Atherosclerosis is accepted to be a chronic inflammatory disease of the arterial vessel wall. Several cellular subsets of the immune system are involved in its initiation and progression, such as monocytes, macrophages, T and B cells. Recent research has demonstrated that dendritic cells (DCs) contribute to atherosclerosis, too. DCs are defined by their ability to sense and phagocyte antigens, to migrate and to prime other immune cells, such as T cells. Although all DCs share these functional characteristics, they are heterogeneous with respect to phenotype and origin. Several markers have been used to describe DCs in different lymphoid and non-lymphoid organs; however, none of them has proven to be unambiguous. The expression of surface molecules is highly variable depending on the state of activation and the surrounding tissue. Furthermore, DCs in the aorta or the atherosclerotic plaque can be derived from designated precursor cells or from monocytes. In addition, DCs share both their marker expression and their functional characteristics with other myeloid cells like monocytes and macrophages. The repertoire of aortic DCs in healthy and atherosclerotic mice has just recently started to be explored, but yet there is no systemic study available, which describes the aortic DC compartment. Because it is conceivable that distinct aortic DC subsets exert dedicated functions, a detailed description of vascular DCs is required. The first part of this thesis characterizes DC subsets in healthy and atherosclerotic mice. It describes a previously unrecognized DC subset and also sheds light on the origin of vascular DCs. In recent years, microRNAs (miRNAs) have been demonstrated to regulate several cellular functions, such as apoptosis, differentiation, development or proliferation. Although several cell types have been characterized extensively with regard to the miRNAs involved in their regulation, only few studies are available that focus on the role of miRNAs in DCs. Because an improved understanding of the regulation of DC functions would allow for new therapeutic options, research on miRNAs in DCs is required. The second part of this thesis focuses on the role of the miRNA cluster miR- 17~92 in DCs by exploring its functions in healthy and atherosclerotic mice. This thesis clearly demonstrates for the first time an anti-inflammatory and atheroprotective role for the miR17-92 cluster. A model for its mechanism is suggested. / Atherosklerose ist eine chronisch-entzündliche Erkrankung der arteriellen Gefäßwand und zahlreiche Zellen des Immunsystems, wie zum Beispiel Monozyten, Makrophagen, T und B Zellen sind an der Entstehung und Entwicklung beteiligt. Aktuelle Forschungsergebnisse haben gezeigt, dass auch dendritische Zellen (DCs) zur Atherosklerose beitragen. DCs sind durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet, Antigene zu erkennen, aufzunehmen, zu migrieren und andere Immunzellen, wie zum Beispiel T Zellen, zu aktivieren. Auch wenn alle DCs diese funktionellen Merkmale teilen, so sind sie in Bezug auf ihren Phänotyp oder Ursprung eine eher heterogene Gruppe. Zahlreiche Oberflächenmoleküle wurden in der Vergangenheit genutzt, um DCs in lymphatischen und nicht-lymphatischen Geweben zu beschreiben. Allerdings hat sich keines dieser Moleküle als spezifisch und unverwechselbar erwiesen. Die Expression von Oberflächenmolekülen ist sehr variabel und hängt nicht nur vom Aktivierungszustand der DCs, sondern auch vom umliegenden Gewebe ab. Dazu kommt, dass DCs in der Aorta, beziehungsweise im atherosklerotischen Plaque, von designierten Vorläuferzellen, aber auch von Monozyten abstammen können und DCs das Profil ihrer Oberflächenmoleküle, sowie ihre funktionellen Eigenschaften, mit anderen myeloiden Zellen wie Monozyten und Makrophagen teilen. Neuere Arbeiten haben damit begonnen das Repertoire an DCs in der Aorta von gesunden und atherosklerotischen Mäusen zu untersuchen. Da es naheliegt, dass verschiedene DC Untergruppen ganz bestimmte Funktionen ausüben, wird eine detaillierte Beschreibung vaskulärer DCs in der Forschung benötigt. Weil es hierzu allerdings bislang kaum Studien gibt, untersucht der erste Teil dieser Arbeit zum ersten Mal systematisch die in gesunden und atherosklerotischen Mäusen vorkommenden Gruppen an DCs. Sie beschreibt außerdem eine zuvor nicht beachtete DC-Untergruppe und gibt Aufschluss über den Ursprung vaskulärer DCs. In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass microRNAs (mirRNAs) zahlreiche zelluläre Vorgänge wie Apoptose, Differenzierung, Entwicklung und Proliferation regulieren. Obwohl viele Zelltypen in Bezug auf die in ihrer Regulation eingebundenen mirRNAs charakterisiert wurden, gibt es nur wenige Studien, die sich mit der Rolle von mirRNAs in DCs beschäftigen. Der zweite Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf die Rolle der miRNA Gruppe miR-17~92 in DCs und untersucht deren Rolle in gesunden und atherosklerotischen Mäusen. Diese Arbeit zeigt erstmals eine deutliche anti-inflammatorische und protektive Rolle dieser miRNA und schlägt ein Modell für die entdeckten Mechanismen vor.

Atherosklerose ist eine aktive und progressive Erkrankung, bei der vaskuläre Adhäsionsmoleküle wie VCAM-1 eine entscheidende Rolle durch Steuerung der Rekrutierung von Immunzellen in den frühen und fortgeschrittenen Plaques spielen. Ein zielgerichteter Einsatz von VCAM-1-Molekülen mit spezifischen Kontrastmitteln ist daher eine Möglichkeit, die VCAM-1-Expression zu kontrollieren, Plaquewachstum ab einem frühen Zeitpunkt zu visualisieren und eine frühe Prävention von Atherosklerose vor Beginn der Thrombusbildung zu etablieren. Des Weiteren bietet die nichtinvasive Magnetresonanz (MR)-Bildgebung den Vorteil der Kombination molekularer und morphologischer Daten. Sie ermöglicht, mithilfe von entwickelten VCAM-1-markierten Eisenoxidpartikeln, den spezifischen Nachweis entzündlicher Prozesse während der Atherosklerose. Diese Arbeit belegt, dass mit dem VCAM-1-Konzept eine vielversprechende Herangehensweise gefunden wurde und dass das, mit spezifischen superparamagnetischen Eisenoxid (USPIO) konjugierte VCAM-1-Peptid, gegenüber unspezifischer USPIOs ein erhöhtes Potenzial bei der Untersuchung der Atherosklerose in sich trägt. Im ersten Teil der Arbeit konnte im Mausmodell gezeigt werden, dass gerade das VCAM-1-Molekül ein sinnvoller Ansatzpunkt zur Darstellung und Bildgebung von Atherosklerose ist, da in der frühen Phase der Entzündung die vaskulären Zelladhäsionsmoleküle überexprimiert und auch kontinuierlich, während der fortschreitenden Plaquebildung, hochreguliert werden. Weiterhin beschreibt diese Arbeit die Funktionstüchtigkeit und das Vermögen des neu gestalteten USPIO Kontrastmittels mit dem zyklischen Peptid, in seiner Spezialisierung auf die VCAM-1 Erkennung. Experimentelle Studien mit ultra-Hochfeld-MRT ermöglichten weitere ex vivo und in vivo Nachweise der eingesetzten USPIO-VCAM-1-Partikel innerhalb der Region um die Aortenwurzel in frühen und fortgeschrittenen atherosklerotischen Plaques von 12 und 30 Wochen alten Apolipoprotein E-defizienten (ApoE-/-) Mäusen. Mit ihrer Kombination aus Histologie und Elektronenmikroskopie zeigt diese Studie zum ersten Mal die Verteilung von VCAM-1-markierten USPIO Partikeln nicht nur in luminalem Bereich der Plaques, sondern auch in tieferen Bereichen der medialen Muskelzellen. Dieser spezifische und sensitive Nachweis der frühen und fortgeschrittenen Stadien der Plaquebildung bringt auf molekularer Ebene neue Möglichkeiten zur Früherkennung von atherosklerotischen Plaques vor dem Entstehen von 8 Rupturen. Im Gegensatz zum USPIO-VCAM-1-Kontrastmittel scheiterten unspezifische USPIO Partikel an der Identifikation früher Plaqueformen und begrenzten die Visualisierung von Atherosklerose auf fortgeschrittene Stadien in ApoE-/- Mäusen. / Atherosclerosis is an active and progressive condition where the vascular cell adhesion molecules as VCAM-1 play a vital role controlling the recruitment of immune cells within the early and advanced plaques. Therefore targeting of VCAM-1 molecules with specific contrast agent bears the possibility to monitor the VCAM-1 expression, visualize the plaque progression starting at the early alterations, and help to establish early prevention of atherosclerosis before the origin of the thrombus formation, of which late recognition leads to myocardial infarction. Furthermore noninvasive magnetic resonance imaging (MRI) offers the benefit of combining the molecular and anatomic data and would thus enable specific detection of VCAM-1 targeted iron oxide contrast agent within inflammatory process of atherosclerosis. This thesis exactly presents the VCAM-1 concept as a suitable molecular approach and the potential of specific ultrasmall superparamagnetic iron oxide (USPIO) conjugated to the VCAM-1 binding peptide over unspecific non-targeted USPIO particles for evaluation of atherosclerosis. This work firstly demonstrated that selection of VCAM-1 molecules offers a good and potential strategy for imaging of atherosclerosis, as these vascular cell adhesion molecules are highly expressed in the early phase of inflammation and also continuously up-regulated within the advanced plaques. Secondly, this thesis showed the proof of principle and capability of the newly designed USPIO contrast agent conjugated to the specific cyclic peptide for VCAM-1 recognition. The experimental studies including ultra-high field MRI enabled further ex vivo and in vivo detection of applied USPIO-VCAM-1 particles within the aortic root region of early and advanced atherosclerotic plaques of 12 and 30 week old apolipoprotein E deficient (ApoE-/-) mice. Using a combination of histology and electron microscopy, this study for the first time pointed to distribution of targeted USPIO-VCAM-1 particles within plaque cells expressing VCAM-1 not only in luminal regions but also in deeper medial smooth muscle cell areas. Hence functionalized USPIO particles targeting VCAM-1 molecules allow specific and sensitive detection of early and advanced plaques at the molecular level, giving the new possibilities for early recognition of atherosclerotic plaques before the appearance of advanced and prone to rupture lesions. In contrast to the functionalized USPIO-VCAM-1, utilized non-targeted USPIO particles did not succeed in early plaque 6 identification limiting visualization of atherosclerosis to advanced forms in atherosclerotic ApoE-/- mice.

Motivation and Aim: Cardiovascular disease has been the leading cause of mortality and morbidity throughout the world. In developed countries, cardiovascular diseases are already responsible for a majority of deaths and will become the pre-eminent health problem worldwide (1,2). Rupture of atherosclerotic plaque accounts for approximately 70% of fatal acute myocardial infarction and sudden heart deaths. Conventional criterias for the diagnosis of “vulnerable plaques” are calcified nodules, yellow appearance of plaque, a thin cap, a large lipid core, severe luminal stenosis, intraplaque hemorrhage, inflammation, thrombogenicity, and plaque injury (3-5). Noninvasive diagnosis of vulnerable plaque still remains a great challenge and a huge research prospect, which triggered us to investigate the feasibility of PET imaging on the evaluation of atherosclerosis. Nuclear imaging of atherosclerosis， especially co-registered imaging modalities, could provide a promising diagnostic tool including both anatomy and activities to identify vulnerable atherosclerotic plaque or early detection of inflammatory endothelium at risk. Furthermore, the development of specific imaging tracers for clinical applications is also a challenging task. The aim of this work was to assess the potential of novel PET imaging probes associated with intra-plaque inflammation on animal models and in human respectively. Methods In this work, several molecular imaging modalities were employed for evaluation of atherosclerosis. They included Positron emission tomography / Computed tomography (PET/CT) for human studies, and micro-PET, autoradiography and high-resolution magnetic resonance imaging (MRI) for animal studies. Radiotracers for PET imaging included the glucose analogue 18F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG), the somatostatin receptor avide tracer 68Ga-DOTATATE, and the Gallium-68 labeled fucoidan (68Ga-Fucoidan), which was developed as a PET tracer to detect endothelial P-selectin, which overexpressed at early stage of atherosclerosis and endothelial overlying activated plaque. Tracer’s capabilities were firstly assessed on cellular level in vitro. Subsequently, Animal studies were conducted in two animal models: 1, Apolipoprotein E (ApoE-/-) mice having severe atherosclerotic plaque; 2, Lipopolysaccharide (LPS) -induced mice for receiving acute vascular inflammation. Corresponding analyses on protein and histological level were conducted as well to confirm our results. In human study, 16 patients with neuroendocrine tumors (NETs) were investigated on imaging vascular inflammation. These patients had undergone both 68Ga-DOTATATE PET/CT and 18F-FDG PET/CT for staging or restaging within 6 weeks. 16 patients were randomized into two groups: high-risk group and low-risk group. Uptake ratio of both tracers from two groups were compared and correlated with common cardiovascular risk factors. Results and Conclusion In murine study, the expression of somatostatin receptor 2, which is the main bio-target of 68Ga-DOTATATE on macrophage/monocyte was confirmed by flow cytometry and immunohistochemistry. Prospectively, high specific accumulation of 68Ga-DOTATATE to the macrophage within the plaques was observed in aorta lesions by autoradiography and by micro-PET. In study with 68Ga-fucoidan, a strong expression of P-selectin on active endothelium overlying on inflamed plaque but weaker on inactive plaques was confirmed. Specific focal uptake of 68Ga-fucoidan were detected at aorta segments by micro-PET, and correlated with high-resolution magnetic resonance imaging (MRI), which was used to characterize the morphology of plaques. 68Ga-fucoidan also showed a greater affinity to active inflamed plaque in comparison of inactive fibrous plaque, which was assessed by autoradiography. Specificity of 68Ga-DOTATATE and 68Ga-fucoidan were confirmed by ex-vivo blocking autoradiography and in vivo blocking PET imaging respectively. In human study, focal uptake of both 18F-FDG and 68Ga-DOTATATE was detected. Analyzing concordance of two tracers’ uptake ratio, Out of the 37 sites with highest focal 68Ga-DOTATATE uptake, 16 (43.2%) also had focal 18F-FDG uptake. Of 39 sites with highest 18F-FDG uptake, only 11 (28.2%) had a colocalized 68Ga-DOTATATE accumulation. Correlated tracers’ uptake and calcium burden and risk factors, Mean target-to-background ratio (TBR) of 68Ga-DOTATATE correlated significantly with the presence of calcified plaques (r=0.52), hypertension (r=0.60), age (r=0.56) and uptake of 18F-FDG (r=0.64). TBRmean of 18F-FDG correlated significantly only with hypertension (r=0.58; p<0.05). Additionally, TBRmean of 68Ga-DOTATATE is significant higher in the high risk group while TBRmean of 18F-FDG is not. In conclusion, we evaluated vascular inflammation of atherosclerosis non-invasively using the two PET tracers: 68Ga-DOTATATE and 68Ga-Fucoidan. 68Ga-DOTATATE show specific affinity to infiltrated macrophage within the plaques. 68Ga-Fucoidan may hold the potential to discriminate between active and inactive atherosclerotic plaques in terms of variant accumulation on different-types of plaques. PET as leading molecular imaging technique provides superiority in assessing cellular activity, which is pivotal for understanding internal activity of atherosclerotic plaques. Since diagnosis of atherosclerosis is a complex and multi-dimensional task. More integrated imaging technology such as PET/MRI, faster imaging algorithm, more efficient radiotracer are required for further development of atherosclerosis imaging, / Ziel: Kardiovaskuläre Erkrankungen stellen die häufigste Todesursache der westlichen Industrieländer dar und führen zu einem zunehmenden Gesundheitsproblem weltweit. (1,2). Ca. 70 % aller akuten Myocardinfarkte sind auf die Ruptur atherosklerotischer Plaques zurück zuführen, deren typische Charakteristika ein kalzifizierter, lipidhaltiger Kern, überzogen von einer dünnen fibrösen Kappe, darstellt. Innerhalb der atherosklerotischer Plaques kommt es zu Makrophageneinlagerung und im weiteren Verlauf zu entzündlichen und angiogentischen Prozesse, die zu Einblutungen führen und die Instabilität der Plaques zur Folge hat (3-5). Die nichtinvasive Diagnostik rupturgefährdeter Plaques stellt immer noch eine große medizinische Herausforderung dar. Die nuklearmedizinische Bildgebung, kombiniert mit MRT/CT zur anatomischen Co-Registrierung, könnte eine verbesserte diagnostische Methode zur Darstellung rupturgefährdeter atherosklerotischen Plaques und frühzeitiger entzündlicher Prozesse darstellen. Ziel dieser Arbeit war es daher, atherosklerosische Plaques mittels Positronen¬emissions¬tomografie (PET) unter Verwendung neuer PET Tracer für die Darstellung von Entzündungs¬prozesse im Tiermodell und der humanen Anwendung zu untersuchen. Material und Methoden: Im Rahmen dieser Arbeit kamen verschiedene bildgebende Verfahren zur Anwendung. Im Einzelnen waren dies PET/CT bei humanen Studien sowie micro-PET, Autoradiografie und hochauflösende Magnetresonanztomografie (MRT) bei Untersuchungen im Tiermodell. Als PET-Tracer wurden das Glukosederivat 18F-Flurodesoxyglukose (18F-FDG), 68Ga-DOTATATE, das an Somatostatin-Rezeptoren bindet sowie Gallium-68 markiertes Fucoidan (68Ga-Fucoidan) verwendet. Bei 68Ga-Fucoidan handelt es sich um einen neu entwickelten PET-Tracer zur Darstellung von P-Selectin, welches an aktivieren Plaques im frühen Stadium der Atherosklerose überexprimiert wird. Die Untersuchungen im Tiermodell fanden sowohl an Apolipoprotein E Knockout-Mäusen (ApoE-/-) als auch an Lipopolysaccharid- (LPS) induzierten Mäusen statt. Des Weiteren wurden uptake-Untersuchungen auf in Zellkulturexperimenten durchgeführt. Zur Bestätigung der der Untersuchungsergebnisse wurden zusätzlich histochemische Untersuchungen durchgeführt. Im Rahmen der humanen Studien wurden 16 Patienten mit neuroendokrinenen Tumoren (NET) hinsichtlich vaskulärer Entzündungsprozesse untersucht. Alle Patienten erhielten ein 68Ga-DOTATATE PET/CT und 18F-FDG PET/CT zum Staging bzw. Restaging innerhalb von 6 Wochen. Die Einteilung der Patienten erfolgte in zwei Gruppen: hohes Risiko und geringes Risiko. Die uptake-Verhältnisse beider Tracer in beiden Gruppen wurden mit einander verglichen und hinsichtlich bekannter cardiocaskulärer Risikofaktoren in Beziehung gesetzt. Ergebnisse und Zusammenfassung: Die Expression der Somatostatin-Rezeptor Subtyps 2, an den 68Ga-DOTATATE an Makrophagen/Monocyten bindet, konnte mittels flow cytometrischer und immunhistochemischer Experimente im Mausmodell bestätigt werden. Mit Hilfe von micro-PET Untersuchungen und Autoradiografie wurde eine hohe spezifische Anreicherung von 68Ga-DOTATATE an Makrophagen innerhalb der Plaques beobachtet.Im Rahmen der Untersuchungen mit 68Ga-Fucoidan konnte eine hohe P-Selectin-Expression an aktiviertem Endothelium, welches die entzündlichen Plaques überlagert festgestellt werden. Bei inaktiven Plaques hingegen zeigte sich eine geringe P-Selectin-Expression. In micro-PET-Studien konnte ein spezifischer fokaler uptake von 68Ga-Fucoidan in der Aorta nachgewiesen werden. Dieser korrelierte mit den zusätzlich durchgeführten MRT-Unter¬suchungen zur Charakterisierung der Plaquemorphologie. Mittels Autoradiografie konnte nachgewiesen werden, dass 68Ga-Fucoidan eine höhere Affinität zu aktivierten entzündlichen Plaques im Vergleich zu inaktivieren fibrösen Plaques zeigt. Die spezifische Bindung von 68Ga-DOTATATE und 68Ga-Fucoidan wurde über Blockadeexperimente mittels Autoradiografie und PET bestätigt. In der humanen Anwendung wurde ein fokaler uptake von 18F-FDG und 68Ga-DOTATATE detektiert. Die Analyse der Übereinstimmung des uptakes beider Tracer ergab: Von 37 spots mit hohem 68Ga-DOTATATE-uptake zeigten 16 (43,2 %) ebenfalls einen fokalen 18F-FDG -uptake. Von 39 spots mit hohem 18F-FDG -uptake zeigten nur 11(28,2%) eine 68Ga-DOTATATE-Anreicherung. Betrachtet man den Tracer-uptake hinsichtlich des Calcium-burden und weiterer Risikofakoren, so ergeben sich folgende Korrelationskoeffizienten: TBRmean of 68Ga-DOTATATE korreliert signifikant mit der Anwesenheit von kalzifizierten Plaques (r=0,52), Blutdruck (r=0,60), Alter (r=0,56) und 18F-FDG uptake (r=0,64). Eine signifikante Korrelation von TBRmean 18F-FDG konnte lediglich beim Risikofaktor Blutdruck (r=0,58, p<0,05) festgestellt werden. Weiterhin zeigte sich, dass der TBRmean von Ga-DOTATATE in der Hoch-Risiko-Gruppe signifikant höher, dies gilt jedoch nicht für TBRmean 18F-FDG. Zusammenfassung: In dieser Arbeit wurden die vaskulären Entzündungsprozessen der Atherosklerose mittels der nichtinvasiven PET unter Verwendung von 68Ga-DOTATATE und 68Ga-Fucoidan untersucht und bewertet. 68Ga-DOTATATE zeigte eine spezifische Affinität zu Makrophagen innerhalb der atherosklerotischen Plaques. Mit 68Ga-Fucoidan konnt zwischen aktiven und inaktiven Plaques unterschieden werden. Die molekulare Bildgebung mittels PET eignet sich hervorragend zur Darstellung und Untersuchung molekularer Prozesse innerhalb atheroskerotischer Plaques. Dennoch sind weiterführende Technologien wie PET/MR, schnellere Algorithmen, hoch spezifische Radiotracer zur Weiterentwicklung der PET-Bildgebung atherosklerotischer Plaques notwendig.

Zugl.: Giessen, Universiẗat, Diss., 2007.

Ulm, Univ., Diss., 2008.

Freiburg i. Br., Univ., Diss., 2008.

Zugl.: Giessen, Univ., Diss., 2007

Tübingen, Univ., Diss., 2006.

Universiẗat, Diss., 1999--Frankfurt (Main).

Universiẗat, Diss., 2007--Giessen.