Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2013-12-05T21:42:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 247671.pdf: 27894847 bytes, checksum: a479548bb1f33c89d9a879a1747171c7 (MD5) Previous issue date: 2008 / A proteína G do virus rábico contém 505 aminoácidos em sua forma nativa, sendo exposta na superfície da partícula viral. Esta proteína é importante para a infectividade viral e imunidade protetora, sendo o antígeno que induz anticorpos neutralizantes contra o vírus. Diversos epítopos lineares, identificados por anticorpos monoclonais, foram identificados na região central da proteína. Nesse estudo, uma região compreendendo esses epítopos (resíduos 179-281, cepa ERA), denominada rGERA179-281, foi clonada e expressa em Escherichia coli cepa Rosetta, ligada a uma cauda de histidina na região N-terminal. A expressão resultou na formação de agregados insolúveis da proteína em corpos de inclusão. Os corpos de inclusão foram solubilizados com cloreto de guanidina 6M e a proteína foi purificada por cromatrografia de afinidade por íons metálicos imobilizados, em condições desnaturantes, sendo sua identidade confirmada por espectrometria de massa. A proteína purificada (13,8 kDa) foi reconhecida por anticorpos presentes na preparação comercial de imunoglobulina antirábica humana (HRIG), por meio de immunoblotting. Além disso, por um método de inibição de neutralização, a rGERA179-281 levou a uma redução mensurável na atividade neutralizante da HRIG. Para analisar a imunogenicidade da proteína, camundongos foram imunizados com a rGERA179-281. Observou-se, pela técnica de imunofluorescência indireta, que amostras de soro destes animais foram capazes de reconhecer o vírus rábico na forma nativa em células infectadas, embora não tenha sido observada uma indução de títulos neutralizantes acima de 0,5 UI/ml. Esses resultados, juntamente com o bom rendimento obtido, geram perspectivas de estudos posteriores mais detalhados das propriedades imunológicas da rGERA179-281, além da sua possível aplicação no desenvolvimento de novos métodos de diagnóstico. The G protein, which coats the outer surface of the rabies virus, contains 505 amino acids in its native form and it is important for virus infectivity and induction of the protective immunity. In this study, the region comprising linear epitopes (residues 179 to 281, ERA strain), named rGERA179-281, was cloned in frame with a hexahistidine tag coding sequence at its N-terminal end and overexpressed in Escherichia coli Rosetta strain. The expression yielded insoluble protein aggregates in the form of inclusion bodies. The inclusion bodies were solubilized with 6M guanidine HCl and the protein was purified by immobilized metal affinity chromatography under denaturing conditions. Mass spectrometry data confirmed the identity of the protein. The purified protein (13.8 kDa) showed significant reactivity with antibodies present in a therapeutic human rabies immune globulin (HRIG), as demonstrated by immunoblotting analysis. In addition, by an in vitro inhibition neutralization assay, rGERA179-281 led to a measurable reduction in the ability of HRIG to neutralize rabies virus. For analyzing the immunogenic property of the protein, mice were immunized with rGERA179-281. The antibodies elicited in the mouse serum samples recognized the native form of rabies virus in the virus-infected cells by immunofluorescence assay. However, significant titers of virus neutralizing antibodies were not detected. These results, along with the good yield obtained, encourage further studies on the more detailed immunological properties of rGERA179-281 and the production of anti-G monoclonal antibodies, which together, might be useful for the development of new diagnostic methods.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia / Made available in DSpace on 2012-10-24T10:22:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 267873.pdf: 1341060 bytes, checksum: 8a157ec64201a7f397c63741dc64cf59 (MD5) / O presente estudo avaliou a possível ação antinociceptiva e antiinflamatória do derivado semi-sintético do triterpeno a e ß-amirina: denominado octanoato de a e ß-amirina (OA), em vários modelos experimentais in vivo e in vitro, em ratos e camundongos. O OA quando administrado pela via intraperitoneal (i.p.) (0,0001 - 0,1 mg/kg) ou oral (v.o.) (1 - 30 mg/kg), 30 e 60 min antes do teste, reduziu significativamente as contorções abdominais induzidas pelo ácido acético, com DI50 de 0,003 (0,001-0,005) e 7,15 (5,94-8,60) mg/kg e inibições de 85 ± 5% e 72 ± 9%, para a via i.p. e v.o., respectivamente. Além disso, o OA manteve seu efeito por até 8 h após sua administração i.p. no modelo de ácido acético. O pré-tratamento com OA (0,1 - 30 mg/kg) reduziu significativamente a nocicepção de origem inflamatória em 89 ± 6% e DI50 de 5,36 (3,98-7,23) mg/kg, mas não alterou a nocicepção de origem neurogênica induzidas pela formalina. O OA (0,001-1 mg/kg, i.p.), também reduziu a nocicepção induzida pela administração intraplantar (i.pl.) de glutamato e capsaicina, com DI50 de 0,04 (0,03-0,08) mg/kg e 1,36 (1,12-2,22) mg/kg e inibição de 65 ± 5% e 57 ± 7%, respectivamente. Além disso, o OA (0,1 mg/kg) causou redução da resposta nociceptiva induzida pela administração intratecal (i.t.) de glutamato, substância P e capsaicina, com inibições de 36 ± 1%, 67 ± 1% e 68 ± 1%, respectivamente. Perifericamente, a nocicepção causada pela capsaicina (0,2 nmol/pata, agonista seletivo dos receptores TRPV1) foi parcialmente revertida pela co-administração com OA (1,8 nmol/pata) ou capsazepina (0,2 nmol/pata, antagonista seletivo dos receptores TRPV1) com reversão de 77 ± 5% e 50 ± 4%, respectivamente. No modelo do ácido acético, a antinocicepção causada pelo OA (0,1mg/kg, i.p.) foi revertida pelo pré-tratamento com capsaicina (50 mg/kg, s.c., no período neonatal, depletor de fibras C e Ad que expressam o TRPV1), mas não em animais tratados com toxina Pertussis (1µg/sitio, i.t., inativador da proteína Gi/0), naloxona (1 mg/kg, i.p., antagonista não seletivo dos receptores opióides), PCPA (100 mg/kg, i.p., inibidor da enzima triptofano hidroxilase e depletor de serotonina endógena), ioimbina (0,15 mg/kg, i.p., antagonista seletivo dos receptores a2-adrenérgicos), mecamilamina (2 mg/kg, i.p., antagonista seletivo dos receptores nicotínicos a2ß3) e atropina (1 mg/kg, i.p., antagonista seletivo dos receptores muscarínicos). Além disso, o OA (0,1-1 mg/kg) foi capaz de reverter a hiperalgesia térmica em 76 ± 7% e 91 ± 4% e mecânica em 100% e 91 ± 2%, induzidas pela injeção intraplatar de BK e PMA, respectivamente. Embora, o mesmo tratamento não alterou a hiperalgesia provocada pela PGE2 em ratos. Além disso, o pré-tratamento com OA (3-30 mg/kg) reduziu a nocicepção induzida pela administração intraplantar de PMA (500 pmol/pata) com DI50 de 19,6 (13,5-28,8) mg/kg e inibição de 64 ± 9%. Contudo, não alterou a translocação da PKCe do citosol para a membrana em comparação com animais tratados com veículo. A atividade antiinflamatória foi avaliada no modelo de edema de pata induzido pela carragenina (300 µg/pata), onde foi observado que o pré-tratamento com o OA (0,1 - 10 mg/kg) reduziu significativamente e de forma dependente da dose o edema de pata, além disso, a Indometacina (4 mg/kg, Ind) também reduziu significativamente o edema. Os mesmo tratamentos com o OA e Ind diminuíram a atividade da MPO na pata em 100% e 60 ± 8%, respectivamente e DI50 0,2 (0,05 - 0,45) mg/kg para o OA. Tanto o tratamento sistêmico com OA (10 mg/kg) quanto com Ind (4 mg/kg) reduziram a níveis basais a quantidade de IL-1ß, mas não alteraram a quantidade de TNF-a presentes na pata dos animais que receberam carragenina. No modelo de pleurisia foi observado que o tratamento sistêmico com OA (0,1 - 10 mg/kg) reduziu significativamente e de forma dependente da dose a migração total de leucócitos e polimorfonucleares no líquido pleural e os níveis de MPO no pulmão, com DI50 de 4,5 (2,3 - 9,1), 4,7 (2,6-8,3) e 2,2 (0,3 - 7,2) mg/kg e redução de 57 ± 1%, 72 ± 5% e 95 ± 2%, respectivamente. Embora o mesmo tratamento não tenha alterado o extravasamento plasmático e também a migração de células mononucleares para a cavidade pleural. O tratamento com dexametasona (1 mg/kg, s.c.) também reduziu a migração total de leucócitos, migração de polimorfonuclear, atividade da MPO no pulmão e o extravasamento plasmático, com inibição de 63 ± 8%, 71 ± 1% e 93 ± 3%, 33 ± 7% respectivamente. Em síntese, estes resultados indicam que o OA possui atividade antinociceptiva e antiinflamatória em modelos químicos de dor e inflamação, através de mecanismos que podem envolver a interação com fibras aferentes sensíveis a capsaicina, bem como, pode interagir com outros membros da família da PKC, sem interferir com a PKCe. Além disso, o OA pode estar inibindo direta ou indiretamente a ação, produção ou liberação de mediadores pró-inflamatórios envolvidos na geração da dor e da inflamação.

Orientador: Wellerson Rodrigo Scarano / Resumo: The mono-n-butyl phthalate (MBP) is the active metabolite of di-n-butyl phthalate (DBP), a plasticizer commonly used for industrial products, including medical devices, flexible plastics and cosmetics, has been described as an endocrine disruptor with estrogenic and anti-androgenic function, depending on the dose and the exposure period, particularly by interfering with the development of the male reproductive system. It is believed that some of the effects of endocrine disruptors are mediated by the non-classical estrogen G protein-coupled receptor - GPER1 (GPR30). In view of the worldwide problems regarding to degradation of plastics and their dispersion in the environment, and earlier evidences showed that phthalates have effects on the development and maturation of the prostate increasing the incidence of inflammatory and dysplastic lesions in rodents, this study aimed to evaluate the effect of MBP on androgen dependent prostate cancer cells (LNCaP) by modulating the activity of GPER1 (through its antagonist, G15). The LNCaP cells, maintained in RPMI culture, were expanded and treated in an incubator with 5% CO2 humid atmosphere at 37 ° C. The MBP dose to be used was 10 uM, selected from the following MTT cytotoxicity test (3- [4.5-dimethylthiazol-2yl] -2,5-diphenyl tetrazolina bromide). Thus were established the following treatment protocols: control: RPMI + 0.03% DMSO; MBP: 10 uM of MBP diluted in DMSO (0.03%) + RPMI; G15: 8 uM of G15 diluted in DMSO (0.03%) + RPMI; M+G... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: O mono-n-butil-ftalato (MBP), metabólito ativo do di-n-butil-ftalato (DBP), plastificante usualmente utilizado em produtos industrializados, incluindo dispositivos médicos, plásticos flexíveis e cosméticos, tem sido descrito como um desregulador endócrino com função estrogênica e anti-androgênica dependendo da dose e do período de exposição, interferindo principalmente com o desenvolvimento do sistema genital masculino. Acredita-se que os efeitos de alguns desreguladores endócrinos sejam mediados pelo receptor estrogênico não clássico acoplado à proteína G - GPER1 (GPR30). Tendo em vista a problemática mundial com relação à degradação dos materiais plásticos e sua dispersão no meio ambiente e diante de evidências que mostraram que os ftalatos exercem efeitos sobre o desenvolvimento e maturação da próstata aumentando a incidência de lesões inflamatórias e displásicas em roedores, este estudo teve por objetivo avaliar a ação do MBP sobre células cancerígenas prostáticas dependentes de andrógeno (LNCaP), modulando a atividade do GPER1 (através de seu antagonista, G15). As células da linhagem LNCaP, mantidas em meio de cultura RPMI, foram expandidas e tratadas em estufa com 5% de CO2 e atmosfera úmida a 37ºC. A dose de MBP a ser utilizada foi de 10 µM, selecionada após o teste de citotoxicidade do MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2yl]-2,5-difenil brometo de tetrazolina). Dessa forma foram constituídos os seguintes protocolos de tratamento: Controle: RPMI + DMSO 0,03%; MBP: 10 µM de M... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre