Η θανατηφόρος δράση του βακτηρίου του άνθρακα (Bacillus anthracis), στο οποίο οφείλεται η καλούμενη ως νόσος του άνθρακα, εντοπίζεται στη συνεργό δράση τριών εκλυόμενων τοξινών του και ειδικότερα στην πρωτεολυτική δράση του θανατηφόρου παράγοντα (anthrax Lethal Factor, LF). Ο LF είναι μία μεταλλοπρωτεάση ψευδαργύρου και ισχυρή τοξίνη, η οποία απελευθερώνεται στον οργανισμό στα πρώτα στάδια προσβολής του ατόμου από το βακτήριο. Το ενεργό/καταλυτικό κέντρο του αναγνωρίζει και υδρολύει με εξαιρετική εξειδίκευση πεπτιδικά υποστρώματα ΜΚΚ κινασών, αναστέλλοντας τις διαδικασίες μεταγωγής σήματος στα κύτταρα του μολυσμένου ξενιστή επιφέροντας το θάνατό του. Από την άλλη, η εξειδικευμένη πρωτεολυτική ικανότητα του LF έναντι αυτών των κινασών, οι οποίες πρόσφατα συσχετίστηκαν με ανάπτυξη καρκινικών όγκων, ενδέχεται να αποτελέσει μια καινοτόμο θεραπευτική οδό για την αντιμετώπιση καρκινικών όγκων εν τη γενέση τους. Ωστόσο, ο μηχανισμός της αλληλεπίδρασης σε μοριακό επίπεδο και της πρωτεολυτικής διάσπασης των υποστρωμάτων του LF παραμένει μέχρι και σήμερα αδιευκρίνιστος και συνεπώς χρήζει ιδιαίτερης μελέτης. Προς αυτή την κατεύθυνση εστιάστηκε το ενδιαφέρον της διατριβής έχοντας ως πρωτογενείς στόχους την in silico μελέτη της αλληλεπίδρασης, σε μοριακό επίπεδο, του καταλυτικού κέντρου του LF με τα υποστρώματα των ΜΚΚ κινασών που υδρολύει, και την μελέτη μέσω Φασματοσκοπίας NMR της δομής και δυναμικής του ενεργού κέντρου του LF σε ελεύθερη μορφή, το οποίο ευρίσκεται στο C-τελικό άκρο του. Με την εφαρμογή τεχνικών προσομοίωσης πρόσδεσης και μοριακής δυναμικής πραγματοποιήθηκε in silico μελέτη των συμπλόκων LF-υποστρώματα, και προσδιορίστηκε ένα ευρύ φάσμα αλληλεπιδράσεων, όχι μόνο γύρω από το μεταλλικό/καταλυτικό κέντρο αλλά και σε απόσταση 20 Å στην περιοχή δέσμευσης του Zn2+, υποδεικνύοντας έτσι τους δομικούς παράγοντες που πιθανόν καθορίζουν το είδος της αλληλεπίδρασής ενζύμου με τις κινάσες που υδρολύει, παρέχοντας έτσι σημαντικές πληροφορίες για τον σχεδιασμό και την αναζήτηση βιοδραστικών μορίων με φαρμακευτικό ενδιαφέρον έναντι στον LF. Τα δεδομένα αυτά μπορούν επίσης να αξιοποιηθούν σε μελέτες δομής-δράσης με σημειακές και/ή πολλαπλές μεταλλάξεις. Με την χρήση φασματοσκοπίας NMR, πραγματοποιήθηκε μελέτη της δομής και δυναμικής του ενεργού κέντρου του LF σε ελεύθερη μορφή (apoLF672-776). Η επίλυση των τρισδιάστατων NMR δομών του apoLF672-776 έδωσαν μια εξαιρετικά σαφή εικόνα για τη δομή του ενεργού κέντρου του LF, το οποίο βρίσκεται σε συμφωνία με τις υπάρχουσες κρυσταλλικές δομές. Τα συγκεκριμένα ΝΜR δεδομένα μπορούν να αξιοποιηθούν σε μελέτες με NMR υπό το καθεστώς αλληλεπίδρασης του LF με τα πεπτιδικά υποστρώματά του και χαρακτηρισμό της δυναμικής της αλληλεπίδρασης, όπως επίσης και τον υπολογισμό της συγγένειας δέσμευσής τους. / The anthrax toxin of the bacterium Bacillus anthracis consists of three distinct proteins, one of which is the anthrax lethal factor (LF). LF is a gluzincin Zn-dependent, highly specific metalloprotease with a molecular mass of ~90 kDa that cleaves most isoforms of the family of mitogen-activated protein kinase kinases (MEKs/MKKs) close to their amino termini, resulting in the inhibition of one or more signaling pathways. Previous studies on the crystal structures of uncomplexed LF and LF complexed with the substrate MEK2 or a MKK-based synthetic peptide provided structure-activity correlations and the basis for the rational design of efficient inhibitors. However, in the crystallographic structures, the substrate peptide was not properly oriented in the active site due to the absence of the catalytic zinc atom. The primary target of the thesis was to examine in silico the LF-MEK/MKK interaction along the catalytic channel up to a distance of 20 Å from the zinc atom, using docking and molecular dynamics protocols. This residue-specific view of the enzyme-substrate interaction provides valuable information about: (i) the substrate selectivity of LF and its inactivation of MEKs/MKKs, (an issue highly important not only to anthrax infection, but also to the pathogenesis of cancer), and (ii) the discovery of new, previously unexploited, hot-spots of the LF catalytic channel that are important in the enzyme/substrate binding and interaction. Given the importance of the interaction between LF and substrate for the development of anti-anthrax agents as well as the potential treatment of nascent tumours, the analysis of the structure and dynamic properties of the LF catalytic site are essential to elucidate its enzymatic properties. The thesis interest was oriented then to the solution structure of the catalytic domain of apo LF and present data on its dynamics. The solution nuclear magnetic resonance (NMR) structure and mobility studies of the catalytic domain of apoLF672-776 reveals that the conformation of the C-terminal construct of the LF catalytic domain and the orientation of the six helical motifs are remarkably similar to the native structure, indicating the LF polypeptides catalytic site as reliable models of the enzyme active centre.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3802.pdf: 4112819 bytes, checksum: e42717f19397f311cb6978ed3341685c (MD5) Previous issue date: 2010-10-29 / For centuries, infectious agents have been used as weapons in armed conflicts. In 1972 the Biological Weapons Convention prohibited the creation and stockpiling of biological weapons. However, some countries continued to research and develop these weapons. Proof of this fact was the crash in 1979 in a military factory in the USSR, where Bacillus anthracis were dispersed. Biotechnology in a globalizing world facilitates and contributes not only to the development of weapons programs of regular armies, but also to terrorist groups. Examples of such this are the contamination by the bacterium Salmonella typhimurium by a religious fanatic group that in 1984 poisoned 751 people in the U.S., and the bacterium Bacillus anthracis spores mailed in the U.S. to several people during 2001 and 2002, immediately after the attacks of September 11th. A biological weapon is of extreme difficult detection by security equipment. Most infectious agents are present in almost every continent, making it easier to obtain. The production is cheap and it is easy to carry, being a small amount enough to reach very large area and thousands of people. It is an invisible weapon, odorless and causes symptoms unknown to most physicians. So, given this background, in this master thesis we attempt to demonstrate the reality of the threat of a biological weapon based on Anthrax as the biological agent used as a weapon of mass destruction. Based on this study, we show the fragility of the state system for dealing with such incidents, and we propose security protocols in order to regulate what should be done in time of crisis, defining its management and streamline the decision-making. Finally, using the technique of molecular docking, we also studied the lethal factor of anthrax, and proposed the compound 1-Phenylsulfonyl-2-propanone (DARXOJ, C9H10O3S) as a good candidate to inhibit its effects. / Há séculos agentes infecciosos são utilizados como armas em conflitos bélicos. Em 1972 a Convenção sobre Armas Biológicas proibiu a criação e armazenamento de armas biológicas. No entanto alguns países continuaram a pesquisa e o desenvolvimento dessas armas. Prova desse fato foi o acidente em 1979 em uma fábrica militar na URSS, onde foram dispersos esporos de Bacillus anthracis. A Biotecnologia no mundo globalizado facilita e contribui não apenas aos programas de desenvolvimento de armas dos exércitos regulares, mas também aos grupos terroristas. Exemplos disso são a intoxicação pela bactéria Salmonella typhimurium por um grupo fanático religioso que em 1984, nos EUA, intoxicou 751 pessoas, e os esporos da bactéria Bacillus anthracis enviados pelo correio para várias pessoas em 2001 e 2002, imediatamente após os atentados de 11 de setembro nos EUA. Uma arma biológica é muito difícil de ser detectada por equipamento de segurança. A maioria dos agentes infecciosos está presente em quase todos os continentes, o que facilita a sua obtenção. A produção é barata e simples de transportar, podendo atingir com pequena quantidade área muito grande e milhares de pessoas. É uma arma invisível, inodora e que provoca sintomas desconhecidos pela maioria dos médicos. Em face desse panorama, neste trabalho procuramos demonstrar a realidade da ameaça de uma arma biológica e elegemos o Antraz como agente biológico utilizado como arma de destruição em massa. Neste estudo, mostramos a fragilidade do sistema estatal para lidar com este tipo de incidente, e propomos protocolos de segurança com o objetivo de regular os procedimentos no momento de crise, definindo o gerenciamento para melhorar e otimizar as tomadas de decisões. Finalmente, por meio do uso da técnica de docking molecular, também estudamos o fator letal do Antraz, e propusemos o composto 1-Fenilsulfonil-2-propanona (DARXOJ, C9H10O3S) como um bom candidato a inibir os seus efeitos.