Linfomas são doenças originárias do sistema linfático, descritos por Thomas Hodgkin em 1932. São tradicionalmente classificados em dois grupos básicos: doenças de Hodgkin e linfomas do tipo não hodgkin (LNH). Inicialmente, pacientes com LNH foram tratados com radioterapia apenas ou combinada com imunoterapia usando-se anticorpo monoclonal anti-CD20 (ex., Rituximab-Mabthera, Roche). Porém, radioimunoterapia é uma nova modalidade de tratamento para pacientes portadores de LNH, na qual radiação citotóxica proveniente de radioisótopos terapêuticos é depositada nos tumores via anticorpos monoclonais (Acms). Este estudo concentrou-se nas condições de marcação do Acm anti-CD20 (Rituximab-Mabthera, Roche), com radioiodo (131I), pelo método direto, usando-se Cloramina-T como agente oxidante. Foram estudados parâmetros de marcação tais como: método de purificação, influência de tempo de incubação, influência de massa de agente oxidante, estabilidade in vitro e in vivo, imunoreatividade do anticorpo e distribuição biológica do anticorpo marcado em camundongos Swiss sadios. Produto de alta pureza radioquímica foi obtido, sem diferença notável entre os métodos aplicados. Não foi observada nenhuma influência direta do tempo de incubação na pureza radioquímica do anticorpo marcado. Um pequeno decréscimo na pureza radioquímica foi observado quando variou-se a massa do Acm sem variar a atividade do radioiodo. Após purificação, o anticorpo marcado apresentou pureza radioquímica de aproximadamente 100 %. Observou-se um produto de alta pureza radioquímica quando o anticorpo foi marcado na condição padrão. O anticorpo anti-CD20 apresentou variações de pureza radioquímica quando sua estabilidade foi testada em cinco condições estabilizadoras diferentes. Entretanto, a condição em que ácido gentísico foi combinado com congelamento demonstrou-se apropriada e capaz de minimizar os efeitos de autoradiólise do anticorpo marcado com alta atividade terapêutica de iodo-131. O anticorpo marcado apresentou imunoreatividade abaixo da relatada na literatura. A distribuição biológica em camundongos Swiss sadios revelou captação elevada no pulmão, fígado, e intestino delgado. O clareamento sanguíneo do anticorpo marcado foi relativamente rápido. Contudo, dados experimentais revelaram que anticorpos monoclonais anti-CD20 podem ser seguramente marcados com alta atividade de iodo-131 usando o método de Cloramina-T. O uso de cromatografia em camada delgada (ITLC-SG) na avaliação de pureza radioquímica mostrou-se apropriado, eficiente, prático, além de simples e rápido. O método de purificação utilizado demonstrou-se eficiente para a separação do anticorpo marcado do iodo livre. A abordagem inédita apresentada neste estudo, no sentido de viabilizar transporte e comercialização do produto marcado, referiu-se ao estudo de estabilidade do Acm marcado. A distribuição biológica do anticorpo demonstrou-se compatível com a distribuição do anticorpo íntegro indicando ótima estabilidade relativa in vivo. Os resultados deste estudo confirmam a potencialidade do anticorpo para a radioimunoterapia de linfomas do tipo não-Hodgkin. / Lymphomas are malignancies of the lymphatic system, described by Thomas Hodgkin in 1932. Traditionally, lymphomas are classified in two basic groups: Hodgkin disease and non-Hodgkin lymphoma (NHL). Patients with NHL were earlier treated with radiotherapy alone or in combination with immunotherapy using monoclonal antibody anti-CD20 (ex., Rituximab-Mabthera, Roche). However, Radioimmunotherapy is a new modality of treatment for patients with NHL, in which cytotoxic radiation from therapeutic radioisotopes is delivered to tumors through monoclonal antibodies. This study focused on labeling conditions of monoclonal antibody anti-CD20 (Rituximab-Mabthera, Roche) with iodine-131, by direct radioiodination method using Chloramine-T as oxidizing agent. Labeling parameters investigated were: Radiochemical purity (RP), method of purification, incubation time, antibody mass, oxidative agent mass, stability in vitro, stability in vivo, immunoreactivity and biological distribution performed in normal Swiss mouse. Product of high radiochemical purity was obtained with no notable difference between the methods applied. No clear evidence of direct influence of incubation time on radiochemical purity of the labeled antibody was observed. Whereas, a clear evidence of direct influence of activity on radiochemical purity of the labeled antibody was observed when antibody mass was varied. After purification, the labeled product presented radiochemical purity of approximately 100 %. Product of superior radiochemical yield was observed when standard condition of labeling was used. The labeled product presented variation in radiochemical purity using five different stabilizer conditions. The condition in which gentisic acid was combined with freeze appears more suitable and capable of minimizing autoradiolysis of the antibody labeled with high therapeutic activity of iodine-131. The labeled product presented low immunoreactivity when compared to the literature. Biological distribution in normal Swiss mouse demonstrated high uptake of the labeled antibody in lungs, liver, and small intestine. The progressive loss of activity in blood indicates fast blood clearance of the labeled antibody that is eliminated through the kidney, in urine. The experimental data proved that mAb anti-CD20 can be securely labeled with high therapeutic activity of iodine-131 using Chloramine-T method. Radiochemical purity determined by chromatographic plates (ITLC-SG) proved to be appropriate, efficient, practical and simple. The purification method demonstrated to be appropriate and efficient for separating the labeled antibody from free iodine. The results of stability of the labeled antibody presented in this study suggest that the product can be transported and commercialized using the condition in which gentisic acid was combined with freeze. In vivo distribution of the labeled antibody shows to be compatible with integral antibody distribution, indicating good in vivo stability. Results obtained in this study confirmed the potential of the labeled product anti-CD20-131I for radioimmunotherapy of non-Hodgkin lymphoma (NHL).

A radioimunoterapia (RIT) faz uso de anticorpos monoclonais conjugados com radionuclídeos emissores α ou β-, ambos para terapia. O tratamento baseia-se na irradiação e destruição do tumor, preservando os órgãos normais quanto ao excesso de radiação. Radionuclídeos emissores β- como 90Y, 131I, 177Lu e 188Re, são úteis para o desenvolvimento de radiofármacos terapêuticos e, quando associados a AcM como o Anti-CD20 são importantes principalmente para o tratamento de Linfomas Não Hodgkins (LNH). 188Re (Eβ- = 2,12 MeV; Eγ= 155 keV; t1/2 = 16,9 h) é um radionuclídeo atrativo para RIT. O Centro de Radiofarmácia do IPEN possui um projeto que visa a produção do radiofármaco 188Re-Anti-CD20. Com isso,este estudo foi proposto para avaliar a eficácia desta técnica de marcação para tratamento em termos compartimentais e dosimétricos. O objetivo deste trabalho consistiu na compararação da marcação do AcM anti-CD20 com 188Re com a marcação do anticorpo com 90Y, 131I, 177Lu e 99mTc (pelas suas características químicas similares) e 211At, 213Bi, 223Ra e 225Ac. Através do estudo de técnicas de marcação relatadas em literatura, foi proposto um modelo compartimental para avaliação de sua farmacocinética e estudos dosimétricos, de alto interesse para a terapia. A revisão de dados publicados na literatura, possibilitou demonstrar diferentes procedimentos de marcação, rendimentos de marcação, tempo de reação, impurezas e estudos de biodistribuição. O resultado do estudo mostra uma cinética favorável para o 188Re, pelas suas características físicas e químicas frente aos demais radionuclídeos avaliados. O estudo compartimental proposto descreve o metabolismo do 188Re-anti-CD20 através de um modelo compartimental mamilar, que pela sua análise farmacocinética, realizada em comparação aos produtos marcados com emissores β-: 131I-antiCD20, 177Lu-anti-CD20, o emissor γ 99mTc-anti-CD20 e o emissor α 211At-Anti-CD20, apresentou uma constante de eliminação de aproximadamente 0,05 horas-1 no sangue do animal. A avaliação dosimétrica do 188Re-Anti-CD20 foi realizada através de duas metodologias: pelo método de Monte Carlo e pelo uso de uma fonte pontual β- através da Fórmula de Loevinger via programa Excel. Através da Fórmula de Loevinger fez-se a validação do método de Monte Carlo para a dosimetria do 188Re-Anti-CD20 e dos demais produtos. As doses e as taxas de doses obtidas pelos dois métodos foram avaliadas em comparação à dosimetria do 90Y-Anti-CD20, 131I-Anti-CD20 e do 177Lu-Anti-CD20, obtidas pela mesma metodologia. O estudo de dose foi realizado utilizando modelos matemáticos considerando um camundongo nude de 25g, simulando diferentes tamanhos de tumor e diferentes formas de distribuição do produto dentro do animal. De acordo com os resultados obtidos, pela energia de emissão β-, 188Re-Anti-CD20 apresenta maior deposição de energia para tumores volumosos em relação aos demais produtos avaliados. Em uma simulação com 100% do produto captado pelo tumor, 89% da dose total manteve-se absorvida pelo tumor, preservando a integridade de ógãos críticos como coração (2%), pulmões (5%), coluna (4%), fígado (0,014%) e rins (0,0007%). Em uma simulação onde há uma biodistribuição do produto no organismo do animal, 38% da dose total é absorvida pelo tumor e >3% é absorvida pela coluna. Nessa situação mais próxima da realidade, a extrapolação dos dados para um humano de 70kg, mostrou que a dose absorvida no tumor corresponde a cerca de 33%; na coluna 7% e o coração receberia uma dose de 35% do total. A análise compartimental e dosimétrica apresentada neste trabalho, realizada através do uso de um modelo animal para o 188Re-Anti-CD20 mostra que o produto desenvolvido e apresentado em literatura é candidato promissor para a RIT. / The radioimmunotherapy (RIT) uses MAbs conjugated to radionuclides α or β- emitters, both for therapy. Your treatment is based on the irradiation and tumor destruction, preserving the normal organs as the excess radiation. Radionuclides β- emitters as 131I, 90Y, 188Re 177Lu and are useful for the development of therapeutic radiopharmaceuticals and, when coupled with MAb and Anti-CD20 it is important mainly for the treatment of non-Hodgkin\'s lymphomas (NHL). 188Re (Eβ- = 2.12 MeV; Eγ = 155 keV; t1/2 = 16.9 h) is an attractive radionuclide for RIT. However, 188Re can be obtained from a radionuclide generator of 188W/188Re, commercially available, making it convenient for use in research and for clinical routine. The CR of IPEN has a project aimed at the production of radiopharmaceutical 188Re-Anti-CD20, where the radionuclide can be obtained from a generator system 188W/188Re. With this proposed a study to assess the efficiency of this labeling technique for treatment in accordance compartmental and dosimetry. The objective of this study was to compare the marking of anti-CD20 MAb with 188Re with the marking of the antibody with 90Y, 131I, 177Lu and 99mTc (for their similar chemical characteristics) and 211At, 213Bi, 223Ra and 225Ac); through the study of labeling techniques reported in literature, the proposal of a compartmental model to evaluate its pharmacokinetic and dosimetric studies, high interest for therapy. The result of the study shows a favorable kinetics for 188Re, by their physical and chemical characteristics compared to the other evaluated radionuclides. The compartment proposed study describes the metabolism of 188Re-anti-CD20 through a compartment mammillary model, which by their pharmacokinetic analysis, performed compared to products emissores β- 131I-labeled antiCD20, 177Lu-anti-CD20, the γ emitter 99mTc-Anti-CD20 and emitter 211At-Anti-CD20 presented a elimination constant of approximately 0.05 hours-1 in the animal\'s blood. The dosimetric evaluation of 188Re-Anti-CD20 was performed using two methodologies: the Monte Carlo method and the use of a point source β- by Formula Loevinger by Excel program. In the Formula Loevinger, there was a validation of the Monte Carlo method for dosimetry of 188Re-Anti-CD20 and other products. The doses and dose rates obtained by the two methods were evaluated in comparison with 90Y-Anti-CD20, 131I-Anti-CD20 and 177Lu-Anti-CD20 dosimetry, obtained by the same methodology. The dose study was conducted using mathematical models considering a nude mouse 25 g, simulating different tumor sizes and different forms of distribution of the product within the animal. According to the results, the energy emission β-, 188Re-Anti-CD20 has a higher energy deposition for large tumors when compared to other products evaluated. In a simulation with 100% of the product uptake by tumor, 89% of the total dose remained absorbed by the tumor, while preserving the integrity of critical ógãos as heart (2%), lung (5%), column (4%), liver (0.014%) and kidneys (0.0007%). In a simulation where there is a biodistribution of the product in the animal organism, 38% of the total dose absorbed by the tumor and >3% is absorbed by the column. In this situation closer to reality, the extrapolation of the data for a 70kg human, showed that the absorbed dose to tumor corresponds to about 33%; In column 7% and the heart would receive a dose of 35% of the total. The compartmental analysis and dosimetric presented in this work, performed through use of an animal model for the 188Re-anti-CD20 shows that the product developed and presented in the literature is promising candidate for RIT.

Linfomas são doenças originárias do sistema linfático, descritos por Thomas Hodgkin em 1932. São tradicionalmente classificados em dois grupos básicos: doenças de Hodgkin e linfomas do tipo não hodgkin (LNH). Inicialmente, pacientes com LNH foram tratados com radioterapia apenas ou combinada com imunoterapia usando-se anticorpo monoclonal anti-CD20 (ex., Rituximab-Mabthera, Roche). Porém, radioimunoterapia é uma nova modalidade de tratamento para pacientes portadores de LNH, na qual radiação citotóxica proveniente de radioisótopos terapêuticos é depositada nos tumores via anticorpos monoclonais (Acms). Este estudo concentrou-se nas condições de marcação do Acm anti-CD20 (Rituximab-Mabthera, Roche), com radioiodo (131I), pelo método direto, usando-se Cloramina-T como agente oxidante. Foram estudados parâmetros de marcação tais como: método de purificação, influência de tempo de incubação, influência de massa de agente oxidante, estabilidade in vitro e in vivo, imunoreatividade do anticorpo e distribuição biológica do anticorpo marcado em camundongos Swiss sadios. Produto de alta pureza radioquímica foi obtido, sem diferença notável entre os métodos aplicados. Não foi observada nenhuma influência direta do tempo de incubação na pureza radioquímica do anticorpo marcado. Um pequeno decréscimo na pureza radioquímica foi observado quando variou-se a massa do Acm sem variar a atividade do radioiodo. Após purificação, o anticorpo marcado apresentou pureza radioquímica de aproximadamente 100 %. Observou-se um produto de alta pureza radioquímica quando o anticorpo foi marcado na condição padrão. O anticorpo anti-CD20 apresentou variações de pureza radioquímica quando sua estabilidade foi testada em cinco condições estabilizadoras diferentes. Entretanto, a condição em que ácido gentísico foi combinado com congelamento demonstrou-se apropriada e capaz de minimizar os efeitos de autoradiólise do anticorpo marcado com alta atividade terapêutica de iodo-131. O anticorpo marcado apresentou imunoreatividade abaixo da relatada na literatura. A distribuição biológica em camundongos Swiss sadios revelou captação elevada no pulmão, fígado, e intestino delgado. O clareamento sanguíneo do anticorpo marcado foi relativamente rápido. Contudo, dados experimentais revelaram que anticorpos monoclonais anti-CD20 podem ser seguramente marcados com alta atividade de iodo-131 usando o método de Cloramina-T. O uso de cromatografia em camada delgada (ITLC-SG) na avaliação de pureza radioquímica mostrou-se apropriado, eficiente, prático, além de simples e rápido. O método de purificação utilizado demonstrou-se eficiente para a separação do anticorpo marcado do iodo livre. A abordagem inédita apresentada neste estudo, no sentido de viabilizar transporte e comercialização do produto marcado, referiu-se ao estudo de estabilidade do Acm marcado. A distribuição biológica do anticorpo demonstrou-se compatível com a distribuição do anticorpo íntegro indicando ótima estabilidade relativa in vivo. Os resultados deste estudo confirmam a potencialidade do anticorpo para a radioimunoterapia de linfomas do tipo não-Hodgkin. / Lymphomas are malignancies of the lymphatic system, described by Thomas Hodgkin in 1932. Traditionally, lymphomas are classified in two basic groups: Hodgkin disease and non-Hodgkin lymphoma (NHL). Patients with NHL were earlier treated with radiotherapy alone or in combination with immunotherapy using monoclonal antibody anti-CD20 (ex., Rituximab-Mabthera, Roche). However, Radioimmunotherapy is a new modality of treatment for patients with NHL, in which cytotoxic radiation from therapeutic radioisotopes is delivered to tumors through monoclonal antibodies. This study focused on labeling conditions of monoclonal antibody anti-CD20 (Rituximab-Mabthera, Roche) with iodine-131, by direct radioiodination method using Chloramine-T as oxidizing agent. Labeling parameters investigated were: Radiochemical purity (RP), method of purification, incubation time, antibody mass, oxidative agent mass, stability in vitro, stability in vivo, immunoreactivity and biological distribution performed in normal Swiss mouse. Product of high radiochemical purity was obtained with no notable difference between the methods applied. No clear evidence of direct influence of incubation time on radiochemical purity of the labeled antibody was observed. Whereas, a clear evidence of direct influence of activity on radiochemical purity of the labeled antibody was observed when antibody mass was varied. After purification, the labeled product presented radiochemical purity of approximately 100 %. Product of superior radiochemical yield was observed when standard condition of labeling was used. The labeled product presented variation in radiochemical purity using five different stabilizer conditions. The condition in which gentisic acid was combined with freeze appears more suitable and capable of minimizing autoradiolysis of the antibody labeled with high therapeutic activity of iodine-131. The labeled product presented low immunoreactivity when compared to the literature. Biological distribution in normal Swiss mouse demonstrated high uptake of the labeled antibody in lungs, liver, and small intestine. The progressive loss of activity in blood indicates fast blood clearance of the labeled antibody that is eliminated through the kidney, in urine. The experimental data proved that mAb anti-CD20 can be securely labeled with high therapeutic activity of iodine-131 using Chloramine-T method. Radiochemical purity determined by chromatographic plates (ITLC-SG) proved to be appropriate, efficient, practical and simple. The purification method demonstrated to be appropriate and efficient for separating the labeled antibody from free iodine. The results of stability of the labeled antibody presented in this study suggest that the product can be transported and commercialized using the condition in which gentisic acid was combined with freeze. In vivo distribution of the labeled antibody shows to be compatible with integral antibody distribution, indicating good in vivo stability. Results obtained in this study confirmed the potential of the labeled product anti-CD20-131I for radioimmunotherapy of non-Hodgkin lymphoma (NHL).

A Medicina Nuclear é uma modalidade de particular importância em oncologia e a investigação de novos radiofármacos direcionados a tumores, seja para diagnóstico e/ou terapia, é uma área de interesse para os pesquisadores. Rituximab (RTX) é um anticorpo monoclonal (AcM) quimérico (IgG 1) que se liga especificamente ao antígeno CD20 com alta afinidade e tem sido usado com sucesso para tratar Linfoma Não-Hodgkin (LNH) de células-B. O antígeno CD20 é expresso sobre mais de 90% dos LNH de células-B. Tecnécio-99m (99mTc) e rênio-188 (188Re) representam um atrativo par de radionuclídeos para uso médico devido as favoráveis propriedades de decaimento para diagnóstico (99mTc: T1/2 = 6 h, radiação γ = 140 keV) e terapia (188Re: T1/2 = 17 h, radiação máxima = 2,12 MeV) e por causa de sua disponibilidade graças aos sistemas de geradores correspondentes 99Mo/99mTc e 188W/188Re. Estes dois radionuclídeos podem ser conjugados aos anticorpos usando métodos químicos similares. O objetivo geral deste trabalho foi estudar a marcação do AcM anti-CD20 (Rituximab) com o radioisótopo 188Re usando duas técnicas: método direto de marcação [188Re(V)] e método de marcação via núcleo carbonila [188Re(I)]. Além do controle de qualidade, o anticorpo radiomarcado foi submetido a estudo biológico in vivo, in vitro e ex vivo. Para a marcação direta, o RTX foi reduzido pela incubação com o agente redutor 2-mercaptoetanol para a geração de grupos sulfidrilas (-SH) e posteriormente marcado com 188Re(V), fazendo-se um amplo estudo de variáveis para se chegar a uma formulação otimizada. Para a marcação usando o núcleo carbonila foram usados os radioisótopos 99mTc e 188Re e dois procedimentos de radiomarcação: (1) RTX nativo marcado com 99mTc(I) e (2) RTX reduzido (RTXred) marcado com 99mTc(I)/188Re(I). Também foi feito um estudo de variáveis para se chegar a formulação otimizada. O método de controle de qualidade para avaliação da pureza radioquímica mostrou um bom rendimento de marcação (93%) para o método direto. Na marcação com o núcleo carbonila, os resultados mostraram que os grupos -SH do anticorpo reduzido são uma possível via de ligação. A formação do composto 99mTc(I)-RTXred foi mais rápida do que 188Re(I)- RTXred, que por sua vez mostrou melhor estabilidade em plasma humano e nenhuma transquelação no desafio a histidina ou cisteína. Os dois compostos mostraram boa afinidade de ligação e uma biodistribuição em camundongos portadores de tumor coerente com a biodistribuição normal do anticorpo e razoável captação no tumor provando a eficiência do método de marcação e potencial uso clínico. / Nuclear Medicine is an unique and important modality in oncology and the development of new tumor-targeted radiopharmaceuticals for both diagnosis and therapy is an area of interest for researchers. Rituximab (RTX) is a quimeric monoclonal antibody (mAb) (IgG 1) that specifically binds to CD20 antigen with high affinity and has been successfully used for the treatment of Non-Hodgkin Lymphoma (NHL) of cell B. The CD20 antigen is expressed over more than 90% of cell B NHL. Technetium-99m (99mTc) and rhenium-188 (188Re) are an attractive radionuclide pair for clinical use due to their favorable decay properties for diagnosis (99mTc: T1/2 = 6 h, γ radiation = 140 keV) and therapy (188Re: T1/2 = 17 h, maximum energy = 2.12 MeV) and to their availability in the form of 99Mo/99mTc and 188W/188Re generators. The radionuclides can be conjugated to mAb using similar chemical procedures. The aim of this work was to study the labeling of anti-CD20 mAb (RTX) with 188Re using two techniques: the direct labeling method [188Re(V)] and the labeling method via the carbonyl nucleus [188Re(I)]. Besides the quality control, the radiolabeled mAb was submitted to in vivo, in vitro and ex vivo biological studies. For the direct labeling, RTX was reducing by incubation with 2-mercaptoethanol for generating sulphydryl groups (-SH) and further labeled with 188Re(V), in a study of several parameters in order to reach an optimized formulation. The labeling via the carbonyl nucleus both 99mTc and 188Re were employed through 2 different procedures: (1) labeling of intact RTX with 99mTc(I) and (2) reduced RTX (RTXred) labeled with 99mTc(I)/188Re(I). Also a parameter study was performed to obtain an optimized formulation. The quality control method for evaluating the radiochemical purity showed a good labeling yield (93%) for the direct method. The labeling method via carbonyl group, the results showed that the SH groups of RTXred are a possible way of labeling. The formulation of 99mTc(I)-RTXred was faster than 188Re(I)-RTXred, that on the other hand showed better stability in human plasma and no transquelation in the cysteine or histidine challenge studies. Both compounds showed good binding affinity and a biodistribution in mice bearing tumor compatible with the normal mAb distribution and a reasonable tumor uptake proving the efficiency of the labeling and the potential clinical use.

A radioimunoterapia tem se mostrado uma modalidade terapêutica promissora, especialmente para terapia de tumores hematológicos o que tem impulsionado o desenvolvimento deste tipo de radiofármaco. Existe hoje apenas um radioimunoconjugado aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA), ibritumomabe-tiuxetan-90Y (Zevalin®), e ele apresenta maior taxa de resposta global e de remissão completa quando comparados aos tratamentos convencionais. Entretanto, nenhum deles é comercialmente disponível no Brasil. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi estudar as etapas envolvidas no processo de conjugação e radiomarcação com Lu-177 do anticorpo monoclonal anti-CD20, de forma que fosse possível consolidar nacionalmente a metodologia para desenvolvimento de outros radioimunoconjugados. Nos estudos realizados para determinar a melhor razão molar anticorpo:quelante (DOTA), a razão molar 1:50, apresentou pureza radioquímica elevada (superior a 95%, após a purificação) e imunorreatividade superior a muitos estudos publicados. Além disto, o imunoconjugado apresentou estabilidade de, no mínimo 3 meses, sob refrigeração quando conjugado por dois métodos diferentes. O estudo dos parâmetros de radiomarcação permitiu a obtenção de um radioimunoconjugado com atividade específica de 740 MBq/mg, com estabilidade suficientemente longa que permitirá seu transporte às clínicas médicas. Os perfis de biodistribuição e farmacocinético foram compatíveis com outros radioimunoconjugados encontrados na literatura. O radioimunoconjugado apresentou captação tumoral e estabilidade in vivo apreciáveis, esta última evidenciada pela baixa captação óssea. Realizaram-se estudos de liofilização da formulação aperfeiçoada do imunoconjugado que promoveram a liofilização sem dano estrutural evidenciado por eletroforese em gel de poliacrilamida com manutenção da imunorreatividade. A pureza radioquímica foi acima de 95% (após purificação) quando radiomarcado com atividade específica de 740 MBq/mg, com estabilidade relevante quando armazenado à -20 °C por até 48 horas. Foi possível não somente padronizar as metodologias de conjugação e radiomarcação de anticorpos monoclonais, mas também aprimorá-las de forma que o radioimunoconjugado produzido foi superior em muitos aspectos quando comparado com a literatura publicada. Conclui-se, portanto, que o radioimunoconjugado anti-CD20-DOTA-177Lu é uma ferramenta promissora para o tratamento de tumores linfáticos que expressam o receptor CD20. / The radioimmunotherapy (RIT) has proven to be a promising therapeutic modality, especially for therapy of hematological malignancies, which has stimulated the development of this type of radiopharmaceutical. Currently, there is one radioimmunoconjugated approved by Food and Drug Administration (FDA) for refractory or relapsed non-Hodgkin lymphoma (NHL) therapy, 90Y-ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), and it has higher overall response and complete remission rates compared to conventional treatments. However, Zevalin® is not commercially available in Brazil. In this context, the goal of this work was to study the steps involved in the process of conjugation and radiolabeling with Lu-177 of anti-CD20 monoclonal antibody, in order to consolidate the in house methodology for development of this radioimmunoconjugate, contributing for the treatment of patients with NHL and also contributing for the future development of other radioimmunoconjugates. In the studies performed to determine the best antibody: chelator (DOTA) molar ratio, the molar ratio 1:50, showed high radiochemical purity (greater than 95% after purification) and the immunoreactivity was higher than many published studies. Additionally, the immunoconjugate was stable for, at least, 3 months under refrigeration when conjugated by two different methods. The study of radiolabeling parameters, produced a radioimmunoconjugate with specific activity of 740 MBq/mg, with adequate stability that allowed the transportation of the radiopharmaceutical to nuclear medicine centers. The biodistribution and pharmacokinetic profiles were consistent with other radioimmunoconjugates in the literature. The radioimmunoconjugate showed tumor uptake and in vivo stability appreciable, the latter evidenced by low bone uptake. The lyophilization studies were performed for the optimized formulation of immunoconjugate that allowed the lyophilization without structural damage, evidenced by polyacrylamide gel electrophoresis, and with maintenance of immunoreactivity. The radiochemical purity was above 95% (after purification) when radiolabeled with a specific activity of 740 MBq/mg, with significant stability when stored at -20 ° C for 48 hours. It was possible, not only to standardize the conjugation of the monoclonal antibody and radiolabelling methodologies, but also improve them so that the radioimmunoconjugate produced was superior in many aspects when compared with the published literature. In conclusion, the radioimmunoconjugate 177Lu-DOTA-anti-CD20 is a promising tool for the therapy of tumors that express CD20.

A Medicina Nuclear é uma modalidade de particular importância em oncologia e a investigação de novos radiofármacos direcionados a tumores, seja para diagnóstico e/ou terapia, é uma área de interesse para os pesquisadores. Rituximab (RTX) é um anticorpo monoclonal (AcM) quimérico (IgG 1) que se liga especificamente ao antígeno CD20 com alta afinidade e tem sido usado com sucesso para tratar Linfoma Não-Hodgkin (LNH) de células-B. O antígeno CD20 é expresso sobre mais de 90% dos LNH de células-B. Tecnécio-99m (99mTc) e rênio-188 (188Re) representam um atrativo par de radionuclídeos para uso médico devido as favoráveis propriedades de decaimento para diagnóstico (99mTc: T1/2 = 6 h, radiação γ = 140 keV) e terapia (188Re: T1/2 = 17 h, radiação máxima = 2,12 MeV) e por causa de sua disponibilidade graças aos sistemas de geradores correspondentes 99Mo/99mTc e 188W/188Re. Estes dois radionuclídeos podem ser conjugados aos anticorpos usando métodos químicos similares. O objetivo geral deste trabalho foi estudar a marcação do AcM anti-CD20 (Rituximab) com o radioisótopo 188Re usando duas técnicas: método direto de marcação [188Re(V)] e método de marcação via núcleo carbonila [188Re(I)]. Além do controle de qualidade, o anticorpo radiomarcado foi submetido a estudo biológico in vivo, in vitro e ex vivo. Para a marcação direta, o RTX foi reduzido pela incubação com o agente redutor 2-mercaptoetanol para a geração de grupos sulfidrilas (-SH) e posteriormente marcado com 188Re(V), fazendo-se um amplo estudo de variáveis para se chegar a uma formulação otimizada. Para a marcação usando o núcleo carbonila foram usados os radioisótopos 99mTc e 188Re e dois procedimentos de radiomarcação: (1) RTX nativo marcado com 99mTc(I) e (2) RTX reduzido (RTXred) marcado com 99mTc(I)/188Re(I). Também foi feito um estudo de variáveis para se chegar a formulação otimizada. O método de controle de qualidade para avaliação da pureza radioquímica mostrou um bom rendimento de marcação (93%) para o método direto. Na marcação com o núcleo carbonila, os resultados mostraram que os grupos -SH do anticorpo reduzido são uma possível via de ligação. A formação do composto 99mTc(I)-RTXred foi mais rápida do que 188Re(I)- RTXred, que por sua vez mostrou melhor estabilidade em plasma humano e nenhuma transquelação no desafio a histidina ou cisteína. Os dois compostos mostraram boa afinidade de ligação e uma biodistribuição em camundongos portadores de tumor coerente com a biodistribuição normal do anticorpo e razoável captação no tumor provando a eficiência do método de marcação e potencial uso clínico. / Nuclear Medicine is an unique and important modality in oncology and the development of new tumor-targeted radiopharmaceuticals for both diagnosis and therapy is an area of interest for researchers. Rituximab (RTX) is a quimeric monoclonal antibody (mAb) (IgG 1) that specifically binds to CD20 antigen with high affinity and has been successfully used for the treatment of Non-Hodgkin Lymphoma (NHL) of cell B. The CD20 antigen is expressed over more than 90% of cell B NHL. Technetium-99m (99mTc) and rhenium-188 (188Re) are an attractive radionuclide pair for clinical use due to their favorable decay properties for diagnosis (99mTc: T1/2 = 6 h, γ radiation = 140 keV) and therapy (188Re: T1/2 = 17 h, maximum energy = 2.12 MeV) and to their availability in the form of 99Mo/99mTc and 188W/188Re generators. The radionuclides can be conjugated to mAb using similar chemical procedures. The aim of this work was to study the labeling of anti-CD20 mAb (RTX) with 188Re using two techniques: the direct labeling method [188Re(V)] and the labeling method via the carbonyl nucleus [188Re(I)]. Besides the quality control, the radiolabeled mAb was submitted to in vivo, in vitro and ex vivo biological studies. For the direct labeling, RTX was reducing by incubation with 2-mercaptoethanol for generating sulphydryl groups (-SH) and further labeled with 188Re(V), in a study of several parameters in order to reach an optimized formulation. The labeling via the carbonyl nucleus both 99mTc and 188Re were employed through 2 different procedures: (1) labeling of intact RTX with 99mTc(I) and (2) reduced RTX (RTXred) labeled with 99mTc(I)/188Re(I). Also a parameter study was performed to obtain an optimized formulation. The quality control method for evaluating the radiochemical purity showed a good labeling yield (93%) for the direct method. The labeling method via carbonyl group, the results showed that the SH groups of RTXred are a possible way of labeling. The formulation of 99mTc(I)-RTXred was faster than 188Re(I)-RTXred, that on the other hand showed better stability in human plasma and no transquelation in the cysteine or histidine challenge studies. Both compounds showed good binding affinity and a biodistribution in mice bearing tumor compatible with the normal mAb distribution and a reasonable tumor uptake proving the efficiency of the labeling and the potential clinical use.

A radioimunoterapia (RIT) faz uso de anticorpos monoclonais conjugados com radionuclídeos emissores α ou β-, ambos para terapia. O tratamento baseia-se na irradiação e destruição do tumor, preservando os órgãos normais quanto ao excesso de radiação. Radionuclídeos emissores β- como 90Y, 131I, 177Lu e 188Re, são úteis para o desenvolvimento de radiofármacos terapêuticos e, quando associados a AcM como o Anti-CD20 são importantes principalmente para o tratamento de Linfomas Não Hodgkins (LNH). 188Re (Eβ- = 2,12 MeV; Eγ= 155 keV; t1/2 = 16,9 h) é um radionuclídeo atrativo para RIT. O Centro de Radiofarmácia do IPEN possui um projeto que visa a produção do radiofármaco 188Re-Anti-CD20. Com isso,este estudo foi proposto para avaliar a eficácia desta técnica de marcação para tratamento em termos compartimentais e dosimétricos. O objetivo deste trabalho consistiu na compararação da marcação do AcM anti-CD20 com 188Re com a marcação do anticorpo com 90Y, 131I, 177Lu e 99mTc (pelas suas características químicas similares) e 211At, 213Bi, 223Ra e 225Ac. Através do estudo de técnicas de marcação relatadas em literatura, foi proposto um modelo compartimental para avaliação de sua farmacocinética e estudos dosimétricos, de alto interesse para a terapia. A revisão de dados publicados na literatura, possibilitou demonstrar diferentes procedimentos de marcação, rendimentos de marcação, tempo de reação, impurezas e estudos de biodistribuição. O resultado do estudo mostra uma cinética favorável para o 188Re, pelas suas características físicas e químicas frente aos demais radionuclídeos avaliados. O estudo compartimental proposto descreve o metabolismo do 188Re-anti-CD20 através de um modelo compartimental mamilar, que pela sua análise farmacocinética, realizada em comparação aos produtos marcados com emissores β-: 131I-antiCD20, 177Lu-anti-CD20, o emissor γ 99mTc-anti-CD20 e o emissor α 211At-Anti-CD20, apresentou uma constante de eliminação de aproximadamente 0,05 horas-1 no sangue do animal. A avaliação dosimétrica do 188Re-Anti-CD20 foi realizada através de duas metodologias: pelo método de Monte Carlo e pelo uso de uma fonte pontual β- através da Fórmula de Loevinger via programa Excel. Através da Fórmula de Loevinger fez-se a validação do método de Monte Carlo para a dosimetria do 188Re-Anti-CD20 e dos demais produtos. As doses e as taxas de doses obtidas pelos dois métodos foram avaliadas em comparação à dosimetria do 90Y-Anti-CD20, 131I-Anti-CD20 e do 177Lu-Anti-CD20, obtidas pela mesma metodologia. O estudo de dose foi realizado utilizando modelos matemáticos considerando um camundongo nude de 25g, simulando diferentes tamanhos de tumor e diferentes formas de distribuição do produto dentro do animal. De acordo com os resultados obtidos, pela energia de emissão β-, 188Re-Anti-CD20 apresenta maior deposição de energia para tumores volumosos em relação aos demais produtos avaliados. Em uma simulação com 100% do produto captado pelo tumor, 89% da dose total manteve-se absorvida pelo tumor, preservando a integridade de ógãos críticos como coração (2%), pulmões (5%), coluna (4%), fígado (0,014%) e rins (0,0007%). Em uma simulação onde há uma biodistribuição do produto no organismo do animal, 38% da dose total é absorvida pelo tumor e >3% é absorvida pela coluna. Nessa situação mais próxima da realidade, a extrapolação dos dados para um humano de 70kg, mostrou que a dose absorvida no tumor corresponde a cerca de 33%; na coluna 7% e o coração receberia uma dose de 35% do total. A análise compartimental e dosimétrica apresentada neste trabalho, realizada através do uso de um modelo animal para o 188Re-Anti-CD20 mostra que o produto desenvolvido e apresentado em literatura é candidato promissor para a RIT. / The radioimmunotherapy (RIT) uses MAbs conjugated to radionuclides α or β- emitters, both for therapy. Your treatment is based on the irradiation and tumor destruction, preserving the normal organs as the excess radiation. Radionuclides β- emitters as 131I, 90Y, 188Re 177Lu and are useful for the development of therapeutic radiopharmaceuticals and, when coupled with MAb and Anti-CD20 it is important mainly for the treatment of non-Hodgkin\'s lymphomas (NHL). 188Re (Eβ- = 2.12 MeV; Eγ = 155 keV; t1/2 = 16.9 h) is an attractive radionuclide for RIT. However, 188Re can be obtained from a radionuclide generator of 188W/188Re, commercially available, making it convenient for use in research and for clinical routine. The CR of IPEN has a project aimed at the production of radiopharmaceutical 188Re-Anti-CD20, where the radionuclide can be obtained from a generator system 188W/188Re. With this proposed a study to assess the efficiency of this labeling technique for treatment in accordance compartmental and dosimetry. The objective of this study was to compare the marking of anti-CD20 MAb with 188Re with the marking of the antibody with 90Y, 131I, 177Lu and 99mTc (for their similar chemical characteristics) and 211At, 213Bi, 223Ra and 225Ac); through the study of labeling techniques reported in literature, the proposal of a compartmental model to evaluate its pharmacokinetic and dosimetric studies, high interest for therapy. The result of the study shows a favorable kinetics for 188Re, by their physical and chemical characteristics compared to the other evaluated radionuclides. The compartment proposed study describes the metabolism of 188Re-anti-CD20 through a compartment mammillary model, which by their pharmacokinetic analysis, performed compared to products emissores β- 131I-labeled antiCD20, 177Lu-anti-CD20, the γ emitter 99mTc-Anti-CD20 and emitter 211At-Anti-CD20 presented a elimination constant of approximately 0.05 hours-1 in the animal\'s blood. The dosimetric evaluation of 188Re-Anti-CD20 was performed using two methodologies: the Monte Carlo method and the use of a point source β- by Formula Loevinger by Excel program. In the Formula Loevinger, there was a validation of the Monte Carlo method for dosimetry of 188Re-Anti-CD20 and other products. The doses and dose rates obtained by the two methods were evaluated in comparison with 90Y-Anti-CD20, 131I-Anti-CD20 and 177Lu-Anti-CD20 dosimetry, obtained by the same methodology. The dose study was conducted using mathematical models considering a nude mouse 25 g, simulating different tumor sizes and different forms of distribution of the product within the animal. According to the results, the energy emission β-, 188Re-Anti-CD20 has a higher energy deposition for large tumors when compared to other products evaluated. In a simulation with 100% of the product uptake by tumor, 89% of the total dose remained absorbed by the tumor, while preserving the integrity of critical ógãos as heart (2%), lung (5%), column (4%), liver (0.014%) and kidneys (0.0007%). In a simulation where there is a biodistribution of the product in the animal organism, 38% of the total dose absorbed by the tumor and >3% is absorbed by the column. In this situation closer to reality, the extrapolation of the data for a 70kg human, showed that the absorbed dose to tumor corresponds to about 33%; In column 7% and the heart would receive a dose of 35% of the total. The compartmental analysis and dosimetric presented in this work, performed through use of an animal model for the 188Re-anti-CD20 shows that the product developed and presented in the literature is promising candidate for RIT.

A radioimunoterapia tem se mostrado uma modalidade terapêutica promissora, especialmente para terapia de tumores hematológicos o que tem impulsionado o desenvolvimento deste tipo de radiofármaco. Existe hoje apenas um radioimunoconjugado aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA), ibritumomabe-tiuxetan-90Y (Zevalin®), e ele apresenta maior taxa de resposta global e de remissão completa quando comparados aos tratamentos convencionais. Entretanto, nenhum deles é comercialmente disponível no Brasil. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi estudar as etapas envolvidas no processo de conjugação e radiomarcação com Lu-177 do anticorpo monoclonal anti-CD20, de forma que fosse possível consolidar nacionalmente a metodologia para desenvolvimento de outros radioimunoconjugados. Nos estudos realizados para determinar a melhor razão molar anticorpo:quelante (DOTA), a razão molar 1:50, apresentou pureza radioquímica elevada (superior a 95%, após a purificação) e imunorreatividade superior a muitos estudos publicados. Além disto, o imunoconjugado apresentou estabilidade de, no mínimo 3 meses, sob refrigeração quando conjugado por dois métodos diferentes. O estudo dos parâmetros de radiomarcação permitiu a obtenção de um radioimunoconjugado com atividade específica de 740 MBq/mg, com estabilidade suficientemente longa que permitirá seu transporte às clínicas médicas. Os perfis de biodistribuição e farmacocinético foram compatíveis com outros radioimunoconjugados encontrados na literatura. O radioimunoconjugado apresentou captação tumoral e estabilidade in vivo apreciáveis, esta última evidenciada pela baixa captação óssea. Realizaram-se estudos de liofilização da formulação aperfeiçoada do imunoconjugado que promoveram a liofilização sem dano estrutural evidenciado por eletroforese em gel de poliacrilamida com manutenção da imunorreatividade. A pureza radioquímica foi acima de 95% (após purificação) quando radiomarcado com atividade específica de 740 MBq/mg, com estabilidade relevante quando armazenado à -20 °C por até 48 horas. Foi possível não somente padronizar as metodologias de conjugação e radiomarcação de anticorpos monoclonais, mas também aprimorá-las de forma que o radioimunoconjugado produzido foi superior em muitos aspectos quando comparado com a literatura publicada. Conclui-se, portanto, que o radioimunoconjugado anti-CD20-DOTA-177Lu é uma ferramenta promissora para o tratamento de tumores linfáticos que expressam o receptor CD20. / The radioimmunotherapy (RIT) has proven to be a promising therapeutic modality, especially for therapy of hematological malignancies, which has stimulated the development of this type of radiopharmaceutical. Currently, there is one radioimmunoconjugated approved by Food and Drug Administration (FDA) for refractory or relapsed non-Hodgkin lymphoma (NHL) therapy, 90Y-ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), and it has higher overall response and complete remission rates compared to conventional treatments. However, Zevalin® is not commercially available in Brazil. In this context, the goal of this work was to study the steps involved in the process of conjugation and radiolabeling with Lu-177 of anti-CD20 monoclonal antibody, in order to consolidate the in house methodology for development of this radioimmunoconjugate, contributing for the treatment of patients with NHL and also contributing for the future development of other radioimmunoconjugates. In the studies performed to determine the best antibody: chelator (DOTA) molar ratio, the molar ratio 1:50, showed high radiochemical purity (greater than 95% after purification) and the immunoreactivity was higher than many published studies. Additionally, the immunoconjugate was stable for, at least, 3 months under refrigeration when conjugated by two different methods. The study of radiolabeling parameters, produced a radioimmunoconjugate with specific activity of 740 MBq/mg, with adequate stability that allowed the transportation of the radiopharmaceutical to nuclear medicine centers. The biodistribution and pharmacokinetic profiles were consistent with other radioimmunoconjugates in the literature. The radioimmunoconjugate showed tumor uptake and in vivo stability appreciable, the latter evidenced by low bone uptake. The lyophilization studies were performed for the optimized formulation of immunoconjugate that allowed the lyophilization without structural damage, evidenced by polyacrylamide gel electrophoresis, and with maintenance of immunoreactivity. The radiochemical purity was above 95% (after purification) when radiolabeled with a specific activity of 740 MBq/mg, with significant stability when stored at -20 ° C for 48 hours. It was possible, not only to standardize the conjugation of the monoclonal antibody and radiolabelling methodologies, but also improve them so that the radioimmunoconjugate produced was superior in many aspects when compared with the published literature. In conclusion, the radioimmunoconjugate 177Lu-DOTA-anti-CD20 is a promising tool for the therapy of tumors that express CD20.

Les anticorps monoclonaux (AcM) ont été utilisés pour traiter des cancers dès le début des années 1980, en particulier lors du travail pionnier de l’équipe de Ronald Levy dans le traitement des lymphomes. Ces traitements ont pendant longtemps été considérés comme une sérothérapie passive à effet immédiat et à court terme. Cependant, au cours de ces dernières années, le concept d’un effet « vaccinal » des anticorps à usage thérapeutique en oncologie a peu à peu vu le jour du fait de réponses cliniques à long terme observées chez certains patients et de différentes études précliniques. En 2010, notre équipe a démontré que des souris immunocompétentes injectées avec les cellules tumorales EL4-huCD20 et traitées avec un AcM anti-huCD20 générait une réponse immunitaire anti-tumorale à long-terme par le biais de mécanismes dépendants de la région constante de l’anticorps et de lymphocytes T CD4+. Mon travail de thèse a donc porté sur l’analyse des mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels le traitement par un AcM anti-CD20 génère une immunité cellulaire adaptative anti-tumorale. J’ai ainsi pu montrer que le traitement des souris avec l’AcM anti-CD20 conduit à une expansion de lymphocytes Th1 producteurs d’IFN-γ, à l’apparition de lymphocytes T CD4+ effecteurs mémoires spécifiques des cellules tumorales CD20+, et au blocage de l’expansion de lymphocytes Tregs induite par les cellules tumorales. Le rôle central dans la protection anti-tumorale et la genèse d’une réponse adaptative anti-tumorale joué par l’axe IL-12/IFN-γ et leurs principales sources cellulaires, cellules dendritiques (DCs) et cellules NK, a été démontré par des expériences de neutralisation de ces cytokines, qui provoque une importante diminution du nombre de Th1 spléniques, de déplétion des cellules NK, ainsi que par des analyses phénotypiques qui ont permis d’identifier des DCs activées par le traitement - comme le montre l’expression accrue des molécules de classe II du CMH et de co-stimulation CD80 et CD86 - comme une importante source cellulaire de l’IL-12. Enfin, nous avons pu montrer qu’un variant de l’IL-2, liant préférentiellement le récepteur de l’IL-2By et faiblement le récepteur de l’IL-2aBy exprimé majoritairement par les Tregs, permettait l’obtention d’une protection anti-tumorale accrue d’animaux porteurs de tumeurs et traités par l’AcM anti-CD20. En conclusion, nous avons démontré qu’un contexte immunitaire pro-tumoral façonné par la présence d’une tumeur en développement peut être inversé par le traitement par un anticorps anti-tumoral, aboutissant à un contexte anti-tumoral. Qu’une telle réponse immunitaire adaptative cellulaire puisse être observée chez des patients atteints de lymphomes, traités par un anticorps anti-CD20, reste encore à être déterminé. / Monoclonal antibodies have been used to treat cancers since the early 1980s, in particular with the pioneer work of Ronald Levy for the treatment of lymphomas. Those treatments have been considered for a long time as a passive serotherapy with immediate and short term actions. Yet, recently, the idea of a vaccine effect of therapeutic antibodies in oncology have appeared, after preclinical studies and clinic observations suggesting a long term immune response in patients. In 2010, our team demonstrated that immunocompetent mice injected with EL4-huCD20 tumor cells and treated with anti-huCD20 monoclonal antibody generated a long term anti-tumor immune response linked with mechanisms dependent on constant part of antibodies and CD4+ T cells. My PhD work was based on the analysis of cellular and molecular mechanisms by which the treatment by an anti-CD20 mAb generates a cellar adaptive anti-tumor immunity. I could show that the treatment of mice with anti-CD20 antibody lead to the expansion of Th1 lymphocytes IFN-γ producers, to the apparition of effector memory CD4+ T cells specific for CD20 antigen, and to the blockade of the expansion of Treg cells induced by tumor cells. The key role of an adaptive anti-tumor immune response played by IL-12/IFN- γ and their main cellular sources, dendritic cells and NK cells, in the anti-tumor protection and genesis, has been demonstrated by experiments of cytokine neutralization, provoking an important decrease of splenic Th1 number, by NK depletion and by phenotypic analysis that allowed the identification of DCs activated by the treatment – as it is shown by the increased expression of MHC-II and CD80 and CD86 costimulation molecules, - as an important cellular source of IL-12. Finally, we could show that a variant of IL-2, binding preferentially IL-2By with a lower affinity for the IL-2aBy receptor mainly expressed by Tregs, could induce an increased anti-tumor protection of tumor-bearing animals treated with anti-CD20 mAb. In conclusion, we have demonstrated that a pro-tumor immune contexture affected by a growing tumor can be modified by an anti-tumor antibody leading to an anti-tumor contexture. That such cellular adaptive immune response could be observed in lymphoma patients treated with anti-CD20 still need to be determined.

Les anticorps monoclonaux (AcM) ont été utilisés pour traiter des cancers dès le début des années 1980, en particulier lors du travail pionnier de l’équipe de Ronald Levy dans le traitement des lymphomes. Ces traitements ont pendant longtemps été considérés comme une sérothérapie passive à effet immédiat et à court terme. Cependant, au cours de ces dernières années, le concept d’un effet « vaccinal » des anticorps à usage thérapeutique en oncologie a peu à peu vu le jour du fait de réponses cliniques à long terme observées chez certains patients et de différentes études précliniques. En 2010, notre équipe a démontré que des souris immunocompétentes injectées avec les cellules tumorales EL4-huCD20 et traitées avec un AcM anti-huCD20 générait une réponse immunitaire anti-tumorale à long-terme par le biais de mécanismes dépendants de la région constante de l’anticorps et de lymphocytes T CD4+. Mon travail de thèse a donc porté sur l’analyse des mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels le traitement par un AcM anti-CD20 génère une immunité cellulaire adaptative anti-tumorale. J’ai ainsi pu montrer que le traitement des souris avec l’AcM anti-CD20 conduit à une expansion de lymphocytes Th1 producteurs d’IFN-γ, à l’apparition de lymphocytes T CD4+ effecteurs mémoires spécifiques des cellules tumorales CD20+, et au blocage de l’expansion de lymphocytes Tregs induite par les cellules tumorales. Le rôle central dans la protection anti-tumorale et la genèse d’une réponse adaptative anti-tumorale joué par l’axe IL-12/IFN-γ et leurs principales sources cellulaires, cellules dendritiques (DCs) et cellules NK, a été démontré par des expériences de neutralisation de ces cytokines, qui provoque une importante diminution du nombre de Th1 spléniques, de déplétion des cellules NK, ainsi que par des analyses phénotypiques qui ont permis d’identifier des DCs activées par le traitement - comme le montre l’expression accrue des molécules de classe II du CMH et de co-stimulation CD80 et CD86 - comme une importante source cellulaire de l’IL-12. Enfin, nous avons pu montrer qu’un variant de l’IL-2, liant préférentiellement le récepteur de l’IL-2By et faiblement le récepteur de l’IL-2aBy exprimé majoritairement par les Tregs, permettait l’obtention d’une protection anti-tumorale accrue d’animaux porteurs de tumeurs et traités par l’AcM anti-CD20. En conclusion, nous avons démontré qu’un contexte immunitaire pro-tumoral façonné par la présence d’une tumeur en développement peut être inversé par le traitement par un anticorps anti-tumoral, aboutissant à un contexte anti-tumoral. Qu’une telle réponse immunitaire adaptative cellulaire puisse être observée chez des patients atteints de lymphomes, traités par un anticorps anti-CD20, reste encore à être déterminé. / Monoclonal antibodies have been used to treat cancers since the early 1980s, in particular with the pioneer work of Ronald Levy for the treatment of lymphomas. Those treatments have been considered for a long time as a passive serotherapy with immediate and short term actions. Yet, recently, the idea of a vaccine effect of therapeutic antibodies in oncology have appeared, after preclinical studies and clinic observations suggesting a long term immune response in patients. In 2010, our team demonstrated that immunocompetent mice injected with EL4-huCD20 tumor cells and treated with anti-huCD20 monoclonal antibody generated a long term anti-tumor immune response linked with mechanisms dependent on constant part of antibodies and CD4+ T cells. My PhD work was based on the analysis of cellular and molecular mechanisms by which the treatment by an anti-CD20 mAb generates a cellar adaptive anti-tumor immunity. I could show that the treatment of mice with anti-CD20 antibody lead to the expansion of Th1 lymphocytes IFN-γ producers, to the apparition of effector memory CD4+ T cells specific for CD20 antigen, and to the blockade of the expansion of Treg cells induced by tumor cells. The key role of an adaptive anti-tumor immune response played by IL-12/IFN- γ and their main cellular sources, dendritic cells and NK cells, in the anti-tumor protection and genesis, has been demonstrated by experiments of cytokine neutralization, provoking an important decrease of splenic Th1 number, by NK depletion and by phenotypic analysis that allowed the identification of DCs activated by the treatment – as it is shown by the increased expression of MHC-II and CD80 and CD86 costimulation molecules, - as an important cellular source of IL-12. Finally, we could show that a variant of IL-2, binding preferentially IL-2By with a lower affinity for the IL-2aBy receptor mainly expressed by Tregs, could induce an increased anti-tumor protection of tumor-bearing animals treated with anti-CD20 mAb. In conclusion, we have demonstrated that a pro-tumor immune contexture affected by a growing tumor can be modified by an anti-tumor antibody leading to an anti-tumor contexture. That such cellular adaptive immune response could be observed in lymphoma patients treated with anti-CD20 still need to be determined.