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Busca e identificação de genes regulados pelo Antígeno MT do vírus Polioma na transformação maligna de células Balb-3T3 / Screening and functional analysis of genes regulated by MT Polyoma Virus antigen in the malign transformation of Balb-3T3 cell lineRodrigues, Leonardo de Oliveira 10 April 2007 (has links)
O Vírus Polioma (Py), induz a formação de múltiplos tumores em camundongos, e causa transformação maligna em cultura, levando à menor dependência de soro e ancoragem para crescimento. Dentre as proteínas codificadas pelo vírus polioma, o antígeno MT (Middle T), isoladamente, é capaz de transformar linhagens celulares imortalizadas e gerar tumores quando injetadas em camundongos, sendo que este caráter transformante está relacionado à sua capacidade de se ligar e modular a atividade de diversas proteínas, muitas das quais relacionadas com o controle do ciclo celular. Para melhor compreender os mecanismos moleculares da transformação maligna mediada por MT e do controle do ciclo celular, o objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar novas vias de transdução de sinal e novos genes regulados por MT. Para a busca de genes regulados pela atividade de MT, comparou- se o perfil da expressão gênica da linhagem que expressa MT (MTWT) com o da linhagem controle (PLJ) através de três metodologias: membranas de nylon comerciais (Atlas Mouse Cancer 1.2 - Clontech), bibliotecas subtrativas de cDNA construídas através da técnica de RDA (Análise de Diferença Representacional) e lâminas comercias de microarrays (CodeLink Bioarrays - GE Healthcare). As três metodologias permitiram a identificação de cerca de 1.200 genes-candidatos a serem regulados por MT, dos quais 84 genes foram selecionados para terem sua expressão diferencial analisada por Real-Time PCR. Para identificar possíveis vias de transdução de sinal relacionadas à regulação dos genes analisados utilizou-se, como template, além do cDNA proveniente das linhagens PLJ e MTWT, cDNAs de linhagens que expressam a proteína MT mutada nas tirosinas 315, 322, 250 e 315/322. Após confirmação por Real-Time PCR, dois genes foram selecionados para analise funcional: Dlk1 (Delta Like-1 homolog) que, apesar de não ter relação direta com o controle do ciclo celular, está ligado à formação de alguns tumores, e MN1 (Meningioma 1), um gene pouco caracterizado que já foi relacionado à formação de leucemias mielóides e meningiomas. - I - RESUMO Para caracterizar o papel de MN1 na linhagem PLJ, foram geradas linhagens PLJ que superexpressam RNAi de MN1. A análise dos parâmetros de crescimento, em substrato sólido e semi-sólido, da linhagem PLJ parental e PLJ expressando o RNAi de MN1 não apresentou alterações estatisticamente significativas. Para o estudo do efeito de Dlk1 na transformação mediada por MT, foram geradas linhagens MTWT que superexpressam Dlk1, o que levou a um aumento estatisticamente significativo na taxa de divisão celular, quando comparada com a linhagem controle (vetor vazio), indicando um possível papel de Dlk1 no sinal desencadeado por MT e no controle do ciclo celular. Visando identificar novas vias de regulação entre os genes analisados, os níveis de expressão gênica dos demais genes foram avaliados por Real-Time PCR e analisados através de correlação de Pearson, aplicada a cada par de genes. Após a análise, foram identificadas 64 possíveis vias de regulação, sendo que 13 destas foram descritas pela primeira vez no presente trabalho e as demais, por já estarem descritas na literatura, permitiram validar o modelo estudado. / Polyomavirus (Py) induces multiple tumors in mice and malignant transformation in culture, leading to a lower serum and anchorage dependence. Among the proteins coded by the polyomavirus genome, the MT antigen (Middle T) alone is able to transform immortalized cell lines and to generate tumors when injected into animals. This transforming ability is related to its capacity of bind to and modulate several proteins, many of which are related to cell cycle control. Aiming at a better understanding not only of the molecular mechanisms of malignant transformation mediated by MT, but, also, of the processes underlying cell cycle control, the objectives of this work were to identify and characterize novel genes and signal transduction pathways regulated by MT. For screening of the MT regulated genes, the gene expression profiles of the MT expressing MTWT cell line and of the PLJ control cell line were compared using three methodologies: commercial nylon membranes (Atlas Mouse Cancer 1.2 - Clontech), subtracted cDNA libraries constructed using the RDA methodology (Representational Difference Analysis) and commercial microarrays (CodeLink Bioarrays - GE Healthcare). These three methodologies allowed us to identify about 1,200 candidate genes as being regulated by MT, from which 84 genes were selected to have their differential expression analyzed by Real- Time PCR. In an attempt to identify possible signal transduction pathways related to these genes, we used as templates, in addition to cDNAs from the PLJ and MTWT cell lines, cDNAs from cell lines which express MT mutated in tyrosines 315, 322, 250 and 315/322. After confirmation by Real-Time PCR, two genes were selected for further functional analysis: Dlk1 (Like-1 Delta homolog), which is related to the differentiation process and to formation of some tumors, and MN1 (Meningioma 1), a newly identified gene, which can induce leukemia and meningioma tumor formation. To characterize the functional role of MN1, we generated PLJ cell lines in which MN1 was knocked-down by RNAi. The growth characteristics in solid and semi-solid substrates of control PLJ and of - III - ABSTRACT MN1 knocked down PLJ cells did not present any statistically significant alteration. To study the effect of Dlk1 in MT mediated cell transformation, we generated MTWT cell lines overexpressing Dlk1, which induced a significant increase in cell division rate when compared to the empty vector control cell line, indicating a possible role of Dlk1 in the MT induced signals and in cell cycle control. Aiming at identifying new regulatory pathways among the genes analyzed, the Real-Time PCR results were subjected to analysis by Pearson correlation, applied to each pair of genes, allowing us to identify 64 possible regulatory pathways, 13 of which were described, for the first time, in the present work. The other pathways, which had previously been described in the literature, allowed us to validate the model studied.
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Busca e identificação de genes regulados pelo Antígeno MT do vírus Polioma na transformação maligna de células Balb-3T3 / Screening and functional analysis of genes regulated by MT Polyoma Virus antigen in the malign transformation of Balb-3T3 cell lineLeonardo de Oliveira Rodrigues 10 April 2007 (has links)
O Vírus Polioma (Py), induz a formação de múltiplos tumores em camundongos, e causa transformação maligna em cultura, levando à menor dependência de soro e ancoragem para crescimento. Dentre as proteínas codificadas pelo vírus polioma, o antígeno MT (Middle T), isoladamente, é capaz de transformar linhagens celulares imortalizadas e gerar tumores quando injetadas em camundongos, sendo que este caráter transformante está relacionado à sua capacidade de se ligar e modular a atividade de diversas proteínas, muitas das quais relacionadas com o controle do ciclo celular. Para melhor compreender os mecanismos moleculares da transformação maligna mediada por MT e do controle do ciclo celular, o objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar novas vias de transdução de sinal e novos genes regulados por MT. Para a busca de genes regulados pela atividade de MT, comparou- se o perfil da expressão gênica da linhagem que expressa MT (MTWT) com o da linhagem controle (PLJ) através de três metodologias: membranas de nylon comerciais (Atlas Mouse Cancer 1.2 - Clontech), bibliotecas subtrativas de cDNA construídas através da técnica de RDA (Análise de Diferença Representacional) e lâminas comercias de microarrays (CodeLink Bioarrays - GE Healthcare). As três metodologias permitiram a identificação de cerca de 1.200 genes-candidatos a serem regulados por MT, dos quais 84 genes foram selecionados para terem sua expressão diferencial analisada por Real-Time PCR. Para identificar possíveis vias de transdução de sinal relacionadas à regulação dos genes analisados utilizou-se, como template, além do cDNA proveniente das linhagens PLJ e MTWT, cDNAs de linhagens que expressam a proteína MT mutada nas tirosinas 315, 322, 250 e 315/322. Após confirmação por Real-Time PCR, dois genes foram selecionados para analise funcional: Dlk1 (Delta Like-1 homolog) que, apesar de não ter relação direta com o controle do ciclo celular, está ligado à formação de alguns tumores, e MN1 (Meningioma 1), um gene pouco caracterizado que já foi relacionado à formação de leucemias mielóides e meningiomas. - I - RESUMO Para caracterizar o papel de MN1 na linhagem PLJ, foram geradas linhagens PLJ que superexpressam RNAi de MN1. A análise dos parâmetros de crescimento, em substrato sólido e semi-sólido, da linhagem PLJ parental e PLJ expressando o RNAi de MN1 não apresentou alterações estatisticamente significativas. Para o estudo do efeito de Dlk1 na transformação mediada por MT, foram geradas linhagens MTWT que superexpressam Dlk1, o que levou a um aumento estatisticamente significativo na taxa de divisão celular, quando comparada com a linhagem controle (vetor vazio), indicando um possível papel de Dlk1 no sinal desencadeado por MT e no controle do ciclo celular. Visando identificar novas vias de regulação entre os genes analisados, os níveis de expressão gênica dos demais genes foram avaliados por Real-Time PCR e analisados através de correlação de Pearson, aplicada a cada par de genes. Após a análise, foram identificadas 64 possíveis vias de regulação, sendo que 13 destas foram descritas pela primeira vez no presente trabalho e as demais, por já estarem descritas na literatura, permitiram validar o modelo estudado. / Polyomavirus (Py) induces multiple tumors in mice and malignant transformation in culture, leading to a lower serum and anchorage dependence. Among the proteins coded by the polyomavirus genome, the MT antigen (Middle T) alone is able to transform immortalized cell lines and to generate tumors when injected into animals. This transforming ability is related to its capacity of bind to and modulate several proteins, many of which are related to cell cycle control. Aiming at a better understanding not only of the molecular mechanisms of malignant transformation mediated by MT, but, also, of the processes underlying cell cycle control, the objectives of this work were to identify and characterize novel genes and signal transduction pathways regulated by MT. For screening of the MT regulated genes, the gene expression profiles of the MT expressing MTWT cell line and of the PLJ control cell line were compared using three methodologies: commercial nylon membranes (Atlas Mouse Cancer 1.2 - Clontech), subtracted cDNA libraries constructed using the RDA methodology (Representational Difference Analysis) and commercial microarrays (CodeLink Bioarrays - GE Healthcare). These three methodologies allowed us to identify about 1,200 candidate genes as being regulated by MT, from which 84 genes were selected to have their differential expression analyzed by Real- Time PCR. In an attempt to identify possible signal transduction pathways related to these genes, we used as templates, in addition to cDNAs from the PLJ and MTWT cell lines, cDNAs from cell lines which express MT mutated in tyrosines 315, 322, 250 and 315/322. After confirmation by Real-Time PCR, two genes were selected for further functional analysis: Dlk1 (Like-1 Delta homolog), which is related to the differentiation process and to formation of some tumors, and MN1 (Meningioma 1), a newly identified gene, which can induce leukemia and meningioma tumor formation. To characterize the functional role of MN1, we generated PLJ cell lines in which MN1 was knocked-down by RNAi. The growth characteristics in solid and semi-solid substrates of control PLJ and of - III - ABSTRACT MN1 knocked down PLJ cells did not present any statistically significant alteration. To study the effect of Dlk1 in MT mediated cell transformation, we generated MTWT cell lines overexpressing Dlk1, which induced a significant increase in cell division rate when compared to the empty vector control cell line, indicating a possible role of Dlk1 in the MT induced signals and in cell cycle control. Aiming at identifying new regulatory pathways among the genes analyzed, the Real-Time PCR results were subjected to analysis by Pearson correlation, applied to each pair of genes, allowing us to identify 64 possible regulatory pathways, 13 of which were described, for the first time, in the present work. The other pathways, which had previously been described in the literature, allowed us to validate the model studied.
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