos metabólicos; en primer lugar, se ha utilizado la metodología clásica; los resultados obtenidos en esta primera aproximación se compararon con datos experimentales previamente obtenidos mediante técnicas de marcaje isotópico de 13C por A. Solà. El segundo estudio ha consistido en el cálculo de flujos metabólicos introduciendo restricciones derivadas de cocientes de flujos metabólicos estimados experimentalmente mediante técnicas de 13C-RMN. Dado el reducido número de restricciones derivadas de experimentos de 13C-RMN que se pueden aplicar en este modelo metabólico (3 o 4), en un tercer estudio se ha realizado una primera aproximación a metodologías de simulación y optimización del diseño de experimentos de marcaje isotópico con el objetivo de implementar un procedimiento experimental que permitiera obtener datos suficientes para determinar con más precisión los flujos a través de determinadas rutas de la red, particularmente los relacionados a la vía de las pentosas fosfato (PP). Concretamente, para explorar esta estrategia se han realizado estudios para la optimización de un experimento de marcaje para un cultivo operado en quimiostato utilizando glicerol como fuente de carbono a μ=0,05h-1; la estrategia de marcaje optimizada se llevó posteriormente a cabo en el laboratorio y se analizó los patrones de marcaje de los principales metabolitos (incluyendo algunos aminoácidos) y aminoácidos proteinogénicos mediante LC-MS/MS y 2D-RMN, respectivamente. Ello ha permitido comparar y combinar datos experimentales obtenidos mediante dos estrategias de análisis para la estimación de flujos metabólicos. Así, globalmente, este trabajo permite concluir que el análisis clásico de flujos metabólicos (MFA) es una herramienta de cálculo que está limitada a redes poco complejas; sin embargo cuando se aplican restricciones derivadas del análisis por 13C-RMN al MFA, se observa que esta metodología de análisis presenta alta sensibilidad para la determinación de distribución de flujos metabólicos en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA) y reacciones de transporte entre el citoplasma y la mitocondria. Por el contrario, utilizando una metodología de 13C-MFA basada en datos derivados de 13C-LC-MS, se observa que este método presenta poca sensibilidad en redes metabólicas compartimentalizadas, pues no permite distinguir los pools de metabolitos de un compartimiento dado (mitocondria/citoplasma). Sin embargo, este método presenta alta sensibilidad para la determinación de flujos a través de la vía de las PP. Así pues, la combinación de distintas metodologías basadas en datos de experimentos de marcaje isotópico ha permitido mejorar la información sobre el comportamiento del sistema. Finalmente, se ha llevado a cabo un análisis estructural de la red metabólica a través de la metodología del análisis de módulos elementales, así como una primera aproximación para su combinación con el análisis de flujos metabólicos basados en datos de marcaje isotópico con el objetivo de facilitar la interpretación fisiológica de los resultados, es decir, determinar cuales son las principales vías metabólicas activas bajo un estado fisiológico dado y cual es el flujo a través de dichas rutas. / This study is focused on the analysis and modelling of the central carbon metabolism of the yeast Pichia pastoris. In particular, the major aim of this study was to analyze de flux distribution through the main metabolic pathways of the central metabolism of this yeast by jeans of different experimental and mathematical approaches, based on a stoichiometric and compartmentalized metabolic model. Experimental data was mostly obtained from previous studies from A. Solà (Solà, 2004, PhD thesis, Universitat Autònoma de Barcelona), describing isotopic labelling experiments with 13C of P. pastoris cells growing on chemostat cultures at a growth rate of μ=0.05 and 0.16 h-1, on different carbon sources (glucose, glycerol, methanol and mixtures of glycerol/methanol). The experimental physiological data obtained in A. Solà's study have been reconciliated by means of elementary and grade of reductance balance equations; moreover, a stoichiometric equation for the formation of biomass has been proposed for each of the studied growth condition. The data reconciliated by elementary balance equations have been used for metabolic flux analysis. First, the classic metabolic flux analysis methodology has been applied; the obtained results in this first approximation were compared with the experimental data previously generated from 13C-labeling experiments by A. Solà. Second, metabolic fluxes have been calculated introducing a number of restrictions derived from metabolic flux ratios experimentally estimated by 13C-NMR. Third, given the reduced number of restrictions derived from these experiments that are actually aplicable to the defined metabolic model (3 or 4), we performed a first approximation to methodologies for simulation and optimisation of isotopic labeling experiments; the aim of such approach was to implement an experimental procedure to allow for the generation of labelling data needed for the precise determination of fluxes through some pathways of the network, particularly those related to the pentose phosphate pathway (PPP). In order to explore this strategy, studies for the optimisation of a labelling experiment of cells growing on glycerol in chemostat cultures at a growth rate of 0.05 h-1 were performed. The optimised labelling strategy was subsequently implemented in the laboratory; the labelling patterns of the major metabolites (including some amino acids) of the central carbon metabolism and, of the proteinogenic amino acids, were analysed by LC-MS/MS and 2D-NMR, respectively. This allowed us comparing and combining experimental labelling data derived from two analytical strategies for the calculation of metabolic fluxes. Overall, this study illustrates that classic metabolic flux análisis (MFA) is a mathematical tool limited to networks of low complexity. Nevertheless, when restrictions derived from 13C-NMR analyses are introduced MFA, this methodology shows a high sensitivity for the calculation of the metabolic flux distribution in the tricarboxylic acid cycle (TCA) and transport reactions of TCA intermediates between cytoplasm and mitochondria. In contrast, by using a 13C-MFA methodology using data derived from 13C-LC-MS, we observe that this method shows low sensitivity for compartimentalized metabolic networks, as it did not allow distinguishing pools of a given metabolite found in different compartments (e.g. mitochondria/cytoplasm). Nevertheless, this method shows high sensitivity for determining fluxes through the PPP. In summary, the combination of different methodologies based on the use of data obtained from isotopic labelling experiments has allowed us to improve the information on the system's behaviour. In addition, a structural analysis of the metabolic network has been performed using the methodology of elementary modes analysis; moreover, a first approximation to its combination with metabolic flux analysis based on 13C-derived data has been proposed, with the objective to facilitate the physiological interpretation of the results, i.e. to assess which are the major active pathways under a given physiological state and to calculate the carbon fluxes through these pathways.

Las dibenzo-p-dioxinas policloradas (PCDD) y dibenzofuranos (PCDF) son compuestos organoclorados tóxicos formados como productos secundarios de diversos procesos de la industria química y de combustión. La posición y el número de átomos de cloro en los anillos de benceno de las moléculas de PCDD/Fs conduce a 75 compuestos individuales o congéneres de PCDDs y 135 de PCDFs. Su elevado carácter lipofílico favorece que se acumulen en los suelos, sedimentos, plantas, tejido adiposo humano y animal. A partir de estudios de diversos episodios de contaminación, El Instituto de Medicina Norteamericano ha tenido especial evidencia de que la exposición a PCDD/Fs a través de la cadena alimenticia e inhalación provoca en el hombre diversos síntomas de toxicidad: cutáneos, sistémicos y neuro-psíquicos. En cuanto a los efectos carcinogénicos de la exposición al congénere TCCC, la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC) reclasificó esta substancia en 1997 desde el grupo II de su clasificación: "probable agente cancerígeno en humanos" al grupo I: "conocido agente cancerígeno en humanos". Se ha acordado expresar la concentración de una mezcla de congéneres en unidades equivalentes tóxicas internacionales de la 2,3,7,8-TCC, lo cual da una medidad de su potencial tóxico. Esta se calcula como resultado de sumar las concentraciones de cada congénere, que se obtienen a partir de los factores de equivalencia tóxica (TEFs).En los últimos años ha habido un desarrollo notable de métodos que han buscado ser una herramienta eficaz en la toma de decisiones en la gestión medioambiental. Los métodos Funciones de Daño son los más generalizados. Estos utilizan la variable concentración como cauce para determinar el impacto ocasionado por la contaminación. Sin embargo, el presente trabajo ha buscado ser una alternativa respecto a los métodos anteriores al incorporar la variable flujo de contaminantes como instrumento de sus cálculos. Se ha desarrollado y aplicado a la provincia de Tarragona una metodología de gestión medioambiental basada en las siguientes cuatro etapas: a) Realizar un inventario de fuentes de PCDD/Fs al aire, suelo y agua en la provincia de Tarragona: para determinar las cantidades de PCDD/Fs emitidas por las fuentes identificadas no ha sido posible en bastantes casos disponer de datos procedentes del propio foco emisor. En ese caso se ha recurrido a una extrapolación: el uso de factores de emisión y concentraciones procedentes de la bibliografía, y que son representativas de la clase industrial en estudio. Las emisiones totales de estimadas durante 1999 han sido una media de 175,7 g I-TEQ/año. b) La utilización del Análisis de Flujos de Substancias (AFS) ha llevado a compartimentalizar el sistema provincia de Tarragona en 30 subsistemas, con 88 flujos de entrada, salida e internos entre ellos. Se ha estimado el valor de todos los flujos de PCDD/Fs no medidos y se ha reconciliado -esto es: optimizado la incertidumbre- el valor de 32 flujos medidos. Una reducción completa de las emisiones industriales de PCDD/Fs conlleva una reducción del 1,7% en el flujo de acumulación en humanos.c) La evaluación de riesgos permite conocer los impactos debidos a cambios en la calidad medioambiental. El presente trabajo se ha centrado en impactos sobre la salud de la población, y dentro de ellos en los riesgos cancerígenos. La evaluación de riesgos ha concluido que la reducción del índice de riesgo cancerígeno anual en la población de la provincia de Tarragona, debida a una reducción total de las emisiones de dioxinas al aire en una específica planta industrial tiene una media de 0,30 casos/año. d) El Análisis Coste-Beneficio (ACB) ha concluido que en el caso americano, el proyecto de reducción de contaminación en la planta industrial es viable con una probabilidad del 15%, y en un contexto europeo no es en ningún caso viable. / Polychlorinated dibenzo-p-dioxins (PCDD) and dibenzofurans (PCDF) are ubitiquous organic pollutants. They are generated in small quantities as by-products of several chemical and combustion processes. The number and position of chlorine atoms at the benzene rings of PCDD/Fs molecules lead to 75 PCDDs individual compounds or congeners and 135 PCDFs congeners. Their high lypophilic character is the cause of their tedency to accumulate in soils, sediments, plants, animal and human adipose tissue. From several studies about impacts on humans to the congener 2,3,7,8-TCDD, the American Insitute of Medicine has described that there is evidence that exposure to this compound through the feeding chain and inhalation induces in humans several symptoms of toxicity: cloracne, systemic and neropsyquic. Respect to carcinogenic effects, the International Agency of Research on Cancer (IARC) reclassified in 1997 this congener from the group II of its classification: "a probable carcinogenic agent in humans" to the group I: "known carcinogenic agent in humans". Concentration of a mixture of congeners is the result of adding up concentrations of each congener, and it is expressed in international toxic equivalents of the 2,3,7,8-TCDD (I-TEQ), which gives a toxic potential of the mixture. It is obtained from the toxic equivalent factors (TEF).During the last decade there has been an important development of methodologies which have searched to be an efficient tool within environmental management. Damage Function methods are the most usual. These use the variable concentration as the way to fix the impact by pollution. Nevertheless, the present study has looked to be an alternative, by adding the variable flow of pollutants as a tool for its calculations. Then, it has been developed and applied to the area Tarragona province an environmental management methodolgy based on the following four steps:a) Drawing up an inventory of PCDD/Fs sources to air, soil and water in Tarragona province. In order to know amounts of PCDD/Fs released to the environment by the identified sources, it has not been possible in many cases to have data coming from the own focus. In these cases, it has been resorted to an extrapolation: the use of emission factors and concentrations, which come from the literature and are representative of the industrial class in study. Global estimated emissions to air, land and water in 1999 were a mean of 175,7 g I-TEQ/year.b) The use of Substance Flow Analysis (SFA) has led to compartimentalize Tarragona province system into 30 environmental subsystems, with 88 input, ouptut and internal flows among them. It has been estimated the value of all non-measured flows, and reconciliated -i.e.: opitmization of uncertainty- of 32 measured flows. A complete reduction of industrial PCDD/Fs emissions implies a 1,7% reduction of the flow "accumulation in human adipose tissue".c) A risk assessment allows to estimate the impacts on population due to changes in environmental quality. The present study has focused on human health impacts, and inside them on carcinogenic risk, as a result of a reduction of PCDD/Fs emissions to air. The risk assessment has concluded that the reduction of the annual cancer risk rate for all the population, as a result of a total reduction of dioxin emissions to air in a specific industrial plant, has a meanvalue of 0,30 cases/year.d) As a final step, a Cost-Benefit Analysis (ACB) has concluded that in an american environment, the project of PCDD/Fs reduction in the plant is feasible only with a 15% probability, while in a european environment the project is in any way viable.