La Peste dei Piccoli Ruminanti (PPR) è una patologia virale ed acuta che colpisce i piccoli ruminanti, diffusa in Africa Sub-Sahariana, in Medio Oriente ed in Asia Meridionale. Questo lavoro si propone di effettuare il primo studio epidemiologico sulla PPR nella Repubblica Araba Saharawi Democratica (RASD), che comprende i Campi Profughi Saharawi, in territorio algerino, ed i “Territori Liberati” del Sahara Occidentale, valutando la potenziale presenza, prevalenza e distribuzione del virus della PPR in questi territori. Lo studio si è basato su una metodica di campionamento “a cluster” secondo la tecnica “a due stadi”. Sono stati individuati 23 siti di campionamento dai quali sono stati raccolti un totale di 976 campioni di siero prelevati da pecore, capre e cammelli. I campioni sono stati prelevati in Marzo ed Aprile 2008. I risultati dei test Competitive-Elisa hanno evidenziato una sieroprevalenza nel 28,26% degli animali testati, benché durante la raccolta dei campioni nessun animale abbia presentato sintomi clinici riferibili alla PPR. Tra Gennaio e Maggio 2010, in seguito ad episodi di aumentata mortalità nella popolazione ovi-caprina presente nei Campi Profughi, le autorità veterinarie locali sospettarono un outbreak di PPR. Tra Maggio ed Ottobre 2010 è stato sviluppato un outbreak investigation nei Campi Profughi Saharawi con lo scopo di confermare la circolazione del PPRV. I risultati di laboratorio hanno confermato la presenza del virus nel 33,33% dei campioni. Il sequenziamento del genoma virale ha rivelato che il virus apparteneva al Lignaggio 4 e le analisi filogenetiche hanno indicato una stretta relazione (99.3%) con il PPRV isolato durante l'epidemia di PPR in Marocco del 2008. / Peste des Petitis Ruminants (PPR) is an acute viral disease affecting small ruminants and widespread in Sub-Saharan Africa, Middle East and South Asia. This study aims to perform the first epidemiological survey on PPR in the Sahrawi Arab Democratic Republic (SADR), including Sahrawi Refugees Camps, western Algeria, and “Liberated Territories” of Western Sahara, assessing the potential presence, prevalence and distribution of the PPRV in these territories. The survey was based on a two-stage cluster sampling methodology. 23 clusters were identified, leading to a total of 976 serum samples collected from sheep, goats and camels (March/April 2008). The results of Competitive-Elisa tests evidenced a serological positive prevalence in 28,26% of the tested animal, even though during the collection no animal presented clinical signs related to the subjected disease. A major number of positive animals was revealed in goats and sheep, with higher prevalence in subjects over 36 moths of age. One positive case was reported also in camels. Following reports of increased mortality in the small ruminant population of the Sahrawi Refugees Camps, between January and May 2010, local veterinary authorities suspected an outbreak of PPR. Between May and October 2010 an outbreak investigation was implemented in the Sahrawi Refugee Camps, with the objective of confirming the circulation of the Peste des Petits Ruminants virus (PPRV). Laboratory results confirmed the presence of PPRV in 33.33% of the samples. Sequence analysis revealed that the virus belonged to Lineage IV and phylogenetic analysis indicated a close relationship (99.3%) with the PPRV isolated during the Moroccan outbreak in 2008.

Il virus dell’Epatite E (HEV) e i calicivirus (norovirus e sapovirus) causano rispettivamente epatite acuta e gastroenterite. Questi virus sono considerati agenti eziologici emergenti rappresentando un problema di sanità pubblica e di sicurezza alimentare. Per HEV, è ormai confermata la trasmissione zoonotica, e il suino è considerato il principale serbatoio asintomatico. Norovirus e sapovirus infettano sia i bambini che gli adulti. Sebbene questi virus siano stati identificati anche negli animali, la possibile trasmissione zoonotica non è stata dimostrata in modo conclusivo. Il lavoro sperimentale condotto durante il Dottorato di Ricerca è stato focalizzato sullo studio degli aspetti biologici ed epidemiologici dell’infezioni causate da HEV e da calicivirus. Per la prima volta in Italia, i risultati ottenuti hanno dimostrato la presenza del virus HEV nei fegati di suini in fase di macellazione ed hanno confermato, attraverso la ricerca di anticorpi, un’elevata esposizione degli animali al virus. Inoltre, mediante la produzione di antigeni e reattivi immunologici, sono stati messi a punto test diagnostici per la ricerca di anticorpi contro HEV nel suino e nei cinghiali. Il lavoro svolto per la ricerca di calicivirus nel suino e nel bovino ha dimostrato la circolazione dei sapovirus in popolazioni di suini asintomatici e la presenza di norovirus nei vitelli affetti da diarrea acuta.Sono stati inoltre sviluppati reattivi immunologici, utilizzando proteine del capside di norovirus umano e bovino espresse con il sistema ricombinante baculovirus. Questi hanno permesso di evidenziare la presenza di anticorpi contro norovirus umano e bovino, in sieri di veterinari professionalmente esposti. Inoltre, sono stati utilizzati per sviluppare metodi per la concentrazione dei virus da matrici a bassa concentrazione.Infine, le VLP sono state utilizzate per valutare l’attivazione del sistema immunitario umano ex vivo. I risultati hanno dimostrato che le VLP di NoV stimolano il sistema immunitario attivando risposte di tipo Th1 e Th2 . / Hepatitis E virus (HEV) and caliciviruses (norovirus and sapovirus) are associated with acute hepatitis and gastroenteritis, respectively. These viruses are considered as emerging agents, and may represent a major concern for public health and food safety. Hepatitis E was first recognized as a disease in developing countries, but an increasing number of sporadic cases have also been reported in industrialized countries. A zoonotic transmission of HEV is now recognized, and the pig is considered to be the asymptomatic reservoir.Norovirus and sapovirus affect both children and adults. Norovirus and sapovirus also infect animals, and their zoonotic transmission has been assumed, although not conclusively proved. This thesis is focused on the biology and epidemiology of HEV and calicivirus infections. During this PhD, HEV was detected in liver from pigs at slaughterhouse. A high antibody seroprevalence was also detected, confirming frequent exposure of swine to HEV. To improve serum antibody detection in swine, several tools were produced within this thesis, and used to develop diagnostic tests, such as ELISA and Western blotting. Detection of anti-HEV antibodies in pigs and wild boars was assessed using antigen and immunological reagents produced. Investigation of caliciviruses in swine and cattle specifically supports a large circulation of sapovirus in asymptomatic pigs, and confirms presence of norovirus in cattle affected with diarrhea. Human norovirus were further investigated, producing immunological reagents against bovine and human recombinant capsid antigens. Presence of anti-human and bovine norovirus antibodies was shown in sera of veterinarians. An immuno-concentration assay was also developed, and used in a pilot experiment with two different norovirus genotypes, confirming its possible use for virus concentration from diluted environmental samples. Human VLPs were used to investigate the activation of human immune system ex-vivo. Results showed that NoV VLPs stimulated the immune system by activating both Th1 and Th2 responses.

The ingestion of a meal evokes a series of digestive processes, which consist of the essential functions of the digestive system: food transport, secretory activity, absorption of nutrients and the expulsion of undigested residues do not absorbed. The gastrointestinal chemosensitivity is characterized by cellular elements of the endocrine gastrointestinal mucosa and nerve fibers, in particular of vagal nature. A wide range of mediators endocrine and/or paracrine can be released from various endocrine cells in response to nutrients in the diet. These hormones, in addition to their direct activity, act through specific receptors activating some of the most important functions in the control of energy intake and energy homeostasis in the body. For integration of this complex system of control of gastrointestinal chemosensitivity, recent evidence demonstrates the presence of taste receptors (TR) belonging to the family of G proteins coupled receptor expressed in the mucosa of the gastrointestinal tract of different mammals and human. This thesis is divided into several research projects that have been conceived in order to clarify the relationship between TR and nutrients. To define this relationship I have used various scientific approaches, which have gone on to evaluate changes in signal molecules of TR, in particular of the α-transducin in the fasting state and after refeeding with standard diet in the gastrointestinal tract of the pig, the mapping of the same molecule signal in the gastrointestinal tract of fish (Dicentrarchus labrax), the signaling pathway of bitter TR in the STC-1 endocrine cell line and finally the involvement of bitter TR in particular of T2R38 in patients with an excessive caloric intake. The results showed how there is a close correlation between nutrients, TR and hormonal release and how they are useful both in taste perception but also likely to be involved in chronic diseases such as obesity. / L’ingestione di un pasto evoca una serie di processi digestivi che consistono nelle funzioni essenziali dell’apparato digerente, trasporto degli alimenti, attività secretiva, assorbimento dei nutrienti digeriti e l’espulsione dei residui non assorbiti. La gastrointestinal chemosensitivity è caratterizzata da elementi cellulari endocrini della mucosa gastroenterica e da fibre nervose, soprattutto di natura vagale. Una ampia gamma di mediatori endocrini e/o paracrini possono essere rilasciati da varie cellule endocrine in risposta a nutrienti introdotti con la dieta. Tali ormoni, oltre alla loro attività diretta, agiscono attraverso recettori specifici attivando azioni di assoluta importanza nel controllo di varie funzioni tra cui l’introito calorico e l’omeostasi energetica dell’organismo. Ad integrazione di questo complesso sistema di controllo della chemosensitività gastrointestinale, recenti evidenze dimostrano la presenza di recettori del gusto (o taste receptors, TR) appartenenti alla famiglia dei recettori correlati alle proteine G espressi a livello della mucosa del tratto gastrointestinale di diversi mammiferi e dell’uomo. La presente ricerca, suddivisa in diversi progetti di ricerca, è stata concepita al fine di chiarire il rapporto tra TR e nutrienti. Per definire questo rapporto sono stati usati diversi approcci scientifici, che sono andati a valutare le variazioni delle molecole segnale dei TR in particolare dell’α-transducina in condizioni di digiuno e a seguito di rialimentazione standard nel tratto gastrointestinale di suino, la mappatura della stessa molecola segnale nel tratto gastrointestinale di pesce (Dicentrarchus Labrax), il signaling pathway dei bitter TR in colture cellulari endocrine STC-1 ed infine il coinvolgimento dei bitter TR, in particolare del T2R38 in pazienti con un eccessivo introito calorico. I risultati hanno evidenziato come ci sia una stretta correlazione tra nutrienti, TR e rilascio ormonale e come questi siano coinvolti non solo nella percezione del gusto propriamente detto ma probabilmente anche in patologie croniche come l’obesità.

Nel presente studio ci si è proposti di valutare la presenza e diffusione della leishmaniosi in una provincia dell’Italia centrale (Rieti) che, per caratteristiche ambientali (prevalentemente montuosa, clima freddo-secco) poco sembra prestarsi al ciclo della malattia. A questo scopo sono stati calcolati: i) sieroprevalenza grezza nella popolazione canina (2006-2013) e prevalenza media annuale ii) casi di leishmaniosi viscerale (LV) e cutanea (LC) (2000-2013). Catture di flebotomi sono state effettuate per due stagioni consecutive (2011-2012) per ogni sito sono stati registrati i dati climatici (temperatura, umidità etc.) ed altitudine. I flebotomi sono stati sottoposti a ricerca di Leishmania mediante PCR. La sieroprevalenza grezza per leishmania varia da 0 a 76,9% e la prevalenza media annuale non presenta un trend lineare. Sono stati registrati 6 casi di LV tutti in pazienti italiani tutti residenti in provincia di Rieti. I flebotomi sono stati rilevati in 5 dei 6 siti monitorati fino agli 800 m s.l.m., seppur con basse densità. Sono state identificate le seguenti specie: P. perniciosus (6,4 %), P. perfiliewi (1,8%), P. mascittii (0,1%) e S. minuta (91,7 %). E’ stata rilevata una correlazione statisticamente significativa (r=0,69, p<0,001) tra numero di flebotomi e temperatura giornaliera (Tmed°C) ed una correlazione negativa significativa (r= -0,51, p<0,05) con l’umidità relativa (Umed%). La ricerca di leishmania ha dato esito negativo in tutti i flebotomi analizzati. Questi rilievi suggeriscono l’endemia della leishmaniosi nella provincia di Rieti. / The aim of this study is to describe the presence and diffusion of leishmaniasis in a province of Central Italy (Rieti) not optimal for the disease transmission for its environmental conditions (dry-cold weather, 70% highlands). We estimated i) Canine raw seroprevalence (2006-2013) and mean annual prevalence ii) cases of visceral and cutaneous leishmaniasis (VL, CL) (2000-2013). Phlebotomine sand flies were trapped during two seasons (2011-2012) and meteorological data and altitude were recorded for each site. The phlebotomines were submitted to Leishmania spp detection by PCR. The raw seroprevalence ranged from 0-76,9% and the mean annual prevalence does not show a linear trend. Six cases of VL were detected in italian patients who reside in the province. Phlebotomine sand flies were found in 5/6 sites until 800 m above s.l., with low density. Four species were identified: P. perniciosus (6,4 %), P. perfiliewi (1,8%), P. mascittii (0,1%) and S. minuta (91,7 %). The number of phlebotomines resulted positively correlated (r=0,69, p<0,001) with the mean daily temperature (Tmed°C) while a significant negative correlation (r= -0,51, p<0,05) was found with mean relative humidity (Umed%). Leishmania spp. was not detected. These findings suggest the endemic status of leishmaniasis in the province.

I prioni, privi di acidi nucleici, esistono come ceppi e possono mutare, in particolare quando attraversano una barriera di specie. Numerosi studi convergono sulla conclusione che le caratteristiche ceppo-specifiche siano inscritte nella conformazione della PrPSc, con la variabilità di ceppo associata a varianti conformazionali della PrPSc. In questo studio ci siamo avvalsi del PMCA, tecnica che riproduce in vitro molti aspetti della biologia dei prioni, per mettere a punto condizioni sperimentali di replicazione che permettessero di osservare fenomeni di mutazione e selezione, onde investigare i meccanismi molecolari e di popolazione alla base della mutabilità dei prioni. In condizioni di replicazione eterologa, che mima la trasmissione tra diverse specie, è stato inizialmente possibile identificare un mutante difettivo della scrapie, caratterizzato da una diversa conformazione della PrPSc e capace di replicare in vitro ma non più in vivo. Le condizioni in cui tale mutante è emerso hanno permesso di sviluppare ulteriori ipotesi di lavoro, basate sul concetto della quasi-specie. Impartendo diversi regimi di replicazione e seguendo l’evoluzione di due ceppi, è stato possibile evidenziare fenomeni di mutazione anche in condizioni di replicazione omologa, in assenza di forti pressioni selettive. In entrambi i ceppi sono emerse varianti conformazionali di PrPSc durante passaggi replicativi ad ampia popolazione, mentre le popolazioni sottoposte a ripetuti colli di bottiglia hanno mostrato un rapido declino del tasso di replicazione. Sono stati infine investigati l’efficacia e il potenziale mutageno di molecole anti-prioniche, ottenendo importanti risultati preliminari sull’efficacia di molecole che legano la PrPC. Questi risultati evidenziano come la mutabilità sia una caratteristica intrinseca dei prioni e supportano l’idea che i prioni siano molto variabili, similmente alle quasi-specie virali, e perciò adattabili e proni a fenomeni di mutazione e selezione. Tali conclusioni hanno impatto su problematiche sanitarie quali lo studio del potenziale zoonotico e i fenomeni di farmaco-resistenza dei prioni. / Despite the absence of a nucleic acid encoding the genetic information, prions exist as strains, that are characterized by distinctive biochemical and biological features and are able to mutate, mostly during inter-species transmissions. It is now widely accepted that different strains are associated with different PrPSc conformations and that the strain variation is due to modification of PrPSc conformation. Taking advantage of PMCA, an in vitro technique that reproduces several aspects of prion biology, we developed an in vitro set-up to mimic prion strain mutation and selection and to investigate the molecular mechanisms underlying prion mutability. During heterologous PMCA replications, i.e. that mimic inter-species transmission, a defective scrapie mutant, characterized by a different PrPSc conformation and able to replicate in vitro but not in vivo, was identified. The fact that the defective mutant arose only from an highly diluted inoculum, resembling the emergence of defective genotypes in viral quasi-species population after subsequent plaque-to-plaque transfers or bottleneck events, led us to evaluate prion ability to mutate during homologous PMCA replications and without selective pressure, only submitting prion strains to different passage regimens. In both strains, PrPSc conformational variants were identified only after large population passages, while repeated bottleneck events caused a rapid decline in amplification rates. Lastly, we evaluate the ability of some anti-prion compounds to inhibit PrPSc in vitro amplification and their potential role in inducing drug-resistant prions, pointing out the worth use of PrPC as a therapy target. The data support the view that mutability is an intrinsic property of prions and that prions constitute quasi-species populations subjected to mutation and selective amplification, thus able to change their “phenotype” in response to changes in the environment. These findings have obvious significant implications in public health, raising concern about the real zoonotic potential of prion strains and TSE therapeutic approaches.

The increase in aquaculture operations worldwide has provided new opportunities for the transmission of aquatic viruses. The occurrence of viral diseases remains a significant limiting factor in aquaculture production and for the sustainability. The ability to identify quickly the presence/absence of a pathogenic organism in fish would have significant advantages for the aquaculture systems. Several molecular methods have found successful application in fish pathology both for confirmatory diagnosis of overt diseases and for detection of asymptomatic infections. However, a lot of different variants occur among fish host species and virus strains and consequently specific methods need to be developed and optimized for each pathogen and often also for each host species. The first chapter of this PhD thesis presents a complete description of the major viruses that infect fish and provides a relevant information regarding the most common methods and emerging technologies for the molecular diagnosis of viral diseases of fish. The development and application of a real time PCR assay for the detection and quantification of lymphocystivirus was described in the second chapter. It showed to be highly sensitive, specific, reproducible and versatile for the detection and quantitation of lymphocystivirus. The use of this technique can find multiple application such as asymptomatic carrier detection or pathogenesis studies of different LCDV strains. The third chapter, a multiplex RT-PCR (mRT-PCR) assay was developed for the simultaneous detection of viral haemorrhagic septicaemia (VHS), infectious haematopoietic necrosis (IHN), infectious pancreatic necrosis (IPN) and sleeping disease (SD) in a single assay. This method was able to efficiently detect the viral RNA in tissue samples, showing the presence of single infections and co-infections in rainbow trout samples. The mRT-PCR method was revealed to be an accurate and fast method to support traditional diagnostic techniques in the diagnosis of major viral diseases of rainbow trout.

Poiché le infestazioni parassitarie dei rettili in cattività possono incidere sulla loro salute, è stato condotto uno studio sui parassiti intestinali e gli ectoparassiti su 213 rettili del Bioparco di Roma. In cattività, dove gli animali sono confinati in piccoli spazi, la concentrazione di parassiti può essere più alta. Alcuni di essi sono innocui, ma altri, specialmente in associazione allo stress, possono essere pericolosi, causare malattie e portare anche alla morte se non trattati. Inoltre, i rettili parassitati hanno una vita più breve, sono più suscettibili ad altre malattie, hanno scarsa fertilità, ridotta crescita ed alta mortalità. Tra Gennaio 2012 e Dicembre 2014 sono stati raccolti campioni da 213 rettili che non mostravano alcun segno clinico e che includevano 23 specie di sauri, 20 specie di cheloni, 20 specie di ofidi e 4 specie di alligatori. I campioni sono stati esaminati per la presenza di parassiti intestinali mediante copromicroscopia di tipo qualitativo previa sedimentazione e successiva flottazione, mentre la tecnica di Zihel-Neelsen è stata usata per la ricerca di oocisti di Cryptosporidium . I campioni di feci sottoposti ad esame copromicroscopico qualitativo sono risultati positivi per almeno una tipologia di endoparassiti nel 49% dei casi. Il 35% dei campioni è risultato positivo per ossiuri, il 22% per coccidi, l’1% per strongili ed il 5% per ascaridi. Degli strisci fecali colorati con la tecnica di Zihel-Neelsen, il 25% sono risultati positivi per Cryptosporidium spp. Ossiuri e coccidi sono stati più prevalenti nei sauri rispetto ai cheloni, agli ofidi e agli alligatori e nel 14% è stata osservata la presenza di entrambi. Inoltre, per quanto riguarda gli ectoparassiti, sono state rilevate uova di Myocoptes musculinus nel 24% dei rettili esaminati. Tutti gli strisci risultati positivi per Cryptosporidium spp. sono stati inviati all’Università di Santiago de Compostela per essere sottoposti alla tecnica PCR. / Since parasitic infestations of captive reptiles can impact their health, a study for intestinal parasites and ectoparasites was conducted on 213 reptiles housed at Bioparco of Rome, that 300 reptiles of 60 different species. In captivity, where animals are confined in small spaces, the concentration of parasites may be much higher. Some of them are harmless but others, especially in association with stress, can be dangerous, causing severe diseases and even death if intreated. Additionally, parasitized reptiles have a shorter life span, are more susceptible to other diseases, have poor fertility, high mortality and reduced growth. Between January 2012 and December 2014 faecal samples werw ollected from 213 reptiles not showing any clinical signs, including 23 saurian species, 20 chelonian species, 20 ophidian species and 4 alligatorian species. Samples were examined for the presence of intestinal parasites by direct smear and faecal flotation, while Zihel-Neelsen technique were used to reveal the presence of Cryptosporidium oocysts. Overall, 49% of the reptiles were harbouring intestinal parasites. These included oxyurids (35%), coccidia (22%), strongyles (1%), ascarids (5%), Cryptosporidium (25%). Oxyurids and coccidia were more prevalent in saurian than in ophidian, chelonian and alligatorian, while, of the reptiles screened, 14% carried both types and 1% harbored strongyles. Moreover, Myocoptes musculinus eggs werw detected in 24% of reptiles. Finally, those samples in which Cryptosporidium was detected , were sended to Santiago de Compostela University for PCR procedures.

Il trigono della vescica urinaria (UBT) è un'area limitata attraverso la quale penetrano nella vescica la maggior parte dei vasi e fibre e in cui le fibre nervose e neuroni intramurali sono più concentrati. Mediante l’utilizzo combinato di un tracciante retrogrado(FB) e dell’immunoistochimica sono stati valutati il fenotipo e l’area del soma dei neuroni dei gangli spinali (DRG), dei neuroni post-gangliari, il fenotipo dei gangli della catena simpatica (STG) e i gangli mesenterici caudali (CMG) innervanti l’UBT. - Caratterizzazione dei neuroni dei DRG con: peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP)(30±3%, 29±3%, rispettivamente), sostanza P(SP)(26±8%, 27±12%), ossido nitrico sintasi neuronale (nNOS)(21±4%; 26±7%), neurofilamento 200kDa (NF200)(75±14%, 81±7% ) , transient receptor potential vanilloid1 (TRPV1)(48±13%, 43±6%) e isolectina-B4-positivi (IB4) (56±6%;43±10%). I neuroni sensoriali, distribuiti da L2 a Ca1 (DRG), hanno presentato una localizzazione segmentale, mostrando maggior densità nei DRG L4-L5 e S2-S4. I neuroni sensoriali lombari sono risultati significativamente più grandi di quelle sacrali (1.112±624μm2 vs716±421μm2). Complessivamente, questi dati indicano che le vie lombari e sacrali probabilmente svolgono ruoli diversi nella trasmissione sensitiva del trigono della vescica urinaria. -I neuroni FB+ della STG e dei CMG sono risultati immunoreattivi per la tirosina idrossilasi (TH)(66±10,1%, 53±8,2%, rispettivamente), la dopamina beta-idrossilasi (DβH)(62±6,2%, 52±6,2%), neuropeptideY (NPY)(59±8%; 66±7%), CGRP(24±3%, 22±3%), SP(22±2%; 38±8%), polipeptide intestinale vasoattivo (VIP)(19±2%; 35±4%), nNOS(15±2%; 33±8%), trasportatore vescicolare dell'acetilcolina (VAChT)(15±2%; 35±5%), leu-encefalina (LENK)(14±7%; 26±9%), e somatostatina (SOM)(12±3%;32±7%).Il numero medio di neuroni FB+ (1845,1±259,3) era nella STG in L1-S3, con i pirenofori più piccoli (465,6±82.7μm2). Un gran numero (4287,5±1450,6) di neuroni FB+ di piccole dimensioni (476,1±103,9μm2) sono stati localizzati lungo il margine dei CMG. Il maggior numero (4793,3±1990,8) di neuroni FB + è stato osservato nel plesso pelvico, dove i neuroni marcati erano raggruppati in micro-gangli e con pirenoforo ancora più piccolo (374,9±85,4 μm2). / The urinary bladder trigone (UBT) is a limited area through which the majority of vessels and nerve fibers penetrate into the urinary bladder and where nerve fibers and intramural neurons are more concentrated. The phenotype and soma cross-sectional area of dorsal root ganglion (DRG) neurons, the extramural post-ganglionic autonomic neurons, the phenotype of sympathetic trunk ganglia (STG) neurons and caudal mesenteric ganglia (CMG) neurons innervating the porcine UBT were evaluated by coupling retrograde tracer technique and immunohistochemistry. -Porcine lumbosacral DRG neurons were characterized neurochemically: calcitonin gene-related peptide (CGRP)(30±3%; 29±3%, respectively), substance P (SP)(26±8%; 27±12%), neuronal nitric oxide synthase (nNOS)(21±4% and; 26±7%), neurofilament200kDa (NF200)(75±14%; 81±7%), and transient receptor potential vanilloid1 (TRPV1)(48±13%; 43±6%), and labeled for isolectin-B4 (IB4)(56±6%; 43±10%). UBT sensory neurons, which were distributed from L2 to Ca1 DRG, had a segmental localization, showing their highest density in L4–L5 and S2–S4 DRG. The lumbar UBT sensory neurons were significantly larger than sacral ones (1,112±624µm2 vs. 716±421µm2). Taken together, these data indicate that the lumbar and sacral pathways probably play different roles in sensory transmission from the UBT. -STG and CMG FB+ neurons were IR for tyrosine hydroxylase (TH)(66±10.1%; 52.7±8.2%, respectively), dopamine beta-hydroxylase (DβH)(62±6.2%; 52±6.2%), neuropeptide Y (NPY)(59±8%; 66±7%), CGRP (24±3%; 22±3%), SP (22±2%; 38±8%), vasoactive intestinal polypeptide (VIP)(19±2%; 35±4%), nNOS (15±2%; 33±8%), vesicular acetylcholine transporter (VAChT)(15±2%; 35±5%), leuenkephalin (LENK)(14±7%; 26±9%), and somatostatin (SOM)(12±3%; 32±7%). A mean number of 1845.1±259.3 FB+ neurons were localized in the L1-S3 STG, which appeared as small pericarya (465.6±82.7µm2). A large number (4287.5±1450.6) of small (476.1±103.9µm2) FB+ neurons were localized mainly along a border of both CMG. The largest number (4793.3±1990.8) of FB+ neurons was observed in the pelvic plexus (PP), where labeled neurons were often clustered within different microganglia and had smaller soma cross-sectional area (374.9±85.4 µm2).

L’ampliamento dello spettro d’ospite è strettamente connesso al processo evolutivo a cui i virus sono assoggettati e rappresenta una notevole sfida alla loro capacità di adattarsi. L’attitudine a superare le barriere di specie è conseguente alla costante e relativamente rapida evoluzione che caratterizza i virus; allo stesso tempo, la forza selettiva esercitata dal nuovo ospite rappresenterà un ulteriore stimolo per le capacità adattative del virus. Ad oggi, i meccanismi genetici ed evolutivi responsabili del salto di specie virale, cioè la trasmissione di un virus da un ospite tradizionale ad uno precedentemente resistente all’infezione, sono parzialmente sconosciuti. Nel seguente lavoro verranno presentati gli studi effettuati sulle dinamiche evolutive caratterizzanti virus a RNA e a DNA in cui si sono osservate variazioni dello spettro d’ospite. Gli studi hanno riguardato i coronavirus, con particolare riferimento al ruolo svolto dai pipistrelli nell’evoluzione dei coronavirus SARS-correlati, e l’importanza del gatto nell’evoluzione dei parvovirus dei carnivori. Nella prima sezione saranno mostrate le correlazioni genetiche dei coronavirus identificati in Italia nei pipistrelli appartenenti alla specie Rhinolophus ferrumequinum con i ceppi europei e del resto del mondo, allo scopo di chiarire l’origine evolutiva dei coronavirus dei pipistrelli correlati al virus della SARS (Bat-SARS-like CoV) europei, gli eventi migratori che hanno caratterizzato la loro diffusione nel continente e le potenziali ripercussioni sulla salute pubblica. Nella seconda sezione saranno evidenziate le caratteristiche molecolari dei ceppi di parvovirus circolanti nella popolazione felina, valutandone la diversità di sequenza e la complessità genetica, allo scopo di ottenere importanti informazioni in merito all’evoluzione del virus e alle interazioni tra il parvovirus e l’ospite. / The cross-species transmission is closely related to viral evolution and represents a challenge for viral adaptability. The capacity to overcome the species barriers is due to the constant and relatively rapid evolution that characterizes the viruses. At the same time, the selective force exerted by the new host will provide a further stimulus for the adaptive capacity of the virus. To date, the genetic and evolutionary mechanisms responsible for the species jump, namely the transmission of a virus from the traditional host to a new host previously resistant to infection, are partially unknowns. Aim of this work is to present studies conducted on the evolutionary dynamics characterizing RNA and DNA viruses subjected to cross-species transmission. Research has been done on coronavirus, focusing on the role played by bats in the evolution of SARS-related coronavirus, and on parvovirus, specifically on the role of the cat in carnivores parvoviruses evolution. The first section will show the genetic correlations between coronaviruses identified in Italy in Rhinolophus ferrumequinum bats, with strains identified in Europe and in the rest of the world, in order to clarify the evolutionary origin of the bat coronaviruses related to SARS virus (Bat-SARS-like CoV) in our continent, the migratory events that have characterized their spread, and their potential impact on public health. In the second section the molecular characteristics of the strains of parvovirus circulating in cats population will be highlighted, evaluating their sequence diversity and genetic complexity, in order to obtain important information on viral evolution and interactions between parvovirus and host.

Scopo del lavoro della presente tesi è stato quello di valutare la prevalenza di Chlamydiaceae, ed in particolare Chlamydia psittaci, in una popolazione aviare con caratteristiche sinantropiche quale il colombo di città (Columba livia var. domestica) dell’areale veneziano. Per evidenziare il patogeno sono state utilizzate metodiche sierologiche, d’isolamento e biomolecolari tradizionali. Contestualmente, mediante tecnologie molecolari innovative, quali microarray ed MLVA (Multilocus VNTR Assay) sono stati valutati i genotipi di C. psittaci e le eventuali altre specie di Chlamydia presenti in tale popolazione. Inoltre, si è proceduto ad una classificazione delle lesioni anatomo-patologiche ed ad una loro correlazione con la presenza del patogeno. I risultati dimostrano che la prevalenza di C. psittaci nella popolazione oggetto dello studio è del 10%. Durante tale studio è stata dimostrata la presenza di un ceppo di C. psittaci atipico, in quanto non classificabile con le attuali tecniche a disposizione. La genotipizzazione dei ceppi di C. psittaci conferma la presenza nel colombo di città del genotipo B, E ed E/B, che solitamente risultano essere coinvolti con minore frequenza in episodi di infezione umana. Inoltre sono stati dimostrati alcuni ceppi classificati come Chlamydia spp., in quanto le metodologie applicate e le conoscenze attuali non permettono ulteriori distinzioni, prospettando la possibilità di un nuovo ceppo. Infine, attraverso l’analisi dei dati raccolti durante la prima fase di campionamenti e successivamente confermati durante la seconda fase, siamo riusciti a strutturare un sistema di selezione, basato su caratteristiche funzionali ed anatomopatologiche, che permette di selezionare in sede necroscopica i colombi molto probabilmente infetti, permettendo conseguentemente una migliore organizzazione e gestione dei campioni di interesse contenendo nel contempo i costi ma mantenendo elevati gli standards diagnostici. / The aim of this thesis was to evaluate the prevalence of Chlamydiaceae, in particular of C. psittaci, in sinanthropic birds such as urban pigeons (Columba livia var. domestica) in some areas of Venice. The pathogen was detected with serological, molecular, and traditional culture methods. Innovative molecular tools, such as microarray and MLVA (Multilocus VNTR Assay), were applied in this study in order to evaluate the genotypes of C. psittaci and the other species of Chlamydia present in this avian population to assess the risk of zoonosis posed by pigeons in this urban area. Moreover, we classified and correlated the anatomical and pathological lesions with the pathogen. Our results showed the presence of C. psittaci in urban population of pigeons in Venice, with a prevalence of 10%. We also demonstrated an atypical strain of C. psittaci not yet classified with the available laboratory techniques. Genotyping revealed the presence of genotypes B, E and E/B. This genotypes could be considered less frequently involved in cases of human infection. Additionally, we found other Chlamydia strains suggesting the presence of a new Chlamydia genotype. Finally, the elaboration of the data, collected during the first and second sampling phase, revealed a correlation between C. psittaci and adult females pigeons, presenting hepatomegaly. Based on this results we develop and adopted a diagnostic protocol during necropsy that allows to select pigeons, which have a higher probability to be infected, and a better organization and management of interests samples, containing the economic costs and maintaining high-level of the diagnostic standards.