O presente estudo teve como objetivo avaliar a atividade antioxidante e antimicrobiana de extratos de própolis verde por meio de analises físico-químicas, químicas e sensoriais, visando seu uso em alimentos. Foi avaliada a influência da sazonalidade sobre os compostos antioxidantes presentes em amostras de própolis verde. Amostras foram coletadas ao longo de um ano e, com o auxílio da Metodologia de Superfície de Resposta, foram produzidos extratos hidroalcoólicos sob condições otimizadas. As variáveis testadas na otimização foram o grau de hidratação do solvente, temperatura e tempo de extração. As respostas foram o teor de Fenólicos Totais e a atividade antioxidante in vitro pelos métodos ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity), ABTS (2,2\'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid), DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) e FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power). A identificação e quantificação dos compostos fenólicos presentes nas amostras foi realizada por meio de técnicas de cromatografia liquida e gasosa (UPLCDAD e GC-MS), com padrões antioxidantes. Os ensaios de otimização permitiram a produção de extratos de própolis verde com alta atividade antioxidante, confirmada pela presença de compostos antioxidantes, com uso de etanol 70% (etanol: agua, v/v), a 45°C por 20 minutos. Os teores de ácido clorogênico, ácido cafeico, ácido p-cumárico, kaempferide, pinostrobina e artepelin C foram identificados nas amostras coletadas ao longo do ano, apresentando maior concentração na amostra coletada do inverno. Ensaios para avaliação da influência da moagem da amostra bruta sobre teor de fenólicos e atividades antioxidante e antifúngica dos extratos, assim como a determinação da atividade antibacteriana dos mesmos foram desenvolvidos. As bactérias testadas foram Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes e Escherichia coli e os fungos foram Botrytis cinerea e o Rhyzopus stolonifer. Os resultados evidenciaram o efeito inibitório sobre as bactérias e fungos testados. Na avaliação em sistema modelo para determinação da atividade antioxidante, foram utilizadas como matéria-prima oxidável emulsões preparadas com óleo de linhaça e água, adicionadas de diferentes doses de extrato de própolis (50, 100, 150 e 200 mg/kg) e submetidas a teste de oxidação acelerada. Para fins de comparação, os antioxidantes sintéticos permitidos pela legislação brasileira (TBHQ, BHA e BHT) também tiveram sua atividade testada. O teor de hidroperóxidos e absorbância específica no UV foram monitorados durante 120 horas. A concentração que apresentou a maior proteção antioxidante foi avaliada sensorialmente. Os resultados da análise sensorial demonstraram que 100 mg/kg do extrato de própolis foi efetiva, retardando a oxidação lipídica nas emulsões. A análise sensorial indicou que o aroma do extrato de própolis mascarou o odor de ranço, sendo o mais preferido dentre as amostras testadas. Produtos a base de própolis verde apresentaram-se como promissores, dada a presença de compostos bioativos com benefícios reais para aplicação como aditivo em alimentos. / The present study aimed to evaluate antioxidant and biological activities of Brazilian green propolis in order to elucidate its potential use as a food additive. The influence of seasonality over antioxidants compounds in green propolis was evaluated. Samples were collected during a year and, trough Response Surface Methodology (RSM), hydroalcoholic extracts were produced under optimize conditions. The variables evaluated on RSM were: degree of solvent hydration, temperature and extraction time. The responses observed were Total Phenolic Content and antioxidant activity determined by in vitro tests such as ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity), ABTS (2,2\'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid), DPPH (2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl) and FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power). The phenolic compounds identification and quantification were performed by chromatography techniques (UPLC-DAD e GC-MS), with antioxidants standards. The optimized essays made possible the production of green propolis extracts with higher antioxidant activities when prepared with 70% of solvent (ethanol: water, v/v), at 45oC for 20 minutes. Chlorogenic acid, caffeic acid, p-coumaric acid, kaempferide, pinostrobin and artepillin C were identified in all samples, the greater amount was observed in winters \'sample. The influence of grinding over antioxidant and antifungal activities well as the antibacterial power were evaluated. Doses of green propolis extract were tested over Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Botrytis cinerea and Rhyzopus stolonifer. The results showed the inhibitory effect of green propolis extract on microorganisms tested. On model system evaluation in order to determine the antioxidant activity were used as raw material, emulsions prepared with flaxseed oil and water, added with different doses of green propolis extract (50, 100, 150 and 200 mg/kg) and submitted to accelerated oxidation test. To compare the results, synthetic antioxidants allowed by Brazilian legislation were also tested (TBHQ, BHA e BHT). The amount of hydroperoxides and specific absorbance on UV were monitored for 120 hours. The dose which presented higher protective effect was sensorially tested. The results of sensory analysis demonstrate that 100 mg/kg of extract was effective to retard the emulsions oxidation. According to sensory analysis\'s results, the green propolis aroma masked the rancid odor. Due to the presence of bioactive compounds, the use of green propolis based products as food additive is promising.

O Artepelin C (ART C) é um produto natural presente na própolis verde brasileira que apresenta diversas atividades biológicas. Dentre essas, destacam-se as atividades anticancerígenas, o que o torna um promissor candidato à fármaco para o tratamento de diversos tipos de câncer (pulmão, rins, cólon, testículos, próstata e leucemia). A determinação do metabolismo de um candidato a fármaco é uma das etapas primordiais no desenvolvimento do mesmo. Atualmente, modelos in vitro para a determinação do metabolismo do candidato frente às enzimas da citocromo P450 (CYP450) vem sendo largamente utilizados. Esses modelos apresentam como principais vantagens a simplicidade, o baixo custo e a ausência ou uso reduzido de animais. No presente trabalho, avaliou-se o metabolismo in vitro do ART C empregando microssomas hepáticos de ratos e de humanos, com o objetivo de caracterizar os parâmetros cinéticos enzimáticos e identificar os possíveis metabólitos formados durante o metabolismo. Para tanto, foi desenvolvido e validado um método analítico para análise do ART C em meio microssomal. A análise do ART C foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência, empregando coluna C18 e fase móvel composta por metanol : solução aquosa de ácido fórmico 0,1% (70:30, v/v). A vazão utilizada foi de 1,2 mL min-1 e a detecção foi realizada em 315 nm. A metodologia analítica foi validada de acordo com o guia para validação de métodos bioanalíticos da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, avaliando-se os parâmetros seletividade, linearidade, efeito residual, limite inferior de quantificação, precisão, exatidão e estabilidade, sendo que os resultados obtidos corroboraram com as exigências do guia. A seguir, foram determinadas as condições de velocidade inicial da reação enzimática (V0), necessárias para a determinação dos parâmetros cinéticos enzimáticos do metabolismo do ART C em microssomas hepáticos de ratos e humanos. As condições de V0 determinadas foram tempo de incubação de 30 minutos e concentração proteica microssomal de 0,5 mg mL-1 para os microssomas de ratos e tempo de incubação de 40 minutos e concentração proteica microssomal de 0,5 mg mL-1 para os microssomas de humanos. O modelo microssomal de rato demonstrou um possível perfil cinético sigmoidal, adequando-se ao modelo cinético de Hill. Os parâmetros cinéticos determinados foram: Vmáx = 0,7567 ± 0,0212 µmol mg-1 min-1, coeficiente de Hill = 10,90 ± 2,80 e S50 = 33,35 ± 0,55 µM. A partir desses parâmetros obteve-se o clearance intrínseco para o ART C de 16,63 ± 1,52 µL min-1 mg-1. Para o modelo microssomal de humanos, os resultados do metabolismo do ART C não se adequaram a nenhum dos modelos cinéticos enzimáticos já descritos. Em ambos os modelos microssomais, foi possível a identificação de dois metabólitos do ART C. Para tanto, foi empregado a cromatografia liquida acoplada a espectrometria de massa de alta resolução ou acoplada a espectrometria de massa de múltiplos estágios. Os resultados revelaram que ambos os metabólitos formados são produtos de hidroxilação do ART C. / Artepillin C (ART C) is a natural product present in Brazilian green propolis, which has several biological properties. Among these ones, the anticancer properties have been highlighted, making ART C a promising drug candidate for treatment of several types of cancer (lungs, kidneys, colon, testicles, prostate and leukemia). The knowledge of a drug metabolism is one of the key stages in early drug development. Nowadays, in vitro models have been used to determine the metabolic route by the cytochrome P450 (CYP450) enzymes for a drug candidate. The main advantages of using these models are the simplicity, the relative low cost and the absence or reduced use of animals. In this project, we determined the in vitro metabolism of ART C by employing rat and human liver microsomes, in order to characterize the enzymatic kinetics parameters and to identify possible produced metabolites during the metabolism. To accomplish that, an analytical method was developed and validated for ART C analysis in microsomal medium. The ART C analysis was carried out by high performance liquid chromatography, using a C18 column and methanol : formic acid aqueous solution 0.1% (70:30, v/v) as mobile phase. The flow rate used was 1.0 mL min-1 and detection was set at 315 nm. The analytical methodology was validated according to ANVISA guideline for bioanalytical method validation. The following parameters were evaluated: selectivity, linearity, carryover, lower limit of quantification, precision, accuracy and stability, wherein the obtained results corroborate to the guides requirement. Hereafter, the initial velocity conditions for the enzymatic reaction (V0) of ART C metabolism in rat and human liver microsomes was determined. The V0 conditions were incubation time 30 minutes and microsomal protein concentration 0.5 mg mL-1 for rat microsomes and incubation time 40 minutes and microsomal protein concentration 0.5 mg mL-1 for human microsomes. The metabolism by rat liver microsomes suggested a sigmoidal profile, adapting to the Hills kinetics model. The enzymatic kinetics parameters determined were: Vmax = 0.7567 ± 0.0212 µmol mg-1 min-1, Hill coefficient = 10.90 ± 2.80 and S50 = 33.35 ± 0.55 µM. Based on these parameters, the calculated intrinsic clearance for ART C was 16.63 ± 1.52 µL min-1 mg-1. The in vitro metabolism assay employing human microsomes did not fit any enzymatic kinetics models. In both microsomal models, two ART C metabolites were determined. The identification of the metabolites was performed by liquid chromatography coupled to a high resolution mass spectrometry or coupled to a multiple-stage mass spectrometry. The results revealed that both ART C metabolites were produced after a hydroxylation reaction.

O Artepelin C (ART C) é um produto natural presente na própolis verde brasileira que apresenta diversas atividades biológicas. Dentre essas, destacam-se as atividades anticancerígenas, o que o torna um promissor candidato à fármaco para o tratamento de diversos tipos de câncer (pulmão, rins, cólon, testículos, próstata e leucemia). A determinação do metabolismo de um candidato a fármaco é uma das etapas primordiais no desenvolvimento do mesmo. Atualmente, modelos in vitro para a determinação do metabolismo do candidato frente às enzimas da citocromo P450 (CYP450) vem sendo largamente utilizados. Esses modelos apresentam como principais vantagens a simplicidade, o baixo custo e a ausência ou uso reduzido de animais. No presente trabalho, avaliou-se o metabolismo in vitro do ART C empregando microssomas hepáticos de ratos e de humanos, com o objetivo de caracterizar os parâmetros cinéticos enzimáticos e identificar os possíveis metabólitos formados durante o metabolismo. Para tanto, foi desenvolvido e validado um método analítico para análise do ART C em meio microssomal. A análise do ART C foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência, empregando coluna C18 e fase móvel composta por metanol : solução aquosa de ácido fórmico 0,1% (70:30, v/v). A vazão utilizada foi de 1,2 mL min-1 e a detecção foi realizada em 315 nm. A metodologia analítica foi validada de acordo com o guia para validação de métodos bioanalíticos da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, avaliando-se os parâmetros seletividade, linearidade, efeito residual, limite inferior de quantificação, precisão, exatidão e estabilidade, sendo que os resultados obtidos corroboraram com as exigências do guia. A seguir, foram determinadas as condições de velocidade inicial da reação enzimática (V0), necessárias para a determinação dos parâmetros cinéticos enzimáticos do metabolismo do ART C em microssomas hepáticos de ratos e humanos. As condições de V0 determinadas foram tempo de incubação de 30 minutos e concentração proteica microssomal de 0,5 mg mL-1 para os microssomas de ratos e tempo de incubação de 40 minutos e concentração proteica microssomal de 0,5 mg mL-1 para os microssomas de humanos. O modelo microssomal de rato demonstrou um possível perfil cinético sigmoidal, adequando-se ao modelo cinético de Hill. Os parâmetros cinéticos determinados foram: Vmáx = 0,7567 ± 0,0212 µmol mg-1 min-1, coeficiente de Hill = 10,90 ± 2,80 e S50 = 33,35 ± 0,55 µM. A partir desses parâmetros obteve-se o clearance intrínseco para o ART C de 16,63 ± 1,52 µL min-1 mg-1. Para o modelo microssomal de humanos, os resultados do metabolismo do ART C não se adequaram a nenhum dos modelos cinéticos enzimáticos já descritos. Em ambos os modelos microssomais, foi possível a identificação de dois metabólitos do ART C. Para tanto, foi empregado a cromatografia liquida acoplada a espectrometria de massa de alta resolução ou acoplada a espectrometria de massa de múltiplos estágios. Os resultados revelaram que ambos os metabólitos formados são produtos de hidroxilação do ART C. / Artepillin C (ART C) is a natural product present in Brazilian green propolis, which has several biological properties. Among these ones, the anticancer properties have been highlighted, making ART C a promising drug candidate for treatment of several types of cancer (lungs, kidneys, colon, testicles, prostate and leukemia). The knowledge of a drug metabolism is one of the key stages in early drug development. Nowadays, in vitro models have been used to determine the metabolic route by the cytochrome P450 (CYP450) enzymes for a drug candidate. The main advantages of using these models are the simplicity, the relative low cost and the absence or reduced use of animals. In this project, we determined the in vitro metabolism of ART C by employing rat and human liver microsomes, in order to characterize the enzymatic kinetics parameters and to identify possible produced metabolites during the metabolism. To accomplish that, an analytical method was developed and validated for ART C analysis in microsomal medium. The ART C analysis was carried out by high performance liquid chromatography, using a C18 column and methanol : formic acid aqueous solution 0.1% (70:30, v/v) as mobile phase. The flow rate used was 1.0 mL min-1 and detection was set at 315 nm. The analytical methodology was validated according to ANVISA guideline for bioanalytical method validation. The following parameters were evaluated: selectivity, linearity, carryover, lower limit of quantification, precision, accuracy and stability, wherein the obtained results corroborate to the guides requirement. Hereafter, the initial velocity conditions for the enzymatic reaction (V0) of ART C metabolism in rat and human liver microsomes was determined. The V0 conditions were incubation time 30 minutes and microsomal protein concentration 0.5 mg mL-1 for rat microsomes and incubation time 40 minutes and microsomal protein concentration 0.5 mg mL-1 for human microsomes. The metabolism by rat liver microsomes suggested a sigmoidal profile, adapting to the Hills kinetics model. The enzymatic kinetics parameters determined were: Vmax = 0.7567 ± 0.0212 µmol mg-1 min-1, Hill coefficient = 10.90 ± 2.80 and S50 = 33.35 ± 0.55 µM. Based on these parameters, the calculated intrinsic clearance for ART C was 16.63 ± 1.52 µL min-1 mg-1. The in vitro metabolism assay employing human microsomes did not fit any enzymatic kinetics models. In both microsomal models, two ART C metabolites were determined. The identification of the metabolites was performed by liquid chromatography coupled to a high resolution mass spectrometry or coupled to a multiple-stage mass spectrometry. The results revealed that both ART C metabolites were produced after a hydroxylation reaction.