Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2013-12-05T21:42:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 247671.pdf: 27894847 bytes, checksum: a479548bb1f33c89d9a879a1747171c7 (MD5) Previous issue date: 2008 / A proteína G do virus rábico contém 505 aminoácidos em sua forma nativa, sendo exposta na superfície da partícula viral. Esta proteína é importante para a infectividade viral e imunidade protetora, sendo o antígeno que induz anticorpos neutralizantes contra o vírus. Diversos epítopos lineares, identificados por anticorpos monoclonais, foram identificados na região central da proteína. Nesse estudo, uma região compreendendo esses epítopos (resíduos 179-281, cepa ERA), denominada rGERA179-281, foi clonada e expressa em Escherichia coli cepa Rosetta, ligada a uma cauda de histidina na região N-terminal. A expressão resultou na formação de agregados insolúveis da proteína em corpos de inclusão. Os corpos de inclusão foram solubilizados com cloreto de guanidina 6M e a proteína foi purificada por cromatrografia de afinidade por íons metálicos imobilizados, em condições desnaturantes, sendo sua identidade confirmada por espectrometria de massa. A proteína purificada (13,8 kDa) foi reconhecida por anticorpos presentes na preparação comercial de imunoglobulina antirábica humana (HRIG), por meio de immunoblotting. Além disso, por um método de inibição de neutralização, a rGERA179-281 levou a uma redução mensurável na atividade neutralizante da HRIG. Para analisar a imunogenicidade da proteína, camundongos foram imunizados com a rGERA179-281. Observou-se, pela técnica de imunofluorescência indireta, que amostras de soro destes animais foram capazes de reconhecer o vírus rábico na forma nativa em células infectadas, embora não tenha sido observada uma indução de títulos neutralizantes acima de 0,5 UI/ml. Esses resultados, juntamente com o bom rendimento obtido, geram perspectivas de estudos posteriores mais detalhados das propriedades imunológicas da rGERA179-281, além da sua possível aplicação no desenvolvimento de novos métodos de diagnóstico. The G protein, which coats the outer surface of the rabies virus, contains 505 amino acids in its native form and it is important for virus infectivity and induction of the protective immunity. In this study, the region comprising linear epitopes (residues 179 to 281, ERA strain), named rGERA179-281, was cloned in frame with a hexahistidine tag coding sequence at its N-terminal end and overexpressed in Escherichia coli Rosetta strain. The expression yielded insoluble protein aggregates in the form of inclusion bodies. The inclusion bodies were solubilized with 6M guanidine HCl and the protein was purified by immobilized metal affinity chromatography under denaturing conditions. Mass spectrometry data confirmed the identity of the protein. The purified protein (13.8 kDa) showed significant reactivity with antibodies present in a therapeutic human rabies immune globulin (HRIG), as demonstrated by immunoblotting analysis. In addition, by an in vitro inhibition neutralization assay, rGERA179-281 led to a measurable reduction in the ability of HRIG to neutralize rabies virus. For analyzing the immunogenic property of the protein, mice were immunized with rGERA179-281. The antibodies elicited in the mouse serum samples recognized the native form of rabies virus in the virus-infected cells by immunofluorescence assay. However, significant titers of virus neutralizing antibodies were not detected. These results, along with the good yield obtained, encourage further studies on the more detailed immunological properties of rGERA179-281 and the production of anti-G monoclonal antibodies, which together, might be useful for the development of new diagnostic methods.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have demonstrated significant potential for clinical use due to their convenient isolation, lack of significant immunogenicity, lack of ethical controversy and their potential to differentiate into tissue-specific cell types. MSCs reside in almost all tissues including the adipose tissue. Adipose tissue has main advantages as wide distribution in the organism, suitable isolation and considerable amount of resident multipotent stem cells. Therefore, in this study, adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (AT-MSCs) were isolated from BALB/c mice omentum and epididymis fat pats. During AT-MSCs maintenance and expansion in vitro, they were characterized for the expression of antigenic surface markers and for osteogenic, chondrogenic, and adipogenic differentiation potential. AT-MSCs form both sources expressed mesenchymal surface markers, CD73, and CD105 and were negative for a hematopoietic marker, CD45. The cultures derived from both adipose tissues differentiated into all three lineages. However, differences were observed in mesenchymal surface marker expression profiles as well as in the differentiation potential of AT-MSCs from different fat sources. Furthermore, AT-MSCs isolated from omentum fat depot were cultured with differentiation medium containing retinoic acid and testicular cell conditioned medium. After treatment periods, AT-MSCs showed Gdnf gene expression, this gene is a marker for Sertoli cells. The results showed that AT-MSCs from distinct fat depots have different characteristics related to stem cell surface marker expression profiles and differentiation potential. / Células-tronco mesenquimais têm demonstrado significativo potencial para aplicação terapêutica devido ao seu fácil isolamento, baixa imunogenicidade, ausência das implicações éticas e sua ampla plasticidade. Essas células estão nos mais diversos tecidos, destacando-se o tecido adiposo devido á sua ampla distribuição no organismo, conveniente obtenção e o considerável número de células-tronco mesenquimais multipotentes que podem ser isoladas desse tecido. Assim sendo, no presente estudo, células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (AT-MSCs) foram isoladas do tecido adiposo localizado nas regiões próximas ao omento e testículos de camundongos BALB/c. Durante a manutenção e expansão das AT-MSCs in vitro, elas foram caracterizadas quanto à presença de marcadores antigênicos de superfície e potencial de diferenciação nas linhagens osteogênica, condrogênica e adipogênica. AT-MSCs de ambas as fontes expressaram os marcadores mesenquimais de superfície, CD73 e CD105, assim como foram negativas para o marcador de linhagens hematopoiéticas, CD45. Quanto ao potencial de diferenciação, os cultivos provenientes das duas origens de tecido adiposo apresentaram capacidade de diferenciar nas três linhagens acima citadas. Porém, foram observadas discretas diferenças tanto nos padrões de expressão dos marcadores mesenquimais de superfície quanto nos potenciais de diferenciação entre as AT-MSCs provenientes dos diferentes locais de deposição de gordura. Além disso, as AT-MSCs isoladas do tecido adiposo depositado em contato com o omento quando cultivadas com meios de diferenciação, contendo ácido retinóico e meio condicionado testicular demonstraram expressão do gene Gdnf o qual é reconhecidamente expresso pelas células de Sertoli. Portanto, os resultados obtidos demonstram que conforme a origem do tecido adiposo as AT-MSCs possuem diferentes características relacionadas aos marcadores de superfície assim como aos potenciais de diferenciação.