Ionic Liquids (ILs) has been attracting attention, both from academia and industry, given the numerous applications of these systems. ILs are salts, usually composed by an organic ion, and a counterion which could be organic or inorganic, and, interestingly they are found at liquid state at room temperature. Our interest in studying ILs comes from its low toxicity. Some recent studies have shown that the toxicity of the ILs ishigher than believed, in particular for biologically relevant systems. The main goal of this research is to study the influence of the ionic liquid 1-tetradecyl-3-methylimidazolium chloride ([C14MIM][Cl]) with membrane systems. To do so, we made use of different lipids: POPC, Sphingomyelin, Cholesterol, POPG, DPPC, DPPG and DMPC. For each of these systems, the influence of ILs concentration were elucidated by means of a systematic study through different experimental techniques: Small Angle X-ray scattering (SAXS), dynamic light scattering (DLS), fluorescence anisotropy, optical microscopy and z-potential. Since [C14MIM][Cl] has a positive charge on the imidazolium group, the superficial charge of all vesicles increased. For zwitterionic vesicles no significant change in size and melting temperature were noticed. The imidazolium-based ionic liquid diminished the gel-fluid transition temperature for negatively charged lipids. For DPPC:DPPG (1:1), for instance, the transition temperature decreased from 42.50±0.13oC to 25.27±0.33oC and for DPPG from 46.12±0.22 oC to 36.6±0.38 oC. For DPPG, the vesicle hydrodynamic diameter increased from 84±0.1nm to 176±0.1nm, whereas for DPPC:DPPG it increased from 95±0.1nm to 196±0.1nm. The electronic density profile, obtained by SAXS, supported the penetration of the [C14MIM][Cl] into the negative bilayer structure. 15 mol% of [C14MIM][Cl] increased the polar head thickness of DPPC vesicles from 11.1±0.6 Å to 18.0±0.7 Å, without alter significantly the inner region of the membrane.Qualitative results obtained with optical microscopy showed that the IL incorporation destabilize the membrane asymmetry (between the leaflets) leading to the formation of pores (evidenced by optical contrast lost) and the presence of buds. We believe that this work could improve the understanding of the effects of ILs in the presence of biological relevant systems / Os líquidos iônicos (LI) tem atraído grande atenção, tanto da academia quanto da indústria, devido às suas numerosas aplicações. LI são sais, normalmente compostos por um íon orgânico, e um contra-íon que pode ser orgânico ou inorgânico, mas que tem como característica ser encontrado no estado líquido à temperaturas próximas a ambiente. Nosso interesse em estudar LIs vem de sua baixa toxicidade, atribuída a sua baixa volatilidade. Entretanto, alguns estudos recentes mostraram que a toxicidade dos LI é maior do que se acreditava, em particular com sistemas de relevância biológica.O objetivo principal desta dissertação é estudar a influência do líquido iônico 1-tetradecil-3-metilimidazólio cloreto ([C14MIM][Cl]) com sistemas de membrana. Para isso, utilizamos diferentes lipídios, como o POPC, esfingomielina, colesterol, POPG, DPPC,DPPG e o DMPC. Para cada um destes sistemas, a influência da concentração de LI foi elucidada por meio de um estudo sistemático através de diferentes técnicas experimentais, tais como: espalhamento de raio-X a baixos ângulos (SAXS), espalhamento dinâmico de luz (DLS), anisotropia de fluorescência, microscopia óptica e potencial-z. Uma vez que o componente iônico de [C14MIM][Cl] tem uma carga positiva no grupo imidazólio, a carga superficial de todas as vesículas estudadas aqui aumentou. Entretanto, para asvesículas compostas pelos lipídeos zwitteriónicos, não tenha sido observada qualquer alteração significativa no tamanho e na temperatura de transição de fase gel-fluido. O [C14MIM][Cl] altera a organização interna entre as moléculas de lipídio com carga negativa. Consequentemente, à medida que a quantidade de LI aumenta, a temperatura de transição de fase diminui e o tamanho médio das vesículas aumenta. Para o sistema DPPC:DPPG (1:1) a temperatura de transição de fase caiu de 42.50 ± 0.13 oC para 25.27 ± 0.33 oC e para as vesículas de DPPG de 46.12±0.22 oC para 36.6±0.38 oC. Quanto ao diâmetro hidrodinâmico médio, no caso do DPPG este valor aumentou de 84±0.1 nm para 176±0.1 nm, enquanto que para a mistura DPPC:DPPG (1:1) ele passou de 95±0.1nm para 196±0.1nm. Indicando assim que o LI incorpora na bicamada lipídica negativamente carregada. O perfil de densidade eletrônica, obtido por SAXS, confirma a penetração do [C14MIM][Cl] na bicamada lipídica. Diferentemente, para a membrana lipídica zwitteriónica o LI tende a se situar perto da região da cabeça polar sem afetar significativamente a região do interior da bicamada lipídica. Por outro lado, a presença de15 mol% de [C14MIM][Cl] aumenta a espessura da região polar das bicamadas das vesículas de DPPC de ~ 11.1±0.6 Å para ~ 18.0±0.7 Å. Os resultados qualitativos da microscopia óptica mostraram que a incorporação da LI desestabiliza a assimetria da membrana entre as camadas interna e externa, além de sugerir o aparecimento de poros (evidenciado pela perda do contraste ótico das vesículas) e estruturas chamadas de buds. Esperamos que este trabalho melhore a compreensão dos efeitos do LI na presença de organismos biológicos.

Ionic Liquids (ILs) has been attracting attention, both from academia and industry, given the numerous applications of these systems. ILs are salts, usually composed by an organic ion, and a counterion which could be organic or inorganic, and, interestingly they are found at liquid state at room temperature. Our interest in studying ILs comes from its low toxicity. Some recent studies have shown that the toxicity of the ILs ishigher than believed, in particular for biologically relevant systems. The main goal of this research is to study the influence of the ionic liquid 1-tetradecyl-3-methylimidazolium chloride ([C14MIM][Cl]) with membrane systems. To do so, we made use of different lipids: POPC, Sphingomyelin, Cholesterol, POPG, DPPC, DPPG and DMPC. For each of these systems, the influence of ILs concentration were elucidated by means of a systematic study through different experimental techniques: Small Angle X-ray scattering (SAXS), dynamic light scattering (DLS), fluorescence anisotropy, optical microscopy and z-potential. Since [C14MIM][Cl] has a positive charge on the imidazolium group, the superficial charge of all vesicles increased. For zwitterionic vesicles no significant change in size and melting temperature were noticed. The imidazolium-based ionic liquid diminished the gel-fluid transition temperature for negatively charged lipids. For DPPC:DPPG (1:1), for instance, the transition temperature decreased from 42.50±0.13oC to 25.27±0.33oC and for DPPG from 46.12±0.22 oC to 36.6±0.38 oC. For DPPG, the vesicle hydrodynamic diameter increased from 84±0.1nm to 176±0.1nm, whereas for DPPC:DPPG it increased from 95±0.1nm to 196±0.1nm. The electronic density profile, obtained by SAXS, supported the penetration of the [C14MIM][Cl] into the negative bilayer structure. 15 mol% of [C14MIM][Cl] increased the polar head thickness of DPPC vesicles from 11.1±0.6 Å to 18.0±0.7 Å, without alter significantly the inner region of the membrane.Qualitative results obtained with optical microscopy showed that the IL incorporation destabilize the membrane asymmetry (between the leaflets) leading to the formation of pores (evidenced by optical contrast lost) and the presence of buds. We believe that this work could improve the understanding of the effects of ILs in the presence of biological relevant systems / Os líquidos iônicos (LI) tem atraído grande atenção, tanto da academia quanto da indústria, devido às suas numerosas aplicações. LI são sais, normalmente compostos por um íon orgânico, e um contra-íon que pode ser orgânico ou inorgânico, mas que tem como característica ser encontrado no estado líquido à temperaturas próximas a ambiente. Nosso interesse em estudar LIs vem de sua baixa toxicidade, atribuída a sua baixa volatilidade. Entretanto, alguns estudos recentes mostraram que a toxicidade dos LI é maior do que se acreditava, em particular com sistemas de relevância biológica.O objetivo principal desta dissertação é estudar a influência do líquido iônico 1-tetradecil-3-metilimidazólio cloreto ([C14MIM][Cl]) com sistemas de membrana. Para isso, utilizamos diferentes lipídios, como o POPC, esfingomielina, colesterol, POPG, DPPC,DPPG e o DMPC. Para cada um destes sistemas, a influência da concentração de LI foi elucidada por meio de um estudo sistemático através de diferentes técnicas experimentais, tais como: espalhamento de raio-X a baixos ângulos (SAXS), espalhamento dinâmico de luz (DLS), anisotropia de fluorescência, microscopia óptica e potencial-z. Uma vez que o componente iônico de [C14MIM][Cl] tem uma carga positiva no grupo imidazólio, a carga superficial de todas as vesículas estudadas aqui aumentou. Entretanto, para asvesículas compostas pelos lipídeos zwitteriónicos, não tenha sido observada qualquer alteração significativa no tamanho e na temperatura de transição de fase gel-fluido. O [C14MIM][Cl] altera a organização interna entre as moléculas de lipídio com carga negativa. Consequentemente, à medida que a quantidade de LI aumenta, a temperatura de transição de fase diminui e o tamanho médio das vesículas aumenta. Para o sistema DPPC:DPPG (1:1) a temperatura de transição de fase caiu de 42.50 ± 0.13 oC para 25.27 ± 0.33 oC e para as vesículas de DPPG de 46.12±0.22 oC para 36.6±0.38 oC. Quanto ao diâmetro hidrodinâmico médio, no caso do DPPG este valor aumentou de 84±0.1 nm para 176±0.1 nm, enquanto que para a mistura DPPC:DPPG (1:1) ele passou de 95±0.1nm para 196±0.1nm. Indicando assim que o LI incorpora na bicamada lipídica negativamente carregada. O perfil de densidade eletrônica, obtido por SAXS, confirma a penetração do [C14MIM][Cl] na bicamada lipídica. Diferentemente, para a membrana lipídica zwitteriónica o LI tende a se situar perto da região da cabeça polar sem afetar significativamente a região do interior da bicamada lipídica. Por outro lado, a presença de15 mol% de [C14MIM][Cl] aumenta a espessura da região polar das bicamadas das vesículas de DPPC de ~ 11.1±0.6 Å para ~ 18.0±0.7 Å. Os resultados qualitativos da microscopia óptica mostraram que a incorporação da LI desestabiliza a assimetria da membrana entre as camadas interna e externa, além de sugerir o aparecimento de poros (evidenciado pela perda do contraste ótico das vesículas) e estruturas chamadas de buds. Esperamos que este trabalho melhore a compreensão dos efeitos do LI na presença de organismos biológicos.

Movimentos coletivos prestam um papel fundamental na dinâmica e energética de biomoléculas em solução. Estes movimentos permitem o acoplamento de regiões significativamente distantes, apresentando considerável influência, por exemplo, no alosterismo para a formação de complexos macromoleculares e no funcionamento integrado de proteínas multidomínios como \"máquinas moleculares\". Neste trabalho de doutoramento, serão apresentados os resultados referentes à aplicação conjunta de técnicas experimentais biofísicas, de modelagem estrutural e de dinâmica molecular no estudo de dois sistemas para os quais estes movimentos coletivos demonstram considerável importância funcional. Para a interação do receptor nuclear do ácido 9-cis-retinóico com seu elemento responsivo específico no DNA (HRE), a comparação de estudos de dinâmica molecular com ensaios de afinidade por anisotropia de fluorescência sugere que a resistência inicial para a associação do monômero, seguida da acentuada colaboratividade na associação do dímero é regida por um impedimento da associação do domínio de ligação ao DNA (DBD) para o primeiro à sequência responsiva devido, em última análise, a uma não complementaridade dos modos coletivos mútuos. Este impedimento para a associação monomérica inicial é mais acentuado para o monômero 5\' (para o qual a menor especificidade de ligação à seqüência específica já é bem documentada), devido aos efeitos conjuntos de um \"defeito\" natural no empacotamento de bases da seqüência responsiva, que se manifesta mais significativamente na interface entre o meio-sítio 5\' e a seqüência espaçadora, e dos modos vibracionais entre os dois sítios decorrentes de seu faseamento relativo na topologia do DNA na seqüência responsiva, caracterizando um mecanismo \"chave e fechadura\" para a interação obrigatoriamente simultânea dos dois monômeros ao DNA. No segundo caso, um estudo integrado utilizando a técnica experimental de espalhamento de raios X a baixos ângulos e uma abordagem de modelagem estrutural baseada em dinâmica molecular foi realizado para a celobiohidrolase I de Trichoderma harziannum. Este estudo permitiu tanto a elaboração de um modelo estrutural de maior resolução para esta enzima de alto potencial biotecnológico como a constatação dos possíveis mecanismos moleculares a partir dos quais as glicosilações no peptídeo conector impõem restrições à orientação e modos vibracionais entre seus dois domínios de forma condizente com sua ação concertada na interação e no deslize da enzima sobre a superfície celulósica, ambos de fundamental importância para a processividade da enzima na hidrólise do substrato microcristalino. / Collective motions play a fundamental role in solution biomolecule dynamics and energetics. These movements can couple very distant regions in the protein structures affection, for instance, allosteric mechanisms, the establishment of macromolecular complexes, and on the integrated function of multidomain proteins as molecullar machines. In this thesis, we present results concerning to the joint use of experimental biophysical techniques, structural modeling and molecular dynamics simulations on the study of two systems for which these collective motions have substantial importance. First, we study the interaction of the nuclear retinoid X receptor with its specific DNA hormone response element (HRE) using a combination of molecular dynamics simulations and affinity assays performed by using fluorescence anisotropy. We find out that collective motions mediate the low binding affinity of monomers and the high cooperative binding of HRE dimers. The lower binding affinity of the monomer is more prominent for 5´ monomers. This occur due to an natural ineffective stacking of the last base pair step at the 5´-half-site and to the phasing of the two binding half-sites in the DNA topology, that impose a collective motions that tends to occlude the 5´ binding site. This behavior, in turn, is concurrent with the well known 3´ polarity and the decreased binding specificity to the 5´ half site for the hRXRα monomer. This same pattern impose a lock-and-key mechanisms dependent on the binding of the full dimer. Second, an integrated Small angle X ray scattering and molecular dynamics based structural modeling was used to comprehend the interdomain motions of cellobiohydrolase I of Trichoderma harziannum. We manage to build a refined model for this enzime, with important biotechnological potential. We also provide insights into molecular mechanisms of linker and glycosylation imposed restraints on the orientation and vibrational modes of the full-length enzyme, supporting a mechanism of sliding of on the cellulose surface. This mechanism is fundamental for the high processivity on the hydrolysis of microcrystalline cellulose.