Die Atherosklerose ist als Ursache kardiovaskulärer Erkrankungen, welche die häufigste Todesursache weltweit darstellen, von großer klinischer und wissenschaftlicher Relevanz. Atherosklerose ist charakterisiert durch Einlagerungen von Lipiden in die Gefäßwand, welche zur Ausbildung von Plaques führen. Als Folge wird eine chronische Entzündungsreaktion eingeleitet, die durch spezifische Immunzellen, unter anderem T-Lymphozyten, und komplexe molekulare Prozesse aufrechterhalten wird. Durch eine verminderte Sauerstoffdiffusionskapazität und eine hohe Zelldichte ist das Milieu in den Plaques hypoxisch. Zur zellulären Anpassung an ein solches hypoxisches Milieu werden Hypoxie-induzierbare Faktoren (HIF) in den Immunzellen stabilisiert. Der Transkriptionsfaktor HIF-1 ist ein heterodimeres Protein, welches die Transkription bestimmter Zielgene initiiert, die den Zellen notwendige Adaptationen des Zellstoffwechsels an ein vermindertes Sauerstoffangebot ermöglichen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin zu untersuchen, inwiefern sich ein Ausschalten des Transkriptionsfaktor HIF-1α selektiv in T-Lymphozyten auf Atherosklerose und Myokardinfarkt auswirkt. Die funktionelle Bedeutung von HIF-1α in T-Zellen in der Pathogenese dieser Erkrankungen wurde an zwei Mausmodellen untersucht. Im Atherosklerose Modell wurde Biomaterial von LDLR-/- Mäusen mit T-Zell spezifischem Knockout von HIF-1α nach achtwöchiger fettreicher Western-Typ Diät untersucht. Histologisch zeigte sich eine vermehrte Plaqueausprägung und ein verminderter Makrophagenanteil in den Plaques. Durchflusszytometrisch und mittels qPCR konnten keine Unterschiede in der Lymphozytendifferenzierung in Milz und Lymphknoten dieser Mäuse nachgewiesen werden. Im Myokardinfarkt-Modell mit T-Zell spezifischem HIF-1α Knockout konnte in früheren Untersuchungen der Arbeitsgruppe eine vergrößerte Infarktzone mit eingeschränkter kardialer Funktion nachgewiesen werden. Histologisch konnte im Rahmen dieser Arbeit hierfür kein zellmorphologisches Korrelat in Kardiomyozytengröße oder der Vaskularisation des Myokards gefunden werden. In Zukunft könnte HIF-1α in T-Lymphozyten ein möglicher Angriffspunkt zur medikamentösen Prävention oder Therapie kardiovaskulärer Erkrankungen sein. / Atherosclerosis is of great clinical and scientific relevance as a cause of cardiovascular disease, which is the most common cause of death worldwide. Atherosclerosis is characterized by deposition of lipids in the vessel wall, which leads to the formation of plaques. As a consequence, a chronic inflammatory response is initiated, which is maintained by specific immune cells, including T lymphocytes, and complex molecular processes. Due to a reduced oxygen diffusion capacity and a high cell density, the environment in the plaques is hypoxic. For cellular adaptation to such a hypoxic milieu, hypoxia-inducible factors (HIF) are stabilized in immune cells. The transcription factor HIF-1 is a heterodimeric protein that initiates the transcription of specific target genes that enable cells to make necessary adaptations of cellular metabolism to a reduced oxygen supply. The aim of the present work was to investigate the extent to which silencing of the transcription factor HIF-1α selectively in T lymphocytes affects atherosclerosis and myocardial infarction. The functional significance of HIF-1α in T cells in the pathogenesis of these diseases was investigated in two mouse models. In the atherosclerosis model, biomaterial from LDLR-/- mice with T-cell specific knockout of HIF-1α was examined after an eight-week high-fat Western-type diet. Histologically, there was increased plaque expression and decreased macrophage content in plaques. Flow cytometry and qPCR did not detect differences in lymphocyte differentiation in the spleen and lymph nodes of these mice. In the myocardial infarction model with T-cell specific HIF-1α knockout, an enlarged infarct zone with impaired cardiac function could be detected in previous studies of the research group. Histologically, no cell morphological correlate for this in cardiomyocyte size or myocardial vascularization could be found in this work. In the future, HIF-1α in T lymphocytes could be a potential target for drug prevention or therapy of cardiovascular diseases.

Within this thesis, three main approaches for the assessment and investigation of altered hemodynamics like wall shear stress, oscillatory shear index and the arterial pulse wave velocity in atherosclerosis development and progression were conducted: 1. The establishment of a fast method for the simultaneous assessment of 3D WSS and PWV in the complete murine aortic arch via high-resolution 4D-flow MRI 2. The utilization of serial in vivo measurements in atherosclerotic mouse models using high-resolution 4D-flow MRI, which were divided into studies describing altered hemodynamics in late and early atherosclerosis 3. The development of tissue-engineered artery models for the controllable application and variation of hemodynamic and biologic parameters, divided in native artery models and biofabricated artery models, aiming for the investigation of the relationship between atherogenesis and hemodynamics Chapter 2 describes the establishment of a method for the simultaneous measurement of 3D WSS and PWV in the murine aortic arch at, using ultra high-field MRI at 17.6T [16], based on the previously published method for fast, self-navigated wall shear stress measurements in the murine aortic arch using radial 4D-phase contrast MRI at 17.6 T [4]. This work is based on the collective work of Dr. Patrick Winter, who developed the method and the author of this thesis, Kristina Andelovic, who performed the experiments and statistical analyses. As the method described in this chapter is basis for the following in vivo studies and undividable into the sub-parts of the contributors without losing important information, this chapter was not split into the single parts to provide fundamental information about the measurement and analysis methods and therefore better understandability for the following studies. The main challenge in this chapter was to overcome the issue of the need for a high spatial resolution to determine the velocity gradients at the vascular wall for the WSS quantification and a high temporal resolution for the assessment of the PWV without prolonging the acquisition time due to the need for two separate measurements. Moreover, for a full coverage of the hemodynamics in the murine aortic arch, a 3D measurement is needed, which was achieved by utilization of retrospective navigation and radial trajectories, enabling a highly flexible reconstruction framework to either reconstruct images at lower spatial resolution and higher frame rates for the acquisition of the PWV or higher spatial resolution and lower frame rates for the acquisition of the 3D WSS in a reasonable measurement time of only 35 minutes. This enabled the in vivo assessment of all relevant hemodynamic parameters related to atherosclerosis development and progression in one experimental session. This method was validated in healthy wild type and atherosclerotic Apoe-/- mice, indicating no differences in robustness between pathological and healthy mice. The heterogeneous distribution of plaque development and arterial stiffening in atherosclerosis [10, 12], however, points out the importance of local PWV measurements. Therefore, future studies should focus on the 3D acquisition of the local PWV in the murine aortic arch based on the presented method, in order to enable spatially resolved correlations of local arterial stiffness with other hemodynamic parameters and plaque composition. In Chapter 3, the previously established methods were used for the investigation of changing aortic hemodynamics during ageing and atherosclerosis in healthy wild type and atherosclerotic Apoe-/- mice using the previously established methods [4, 16] based on high-resolution 4D-flow MRI. In this work, serial measurements of healthy and atherosclerotic mice were conducted to track all changes in hemodynamics in the complete aortic arch over time. Moreover, spatially resolved 2D projection maps of WSS and OSI of the complete aortic arch were generated. This important feature allowed for the pixel-wise statistical analysis of inter- and intragroup hemodynamic changes over time and most importantly – at a glance. The study revealed converse differences of local hemodynamic profiles in healthy WT and atherosclerotic Apoe−/− mice, with decreasing longWSS and increasing OSI, while showing constant PWV in healthy mice and increasing longWSS and decreasing OSI, while showing increased PWV in diseased mice. Moreover, spatially resolved correlations between WSS, PWV, plaque and vessel wall characteristics were enabled, giving detailed insights into coherences between hemodynamics and plaque composition. Here, the circWSS was identified as a potential marker of plaque size and composition in advanced atherosclerosis. Moreover, correlations with PWV values identified the maximum radStrain could serve as a potential marker for vascular elasticity. This study demonstrated the feasibility and utility of high-resolution 4D flow MRI to spatially resolve, visualize and analyze statistical differences in all relevant hemodynamic parameters over time and between healthy and diseased mice, which could significantly improve our understanding of plaque progression towards vulnerability. In future studies the relation of vascular elasticity and radial strain should be further investigated and validated with local PWV measurements and CFD. Moreover, the 2D histological datasets were not reflecting the 3D properties and regional characteristics of the atherosclerotic plaques. Therefore, future studies will include 3D plaque volume and composition analysis like morphological measurements with MRI or light-sheet microscopy to further improve the analysis of the relationship between hemodynamics and atherosclerosis. Chapter 4 aimed at the description and investigation of hemodynamics in early stages of atherosclerosis. Moreover, this study included measurements of hemodynamics at baseline levels in healthy WT and atherosclerotic mouse models. Due to the lack of hemodynamic-related studies in Ldlr-/- mice, which are the most used mouse models in atherosclerosis research together with the Apoe-/- mouse model, this model was included in this study to describe changing hemodynamics in the aortic arch at baseline levels and during early atherosclerosis development and progression for the first time. In this study, distinct differences in aortic geometries of these mouse models at baseline levels were described for the first time, which result in significantly different flow- and WSS profiles in the Ldlr-/- mouse model. Further basal characterization of different parameters revealed only characteristic differences in lipid profiles, proving that the geometry is highly influencing the local WSS in these models. Most interestingly, calculation of the atherogenic index of plasma revealed a significantly higher risk in Ldlr-/- mice with ongoing atherosclerosis development, but significantly greater plaque areas in the aortic arch of Apoe-/- mice. Due to the given basal WSS and OSI profile in these two mouse models – two parameters highly influencing plaque development and progression – there is evidence that the regional plaque development differs between these mouse models during very early atherogenesis. Therefore, future studies should focus on the spatiotemporal evaluation of plaque development and composition in the three defined aortic regions using morphological measurements with MRI or 3D histological analyses like LSFM. Moreover, this study offers an excellent basis for future studies incorporating CFD simulations, analyzing the different measured parameter combinations (e.g., aortic geometry of the Ldlr-/- mouse with the lipid profile of the Apoe-/- mouse), simulating the resulting plaque development and composition. This could help to understand the complex interplay between altered hemodynamics, serum lipids and atherosclerosis and significantly improve our basic understanding of key factors initiating atherosclerosis development. Chapter 5 describes the establishment of a tissue-engineered artery model, which is based on native, decellularized porcine carotid artery scaffolds, cultured in a MRI-suitable bioreactor-system [23] for the investigation of hemodynamic-related atherosclerosis development in a controllable manner, using the previously established methods for WSS and PWV assessment [4, 16]. This in vitro artery model aimed for the reduction of animal experiments, while simultaneously offering a simplified, but completely controllable physical and biological environment. For this, a very fast and gentle decellularization protocol was established in a first step, which resulted in porcine carotid artery scaffolds showing complete acellularity while maintaining the extracellular matrix composition, overall ultrastructure and mechanical strength of native arteries. Moreover, a good cellular adhesion and proliferation was achieved, which was evaluated with isolated human blood outgrowth endothelial cells. Most importantly, an MRI-suitable artery chamber was designed for the simultaneous cultivation and assessment of high-resolution 4D hemodynamics in the described artery models. Using high-resolution 4D-flow MRI, the bioreactor system was proven to be suitable to quantify the volume flow, the two components of the WSS and the radStrain as well as the PWV in artery models, with obtained values being comparable to values found in literature for in vivo measurements. Moreover, the identification of first atherosclerotic processes like intimal thickening is achievable by three-dimensional assessment of the vessel wall morphology in the in vitro models. However, one limitation is the lack of a medial smooth muscle cell layer due to the dense ECM. Here, the utilization of the laser-cutting technology for the generation of holes and / or pits on a microscale, eventually enabling seeding of the media with SMCs showed promising results in a first try and should be further investigated in future studies. Therefore, the proposed artery model possesses all relevant components for the extension to an atherosclerosis model which may pave the way towards a significant improvement of our understanding of the key mechanisms in atherogenesis. Chapter 6 describes the development of an easy-to-prepare, low cost and fully customizable artery model based on biomaterials. Here, thermoresponsive sacrificial scaffolds, processed with the technique of MEW were used for the creation of variable, biomimetic shapes to mimic the geometric properties of the aortic arch, consisting of both, bifurcations and curvatures. After embedding the sacrificial scaffold into a gelatin-hydrogel containing SMCs, it was crosslinked with bacterial transglutaminase before dissolution and flushing of the sacrificial scaffold. The hereby generated channel was subsequently seeded with ECs, resulting in an easy-to-prepare, fast and low-cost artery model. In contrast to the native artery model, this model is therefore more variable in size and shape and offers the possibility to include smooth muscle cells from the beginning. Moreover, a custom-built and highly adaptable perfusion chamber was designed specifically for the scaffold structure, which enabled a one-step creation and simultaneously offering the possibility for dynamic cultivation of the artery models, making it an excellent basis for the development of in vitro disease test systems for e.g., flow-related atherosclerosis research. Due to time constraints, the extension to an atherosclerosis model could not be achieved within the scope of this thesis. Therefore, future studies will focus on the development and validation of an in vitro atherosclerosis model based on the proposed bi- and three-layered artery models. In conclusion, this thesis paved the way for a fast acquisition and detailed analyses of changing hemodynamics during atherosclerosis development and progression, including spatially resolved analyses of all relevant hemodynamic parameters over time and in between different groups. Moreover, to reduce animal experiments, while gaining control over various parameters influencing atherosclerosis development, promising artery models were established, which have the potential to serve as a new platform for basic atherosclerosis research. / Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei Hauptansätze zur Bewertung und Untersuchung der veränderten Hämodynamik wie Wandschubspannung, des oszillatorischen Scherindex und der arteriellen Pulswellengeschwindigkeit bei der Entwicklung und Progression der Atherosklerose durchgeführt: 1. Die Etablierung einer schnellen Methode zur gleichzeitigen Bestimmung der 3D-Wandschubspannung und der Pulswellengeschwindigkeit im gesamten Aortenbogen der Maus mittels hochauflösender 4D-Fluss-MRT 2. Die Verwendung von seriellen in vivo Messungen in atherosklerotischen Mausmodellen mittels hochauflösender 4D-Fluss-MRT, die in Studien zur Beschreibung der veränderten Hämodynamik bei später und früher Atherosklerose aufgeteilt wurden 3. Die Entwicklung von tissue-engineerten Arterienmodellen für die kontrollierte Anwendung und Variation von hämodynamischen und biologischen Parametern, unterteilt in native Arterienmodelle und biofabrizierte Arterienmodelle, mit dem Ziel, die Beziehung zwischen Atherogenese und veränderter Hämodynamik zu untersuchen Kapitel 2 beschreibt die Etablierung einer Methode zur gleichzeitigen Messung von 3D-Wandschubspannung und Pulswellengeschwindigkeit im Aortenbogen der Maus unter Verwendung der Ultrahochfeld-MRT bei 17,6T [16], die auf der zuvor veröffentlichten Methode zur schnellen, selbstnavigierten Messung der Wandschubspannung im Aortenbogen der Maus unter Verwendung der radialen 4D-Phasenkontrast-MRT bei 17,6T [4] basiert. Dieses Projekt basiert auf der gemeinsamen Arbeit von Dr. Patrick Winter, der diese Methode entwickelt hat, und der Autorin dieser Thesis, Kristina Andelovic, die die Experimente und statistischen Analysen durchgeführt hat. Da die in diesem Kapitel beschriebene Methode die Grundlage für die folgenden in vivo Studien darstellt und sich nicht in die einzelnen Beiträge der Autoren aufteilen lässt, ohne dass wichtige Informationen verloren gehen, wurde dieses Kapitel nicht in die einzelnen Teile aufgeteilt, um grundlegende Informationen über die Mess- und Analysemethoden zu liefern und somit eine bessere Verständlichkeit für die folgenden Studien zu gewährleisten. Die größte Herausforderung in diesem Kapitel bestand darin, die Anforderung an eine hohe räumliche Auflösung zur Bestimmung der Geschwindigkeitsgradienten an der Gefäßwand für die WSS-Quantifizierung und an eine hohe zeitliche Auflösung für die Bestimmung der Pulswellengeschwindigkeit zu erfüllen, ohne die Messzeit aufgrund der Notwendigkeit von zwei separaten Messungen zu verlängern. Darüber hinaus ist für eine vollständige Erfassung der Hämodynamik im murinen Aortenbogen eine vollständige 3D-Messung des Aortenbogens erforderlich, die durch die Nutzung der retrospektiven Navigation und radialen Trajektorien erreicht wurde. Dies wurde durch ein hoch flexibles Rekonstruktionssystem ermöglicht, das entweder Bilder mit geringerer räumlicher Auflösung und höheren Bildraten für die Erfassung der Pulswellengeschwindigkeit oder mit höherer räumlicher Auflösung und niedrigeren Bildraten für die Erfassung der 3D-WSS in einer angemessenen Messzeit von nur 35 Minuten rekonstruieren konnte. Die in vivo-Bestimmung aller relevanter hämodynamischen Parameter, die mit der Entwicklung und dem Fortschreiten der Atherosklerose zusammenhängen, wurde somit in einer einzigen experimentellen Sitzung ermöglicht. Die Methode wurde an gesunden Wildtyp- und atherosklerotischen Apoe-/- Mäusen validiert, wobei keine Unterschiede in der Robustheit der Messungen zwischen pathologischen und gesunden Mäusen festgestellt werden konnten. Die heterogene Verteilung der Plaqueentwicklung und Arterienversteifung in der Atherosklerose [10, 12] weist jedoch auf die Wichtigkeit lokaler PWV-Messungen hin. Zukünftige Studien sollten sich daher auf die 3D-Erfassung der lokalen PWV im murinen Aortenbogen auf Grundlage der vorgestellten Methode konzentrieren, um räumlich aufgelöste Korrelationen der lokalen arteriellen Steifigkeit mit anderen hämodynamischen Parametern und der Plaquezusammensetzung zu ermöglichen. In Kapitel 3 wurden die zuvor etablierten Methoden zur Untersuchung der sich verändernden Hämodynamik in der Aorta während des Alterns und der Atherosklerose bei gesunden Wildtyp- und atherosklerotischen Apoe-/- Mäusen verwendet [4, 16], die auf hochauflösender 4D-Fluss MRT basieren. In dieser Arbeit wurden serielle Messungen an gesunden und atherosklerotischen Mäusen durchgeführt, um alle Veränderungen der Hämodynamik im gesamten Aortenbogen über die Zeit zu verfolgen. Zudem wurden in dieser Arbeit räumlich aufgelöste 2D-Projektionskarten der WSS und des OSI des gesamten Aortenbogens generiert. Diese Methode ermöglichte die pixelweise statistische Analyse der Unterschiede und hämodynamischen Veränderungen zwischen und innerhalb von Gruppen im Zeitverlauf und die Visualisierung auf einen Blick. Die Studie ergab sich gegensätzlich entwickelnde lokale hämodynamische Profile bei gesunden WT- und atherosklerotischen Apoe-/- Mäusen, wobei die longWSS über die Zeit abnahm und der OSI zunahm, während die PWV bei gesunden Mäusen konstant blieb. Im Gegensatz nahm die longWSS zu und der OSI bei kranken Mäusen ab, während die PWV über die Zeit zunahm. Darüber hinaus wurden räumlich aufgelöste Korrelationen zwischen WSS, PWV, Plaque und Gefäßwandeigenschaften ermöglicht, die detaillierte Einblicke in die Zusammenhänge zwischen Hämodynamik und Plaquezusammensetzung in der Atherosklerose bieten. Dabei wurde die zirkumferentielle WSS als potenzieller Marker für die Plaquegröße und -zusammensetzung bei fortgeschrittener Atherosklerose identifiziert. Darüber hinaus ergaben Korrelationen mit der PWV, dass der maximale radiale Druck als potenzieller Marker für die vaskuläre Elastizität dienen könnte. Zusammengefasst demonstriert diese Studie die Nützlichkeit der hochauflösenden 4D-Fluss MRT zur räumlichen Auflösung, Visualisierung und Analyse statistischer Unterschiede in allen relevanten hämodynamischen Parametern im Zeitverlauf und zwischen gesunden und erkrankten Mäusen, was unser Verständnis der Plaqueprogression in Richtung Vulnerabilität erheblich verbessern könnte. In zukünftigen Studien sollte jedoch der Zusammenhang zwischen Gefäßelastizität und radialem Druck weiter untersucht und mit lokalen PWV-Messungen und CFD validiert werden. Darüber hinaus spiegelten die histologischen 2D-Datensätze nicht die 3D-Eigenschaften und regionalen Charakteristika der atherosklerotischen Plaques wider. Daher sollten künftige Studien eine Analyse des 3D-Plaquevolumens und der 3D-Plaquenzusammensetzung sowie morphologische Messungen mittels MRT oder der Lichtblattmikroskopie mit einbeziehen, um das fundamentale Verständnis der Beziehung zwischen veränderter Hämodynamik und der Atherosklerose weiter zu verbessern. In Kapitel 4 ging es um die Beschreibung und Untersuchung der Hämodynamik in frühen Stadien der Atherosklerose. Darüber hinaus umfasste diese Studie zum ersten Mal Messungen der basalen Hämodynamik in gesunden WT- und atherosklerotischen Mausmodellen. Aufgrund des Mangels an Studien, die die Hämodynamik in Ldlr-/- Mäusen beschreiben, die zusammen mit dem Apoe-/- Mausmodell die am häufigsten verwendeten Mausmodelle in der Atheroskleroseforschung sind, wurde dieses Modell in diese Studie integriert, um erstmals die sich verändernde Hämodynamik im Aortenbogen zu Beginn und während der Entwicklung und Progression der frühen Atherosklerose zu beschreiben. In dieser Studie wurden erstmals deutliche Unterschiede in den basalen Aortengeometrien dieser Mausmodelle identifiziert, die zu signifikant unterschiedlichen Fluss- und WSS-Profilen im Ldlr-/- Mausmodell führen. Eine weitere basale Charakterisierung verschiedener Parameter ergab nur modell-charakteristische Unterschiede in den Lipidprofilen, was beweist, dass die Geometrie die lokale WSS in diesen Modellen stark beeinflusst. Interessanterweise ergab die Berechnung des atherogenen Plasma-Indexes ein signifikant höheres Risiko bei Ldlr-/- Mäusen mit fortschreitender Atheroskleroseentwicklung, aber signifikant größere Plaqueflächen im Aortenbogen der Apoe-/- Mäuse. Aufgrund des gegebenen basalen WSS- und OSI-Profils in diesen beiden Mausmodellen - zwei Parameter, die die Plaque-Entwicklung und -Progression stark beeinflussen - gibt es Hinweise darauf, dass sich die regionale Plaque-Entwicklung zwischen diesen Mausmodellen während der Atherogenese stark unterscheidet. Daher sollten sich künftige Studien auf die räumlich-zeitliche Bewertung der Plaqueentwicklung und -Zusammensetzung in den drei definierten Aortenregionen konzentrieren, wobei morphologische Messungen mittels MRT oder histologische 3D-Analysen wie LSFM zum Einsatz kommen. Darüber hinaus bietet diese Studie eine hervorragende Grundlage für künftige Studien mit CFD-Simulationen, in denen die verschiedenen gemessenen Parameterkombinationen (z. B. die Aortengeometrie der Ldlr-/-Maus mit dem Lipidprofil der Apoe-/- Maus) analysiert und die daraus resultierende Plaqueentwicklung und -Zusammensetzung simuliert werden. Dies könnte zum Verständnis des komplexen Zusammenspiels zwischen veränderter Hämodynamik, Serumlipiden und Atherosklerose beitragen und unser grundlegendes Verständnis der Schlüsselfaktoren für die Entstehung von Atherosklerose deutlich verbessern. In Kapitel 5 wird die Etablierung eines tissue-engineerten Arterienmodells beschrieben, das auf nativen, von Schweinehalsschlagadern hergestellten, dezellularisierten Gerüststrukturen basiert. Diese wurden zudem in einem MRT-geeigneten Bioreaktorsystem [23] kultiviert, um die hämodynamisch bedingte Atheroskleroseentwicklung auf kontrollierbare Weise zu untersuchen, wobei hierfür die zuvor etablierten Methoden zur WSS- und PWV-Bewertung [4, 16] verwendet wurden. Dieses in vitro Arterienmodell zielte auf die Reduzierung von Tierversuchen ab und bot gleichzeitig eine vereinfachte, aber vollständig kontrollierbare physikalische und biologische Umgebung. Zu diesem Zweck wurde in einem ersten Schritt ein sehr schnelles und schonendes Dezellularisierungsverfahren etabliert, das zu Gerüststrukturen basierend auf Schweinehalsschlagadern führte, die eine vollständige Azellularität aufwiesen, wobei gleichzeitig die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix, die allgemeine Ultrastruktur und die mechanischen Eigenschaften der nativen Arterien erhalten blieben. Darüber hinaus wurde eine gute Zelladhäsion und -proliferation erreicht, die mit isolierten menschlichen Endothelzellen aus humanem Vollblut untersucht wurde. Darüber hinaus wurde zum ersten Mal eine MRT-geeignete Arterienkammer für die gleichzeitige Kultivierung der generierten Modelle und der Untersuchung der hochauflösenden 4D-Hämodynamik in diesen Arterienmodellen entwickelt. Unter Verwendung der hochauflösenden 4D-Fluss-MRT erwies sich das Bioreaktorsystem als sehr geeignet, den Volumenstrom, die beiden Komponenten der WSS inklusive dem radialen Druck und die PWV in den Arterienmodellen zu quantifizieren, wobei die erhaltenen Werte sehr gut mit den in der Literatur gefundenen Werten für in vivo-Messungen vergleichbar sind. Darüber hinaus lassen sich durch die dreidimensionale Untersuchung der Gefäßwandmorphologie in den in vitro-Modellen erste atherosklerotische Prozesse wie die Verdickung der Intima erkennen. Eine Einschränkung ist jedoch das Fehlen einer medialen glatten Muskelzellschicht aufgrund der dichten ECM des Gewebegerüsts. Die Verwendung der Laserschneidetechnik zur Erzeugung von Löchern und / oder Gruben im Mikrometerbereich, die eine Besiedlung des Mediums mit SMCs ermöglichen, zeigte in einem ersten Versuch vielversprechende Ergebnisse und sollte in zukünftigen Studien daher dringend weiter untersucht werden. Das präsentierte Arterienmodell verfügt somit über alle relevanten Komponenten für die Erweiterung zu einem Atherosklerosemodell und ebnet den Weg für ein deutlich besseres Verständnis der Schlüsselmechanismen in der Atherogenese. Kapitel 6 beschreibt die Entwicklung eines einfach herzustellenden, kostengünstigen und vollständig an gegebene Bedürfnisse anpassbaren Arterienmodells auf Grundlage von Biomaterialien. Hier wurden thermoresponsive Opfergerüststrukturen, die mit der MEW-Technik hergestellt wurden, zur Herstellung variabler, biomimetischer Formen verwendet, um die geometrischen Eigenschaften des Aortenbogens, bestehend aus Verzweigungen und Krümmungen, zu imitieren. Nach der Einbettung der Opfergerüststruktur in ein Gelatin-Hydrogel, das zudem SMCs enthält, wurde es mit bakterieller Transglutaminase vernetzt, bevor es aufgelöst und gespült wurde. Der so entstandene Hydrogelkanal wurde anschließend mit Endothelzellen besiedelt, wodurch ein einfach zu erstellendes, schnelles und kostengünstiges Arterienmodell entstand. Im Gegensatz zum nativen Arterienmodell ist dieses Modell daher deutlich variabler in Größe und Form und bietet die wichtige Möglichkeit, von Anfang an glatte Muskelzellen mit einzubringen. Darüber hinaus wurde speziell für die gegebene Gerüststruktur eine maßgeschneiderte und hochgradig anpassungsfähige Perfusionskammer entwickelt, die eine sehr schnelle und einstufige Herstellung des Arterienmodells ermöglicht und gleichzeitig die Möglichkeit zur dynamischen Kultivierung der Modelle bietet, was eine hervorragende Grundlage für die Entwicklung von in vitro Krankheits-Testsystemen für z.B. die Atheroskleroseforschung im Zusammenhang mit der Hämodynamik darstellt. Aus Zeitgründen konnte die Ausweitung auf ein Atherosklerosemodell jedoch im Rahmen dieser Arbeit nicht realisiert werden. Daher werden sich zukünftige Studien auf die Entwicklung und Validierung eines in vitro-Atherosklerosemodells konzentrieren, das auf den hier entwickelten zwei- und dreischichtigen Arterienmodellen basiert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit den Weg für eine schnelle Erfassung und detaillierte Analyse der sich verändernden Hämodynamik während der Entwicklung und der Progression der Atherosklerose geebnet hat, einschließlich räumlich aufgelöster Analysen aller relevanten hämodynamischen Parameter im Zeitverlauf innerhalb einer Gruppe und zwischen verschiedenen Gruppen. Darüber hinaus wurden vielversprechende Arterienmodelle etabliert, die das Potenzial haben, als neue Plattform für die Atherosklerose-Grundlagenforschung zu dienen, um Tierversuche zu minimieren und gleichzeitig die Kontrolle über verschiedene Parameter zu erlangen, die die Atheroskleroseentwicklung beeinflussen.

Einführung: Atherosklerose ist eine führende Ursache von Morbidität und Mortalität weltweit. Die ApoE-Knock-Out-Maus (ApoE-/-) ist das wichtigste Tiermodell für das Studium der Atherosklerose und von Interventionen auf diese Erkrankung. Mittels hochaufgelöster Magnet-Resonanz-Bildgebung ist es möglich, eine nicht-invasive in-vivo Gefäß-Charakterisierung bei Mäusen durchzuführen. In dieser Arbeit wurden die Auswirkungen von Sport auf die Gefäßfunktion der Aorta ascendens und abdominalis bei ApoE-/--Mäusen mittels hochaufgelöster MR-Cine-FLASH-Bildgebung untersucht. Methodik und Ergebnisse: 18 ApoE-/--Mäuse mit oder ohne Lipid-reicher „Western Type Diet“ (WTD) führten 4-6 Wochen lang Laufrad-Training durch. Vor Laufrad-Training wurde zweimal (Validität) und nach Laufrad-Training einmal mittels EKG- und Atmungs-getriggerter Magnet-Resonanz-Cine-FLASH-Bildgebung an einem 7-Tesla-Scanner unter Isofluran-Inhalationsnarkose die Compliance von Aorta ascendens und abdominalis gemessen. Aufnahme-Parameter: TR/TE = 4,3/1,4 ms; Field of View (FOV) = 3,0 x 3,0 cm2; Matrixgröße = 256 x 256; Pixel-Größe = (FOV / Matrix) = (30 mm / 256) = 0,0117 mm2; Schichtdicke = 1,0 mm, Auflösung von 0,0137 mm3. Die Resultate wurden verglichen mit 9 Wildtyp-Mäusen vom Stamm C57BL/6J, und mittels der Auswerte-Software Interactive Data Language (IDL) prozessiert. Es zeigten sich gewisse positive Effekte hinsichtlich Compliance der Aorta ascendens durch Sport, die Ergebnisse waren für ApoE-/--Mäuse ohne WTD jedoch wesentlich konsistenter als für ApoE-/--Mäuse mit WTD, wo die Ergebnisse teilweise widersprüchlich erscheinen. Dasselbe gilt für die Aorta abdominalis, die sich zudem in vielen MR-Untersuchungen nicht auswerten ließ, was zu nicht interpretierbaren Ergebnissen führte. Bezüglich der Validität zeigte sich eine sehr hohe Intra-Observer- und Inter-Observer-Übereinstimmung der Ergebnisse, dies zeigte sich auch für Messungen zu zwei Zeitpunkten. Schlussfolgerung: Die Ergebnisse erscheinen insgesamt kritisch beleuchtet nicht signifikant und zeigen allenfalls Besserungs-Tendenzen für die Compliance der Aorta ascendens und abdominalis bei ApoE-/--Mäusen durch Sport. Weitere MRT-Studien mit höheren Feldstärken und weiterentwickelten MR-Protokollen sind notwendig, um die Aussage dieser Doktorarbeit, dass Atherosklerose bei ApoE-/--Mäusen durch Sport teilweise reversibel ist, zu bestätigen. / Introduction: Atherosclerosis is a leading cause of morbidity and mortality throughout the world. The apoE-knock-out mice is the most important animal model of studies on atherosclerosis and of interventions on atherosclerotic diseases. High-resolution magnetic resonance imaging (MRI) allows to non-invasively provide in-vivo murine vessel characterization. This work aims to determine the impact of sports training on vessel function of the ascending and abdominal aorta in hypercholesterinemic apoE-knock-out mice by high-resolution CINE MR-Flash-imaging. Methods and Results: 18 ApoE-knock-out mice with or without lipid-rich "Western Type Diet" (WTD) performed 4-6 weeks of running wheel training. Using ECG- and breathing-triggered CINE MR-Flash-imaging on a 7-Tesla-MR-Scanner under isofluran anesthesia the compliance of the ascending and abdominal aorta was examined twice (validity) before and once after running wheel training. MR-paramter: TR/TE = 4,3/1,4 ms; field of view 3,0 x 3,0 cm2; matric size 256-256; Pixel size = 0,0117 mm2; slice thickness 1,0 mm, resulting resolution 0,0137 mm3. The results were compared with 9 wild type mice (C57Bl/6J), and analyzed by means of software (Interactive Data Language, IDL). The results showed positive effects in respect to the compliance of the ascending aorta after training, being much more consistent for apoE-knock out mice without WTD than in mice with WTD, where the results seem contradictory. The same goes for the abdominal aorta, where many MRI-examinations were not evaluable. A high inter- and intra-observer-validity could be shown for analyzation of the results. Conclusion: The results do not seem to be significant and at most show a tendency of improvement in respect to the complicance of the ascending and abdominal aorta in apoE-knock-out mice after training. Further MRI studies with higher strengths of field and advanced MR-protocolls will be necessary to confirm the results of this work, that atherosclerosis can be partially reversible through exercise training.

Arteriosklerose mit ihren Folgeerkrankungen ist weltweit die Erkrankung mit der höchsten Mortalität und einer hohen Morbidität. Chronische Inflammationsprozesse spielen eine zentrale Rolle in der Atherogenese. Akutphaseproteinen, insbesondere dem C-reaktiven Protein (CRP) kommen als Marker chronischer Inflammationsprozesse in der Prädiktion kardiovaskulärer Ereignisse eine besondere Bedeutung zu. Erhöhte CRP-Spiegel wurden in zahlreichen Studien als Risikofaktor für Arteriosklerose und ihre Folgeerkrankungen identifiziert. Inzwischen gibt es auch einige Hinweise, die eine Rolle von CRP über die Rolle als passiver Indikator hinaus als aktiven Teilnehmer in der Arteriosklerose aufzeigen. Oxidiertes LDL ist ebenso als Risikofaktor anerkannt, die Aufnahme in Endothelzellen ist ein wichtiger Teilschritt in der Pathogenese der Arteriosklerose. Acetyliertes LDL (acLDL) wurde als Modell für oxLDL gewählt. Wir konnten nun in der FACS-Analyse zeigen dass, sich die verschiedenen Konfigurationen von CRP, monomeres CRP (mCRP) und pentameres CRP(nCRP) in der Beeinflussung der Aufnahme von acLDL in Endothelzellen unterscheiden. M-CRP führt zur Erniedrigung der Aufnahme, nCRP nicht. Dies bestätigte sich auch in der Immunfluoreszenzfärbung, die auch eine deutlichen Abnahme der acLDLAufnahme unter Einfluss von mCRP in den Endothelzellen zeigte, nCRP bewirkte dies nach 1 und 8 Stunden Inkubation nicht. Es konnte hier also gezeigt werden, dass sich die beiden CRP-Konfigurationen in der Beeinflussung des oxLDL-Metabolismus unterscheiden. Um diesen Effekt näher zu charakterisieren, untersuchten wir die Rolle der mutmaßlichen CRP-Rezeptoren auf Endothelzellen, CD16 und CD32. Sie konnten in Endothelzellen nicht nachgewiesen werden und Antikörper gegen CD16 und CD32 hatten keinen Einfluss auf die LDL-Aufnahme in Endothelzellen. Wir konnten so zeigen, dass CD16 und CD32 (mit den Isoformen a,b und c), die als Rezeptoren für mCRP und nCRP gesehen werden, nicht exprimiert wurden und so nicht an den inhibitorischen Effekten von mCRP auf die acLDLAufnahme beteiligt sind. Wir schlagen daher vor, dass andere Rezeptoren und/oder nichtrezeptorvermittelte Signalwege, wie eine Interaktion mit der Zellmembran (wie beispielsweise mit Lipid rafts), an der Entstehung des mCRP-Effektes in Endothelzellen beteiligt sind. Weitere Untersuchungen sind noch nötig, um den Effekt und seine Bedeutung in der Pathogenese der Arteriosklerose besser zu verstehen. Ansatzpunkte für zukünftige Forschungen sind beispielsweise die Signalkaskade von CRP mit seinen Konfigurationen, die Rezeptoren von CRP und die Herkunft von mCRP in vivo. / Arteriosclerosis and its associated diseases is the disease with the highest mortality worldwide and a high morbidity. Chronic Inflammation has a crucial role in Atherogenesis. Acute-phase proteins, especially C-reactive Protein (CRP) are important predictors for cardiovascular endpoints. Elevated CRP-Levels have been identified by various studies as independent risk factor for cardiovascular endpoints. There is emerging evidence for an active Role of CRP in Atherogenesis surpassing its role as a marker. Oxidized LDL (oxLDL) is well known as risk factor for arteriosclerosis, its uptake into endothelial cells is an important step in Atherogenesis. Acetylated LDL (acLDL) was chosen as model for oxLDL. We could show in FACS-Analysis, that the distinct configurations of CRP, monomeric CRP (mCRP) and pentameric CRP (nCRP) have different effects on the uptake of acLDL in endothelial cells. M-CRP decreases the uptake significantly, nCRP has no effect. This was confirmed in Immunofluorescence, where also a significant decrease in the uptake of acLDL under the influence of mCRP was seen. To further investigate this effect, we examined the role of the putative CRP-Receptors on endothelial cells, CD16 and CD32. In RT-PCR there was no mRNA expressed in the endothial cells, and function-blocking antibodies directed against CD16 and CD32 had no influence on the uptake of acLDL. We conclude, that CD16 and CD32 (with its isoforms a,b and c) are not expressed in endothelial cells and do not take part in the inhibitory effects of mCRP on the uptake of acLDL. We suggest that other receptors and/or non-receptormediated signalpathways, like an interaction with the cell membrane (e.g. lipid rafts) mediate this effect. Further investigations are needed to better understand this effect and its role in Atherogenesis, the signaling cascade of CRP and its configurations, the receptors for CRP and the origin of mCRP in vivo.

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Atherosklerotische Arterien unterliegen strukturellem Umbau und chronischer Inflammation, die von einer dynamischen Entwicklung von Vasa vasorum (VV) begleitet wird. Die Beteiligung von Leukozyten und von vaskulären Vorläuferzellen an der Neovaskularisierung sowie die intimale Hyperplasie stehen im Zentrum der Atheroskleroseforschung. Damit verbundene Erkenntnisse könnten neue therapeutische Ansätze ermöglichen. Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit der morphologischen Verteilung von Leukozyten (CD45, CD68, Mastzellen) und von Zellen mit Vorläufermarkern (CD34, CD117, VEGFR-2) in menschlichen Coronararterien mit verschiedenen atherosklerotischen Schweregraden. Mittels immunhistologischer Technik wurden Intima und Adventitia untersucht und die Ergebnisse zu den atherosklerotischen Schweregraden und der Neovaskularisierung korreliert. In Intima, Adventitia und dem perivaskulären Fettgewebe hat die Dichte der CD45+ Lymphozyten ihr Maximum im atherosklerotischen Grad 3. Dabei konnte sowohl in der Intima als auch in der Adventitia gezeigt werden, daß eine lineare Korrelation der CD45+ Lymphozyteninfiltration und VV-Dichte vorliegt. Es wurden zwei unterschiedliche Entzündungsmuster festgestellt. Beide zeigen in Grad 3 eine Zunahme der Zelldichten. In Grad 4-5 fällt die Dichte des einen Musters (CD45+, VEGFR-2+, VV) jedoch ab, während die Dichte des anderen Musters (CD34+, CD68+, Tryptase+, CD117+) in Grad 4-5 keine Veränderung aufweist. Die Ergebnisse deuten darauf hin, daß Leukozyten und vaskuläre Vorläuferzellen im Verlauf der Atherogenese wechselnde Funktionen wahrnehmen können. Sie nehmen offensichtlich VV als Eintrittspforte in die Gefäßwand.

Characterized as a chronic inflammatory disease of the large arteries, atherosclerosis is the primary cause of cardiovascular disease, the leading contributor of morbidity and mortality worldwide. Elevated plasma cholesterol levels and chronic inflammation within the arterial plaque are major mediators of plaque initiation, progression, and instability. In 2003, the protein PCSK9 (proprotein convertase subtilisin/kexin 9) was discovered to play a critical role in cholesterol regulation, thus becoming a key player in the mechanisms behind atherosclerotic plaque development. Emerging evidence suggests that PCSK9 could potentially have effects on atherosclerosis that are independent of cholesterol levels. The objective of this review was to discuss the role on PCSK9 in oxidation, inflammation, and atherosclerosis. This function activates proinflammatory cytokine production and affects oxidative modifications within atherosclerotic lesions, revealing its more significant role in atherosclerosis. Although a variety of evidence demonstrates that PCSK9 plays a role in atherosclerotic inflammation, the direct mechanism of involvement is still unknown, driving a gap in knowledge to such a predominant player in cardiovascular disease. Investigation of proteins structurally related to PCSK9 may interestingly be the link in unveiling the mechanistic role of this protein’s involvement in oxidation and inflammation. Importantly, the unique structure of PCSK9 bears structural homology to a one‐of‐a‐kind domain found in the metabolic protein resistin, which is responsible for many of the same inflammatory outcomes as PCSK9. Closing this gap in knowledge of PCSK9`s role in atherosclerotic oxidation and inflammation will provide fundamental information for understanding, preventing, and treating cardiovascular disease.

Arteriosklerose führt zu schwerwiegenden klinischen Komplikationen bei Herz-Kreislauf-erkrankungen, welche die führenden Todesursachen in den westlichen Industrieländern sind. Die Arteriosklerose ist typischerweise eine Erkrankung arterieller Gefäße und betrifft nicht die venöse Gefäßwand. Bei der Entstehung von Arteriosklerose spielen die Endothelzellen als Barrierezellen und Regulatoren der Gefäßfunktion eine Schlüsselrolle. Ein wichtiger Schwerpunkt der Forschung ist die Differenzierung der Endothelzellen. Arterielle und venöse Endothelzellen weisen schon im frühen Embryonalstadium unterschiedliche Phänotypen auf. Ein besseres Verständnis der arterio-venösen Differenzierung wäre von großer Bedeutung für antiarteriosklerotische Therapien. Darüber hinaus könnte eine Reprogrammierung (z.B. von Vene in Arterie) entscheidend für neue Therapieansätze bei der Senkung der Restenoserate venöser Bypässe von Patienten mit koronarer Herzkrankheit und bei AV-Shunt-Operationen von dialysepflichtigen Patienten sein. In dieser Arbeit wurden differenzierte humane primäre arterielle und venöse Endothelzellen nach Genmodulation untersucht. Der Fokus der Genmodulation wurde auf das arterielle Markergen Hey2 und auf das venöse Markergen COUP-TFII gelegt. Das arterielle Markergen Hey2 ist ein Zielgen der Notch-Signalkaskade, während der molekulare Mechanismus der Rolle von COUP-TFII bei der venösen Differenzierung noch nicht bekannt ist. Daher wurde der Einfluss des arteriellen Markergens Hey2 und des venösen Markergens COUP-TFII auf die Notch-Signalkaskade untersucht, um ein besseres Verständnis über die molekularen Mechanismen der arterio-venösen Differenzierung zu gewinnen. Da humane primäre Endothelzellen mit kommerziell verfügbaren Transfektionsmitteln schwer transfizierbar sind, wurde zunächst ein lentivirales Vektorsystem etabliert. Hiermit wurde eine erfolgreiche und stabile Genexpression bzw. Genrepression in arteriellen und venösen Endothelzellen ermöglicht. Die Genmodulationen in arteriellen Endothelzellen, die durch die Expression des venösen Markergen COUP-TFII bzw. durch die Repression des arterellen Markergen Hey2 verursacht wurden, führten zu der neuen Erkenntnis, dass das venöse Markergen COUP-TFII in arteriellen Endothelzellen als ein Repressor des arteriellen Markergens Hey2 fungiert. Diese Repression wird durch eine direkte Bindung von COUP-TFII an den Hey2-Promotor vermittelt. Die COUP-TFII Expression bewirkte keine Veränderung in der Expression von Notch4, Dll4 und Nrp1. Dies könnte bedeuten, dass (i) COUP-TFII in arteriellen Endothelzellen kein Regulator von diesen Genen ist, (ii) Kooperationspartner von COUP-TFII fehlen, die in arteriellen Endothelzellen nicht vorhanden sind, oder (iii) der molekulare Mechanismus dieser Gene aufgrund seiner wichtigen Rolle nicht durch die Modifikation eines einzigen Gens beeinflussbar ist, da die Gene der Notch-Signalkaskade redundant kontrolliert werden. In venösen Endothelzellen wurden Genmodulationen durch Expression des arteriellen Markergens Hey2 bzw. durch die Repression des venösen Markergens COUP-TFII durchgeführt. Eine Expression des arteriellen Markergens Hey2 in venösen Endothelzellen konnte nicht die Expression der Gene der Notch-Signalkaskade aktivieren. Dies bedeutet, dass die Regulation dieser Gene durch einen übergeordneten molekularen Mechanismus gesichert ist. Interessanterweise konnte die Expression von Hey2 eine Reduktion der Hey1 Expression bewirken. Dies ist ein alternativer Effekt von Hey2 im Vergleich zu arteriellen Endothelzellen. Eine Repression des venösen Markergens COUP-TFII konnte die Expression der Gene Dll4, EphrinB2 und EphB4 induzieren. Vermutlich ist die Induktion der EphB4 Expression ein Kompensationsmechanismus auf die reduzierte COUP-TFII Expression. COUP-TFII sichert den venösen Phänotyp wahrscheinlich durch die Repression von EphrinB2 und Dll4, wobei die Reduktion von Dll4 vermutlich eine größere Bedeutung hat. Da Dll4 ein Ligand und Aktivator der Notch-Signalkaskade ist, ist seine Repression entscheidend für venöse Endothelzellen. Das arterielle Markergen Hey2 ist für die normale Embryogenese von großer Bedeutung, jedoch ist Hey2 als eines der Zielgene der Notch-Signalkaskade wahrscheinlich nicht in der Lage, molekulare Mechanismen, die zu unterschiedlichen endothelialen Phänotypen führen, zu aktivieren. Um arterielle Endothelzellen zu einem Reprogramming zu bewegen, wären wahrscheinlich Genmodulationen der Mitglieder der Notch-Signalkaskade, die upstream von Hey2 liegen, nötig. Hingegen ist die Rolle des venösen Markergens COUP-TFII in der Regulation der arterio-venösen Differenzierung von entscheidender Bedeutung. COUP-TFII spielt eine direkte Rolle in der Aufrechterhaltung der venösen Identität. Die Repression von COUP-TFII in venösen Endothelzellen bewirkt, dass sich die Expression des Gens Dll4, das die Notch-Signalkaskade aktiviert, in Richtung des arteriellen Expressionsniveaus bewegt. Für eine Reprogrammierung der venösen Endothelzellen in einen arteriellen Phänotyp ist das venöse Markergen COUP-TFII eines der Zielgene.

Arteriosklerose führt zu schwerwiegenden klinischen Komplikationen bei Herz-Kreislauf-erkrankungen, welche die führenden Todesursachen in den westlichen Industrieländern sind. Die Arteriosklerose ist typischerweise eine Erkrankung arterieller Gefäße und betrifft nicht die venöse Gefäßwand. Bei der Entstehung von Arteriosklerose spielen die Endothelzellen als Barrierezellen und Regulatoren der Gefäßfunktion eine Schlüsselrolle. Ein wichtiger Schwerpunkt der Forschung ist die Differenzierung der Endothelzellen. Arterielle und venöse Endothelzellen weisen schon im frühen Embryonalstadium unterschiedliche Phänotypen auf. Ein besseres Verständnis der arterio-venösen Differenzierung wäre von großer Bedeutung für antiarteriosklerotische Therapien. Darüber hinaus könnte eine Reprogrammierung (z.B. von Vene in Arterie) entscheidend für neue Therapieansätze bei der Senkung der Restenoserate venöser Bypässe von Patienten mit koronarer Herzkrankheit und bei AV-Shunt-Operationen von dialysepflichtigen Patienten sein. In dieser Arbeit wurden differenzierte humane primäre arterielle und venöse Endothelzellen nach Genmodulation untersucht. Der Fokus der Genmodulation wurde auf das arterielle Markergen Hey2 und auf das venöse Markergen COUP-TFII gelegt. Das arterielle Markergen Hey2 ist ein Zielgen der Notch-Signalkaskade, während der molekulare Mechanismus der Rolle von COUP-TFII bei der venösen Differenzierung noch nicht bekannt ist. Daher wurde der Einfluss des arteriellen Markergens Hey2 und des venösen Markergens COUP-TFII auf die Notch-Signalkaskade untersucht, um ein besseres Verständnis über die molekularen Mechanismen der arterio-venösen Differenzierung zu gewinnen. Da humane primäre Endothelzellen mit kommerziell verfügbaren Transfektionsmitteln schwer transfizierbar sind, wurde zunächst ein lentivirales Vektorsystem etabliert. Hiermit wurde eine erfolgreiche und stabile Genexpression bzw. Genrepression in arteriellen und venösen Endothelzellen ermöglicht. Die Genmodulationen in arteriellen Endothelzellen, die durch die Expression des venösen Markergen COUP-TFII bzw. durch die Repression des arterellen Markergen Hey2 verursacht wurden, führten zu der neuen Erkenntnis, dass das venöse Markergen COUP-TFII in arteriellen Endothelzellen als ein Repressor des arteriellen Markergens Hey2 fungiert. Diese Repression wird durch eine direkte Bindung von COUP-TFII an den Hey2-Promotor vermittelt. Die COUP-TFII Expression bewirkte keine Veränderung in der Expression von Notch4, Dll4 und Nrp1. Dies könnte bedeuten, dass (i) COUP-TFII in arteriellen Endothelzellen kein Regulator von diesen Genen ist, (ii) Kooperationspartner von COUP-TFII fehlen, die in arteriellen Endothelzellen nicht vorhanden sind, oder (iii) der molekulare Mechanismus dieser Gene aufgrund seiner wichtigen Rolle nicht durch die Modifikation eines einzigen Gens beeinflussbar ist, da die Gene der Notch-Signalkaskade redundant kontrolliert werden. In venösen Endothelzellen wurden Genmodulationen durch Expression des arteriellen Markergens Hey2 bzw. durch die Repression des venösen Markergens COUP-TFII durchgeführt. Eine Expression des arteriellen Markergens Hey2 in venösen Endothelzellen konnte nicht die Expression der Gene der Notch-Signalkaskade aktivieren. Dies bedeutet, dass die Regulation dieser Gene durch einen übergeordneten molekularen Mechanismus gesichert ist. Interessanterweise konnte die Expression von Hey2 eine Reduktion der Hey1 Expression bewirken. Dies ist ein alternativer Effekt von Hey2 im Vergleich zu arteriellen Endothelzellen. Eine Repression des venösen Markergens COUP-TFII konnte die Expression der Gene Dll4, EphrinB2 und EphB4 induzieren. Vermutlich ist die Induktion der EphB4 Expression ein Kompensationsmechanismus auf die reduzierte COUP-TFII Expression. COUP-TFII sichert den venösen Phänotyp wahrscheinlich durch die Repression von EphrinB2 und Dll4, wobei die Reduktion von Dll4 vermutlich eine größere Bedeutung hat. Da Dll4 ein Ligand und Aktivator der Notch-Signalkaskade ist, ist seine Repression entscheidend für venöse Endothelzellen. Das arterielle Markergen Hey2 ist für die normale Embryogenese von großer Bedeutung, jedoch ist Hey2 als eines der Zielgene der Notch-Signalkaskade wahrscheinlich nicht in der Lage, molekulare Mechanismen, die zu unterschiedlichen endothelialen Phänotypen führen, zu aktivieren. Um arterielle Endothelzellen zu einem Reprogramming zu bewegen, wären wahrscheinlich Genmodulationen der Mitglieder der Notch-Signalkaskade, die upstream von Hey2 liegen, nötig. Hingegen ist die Rolle des venösen Markergens COUP-TFII in der Regulation der arterio-venösen Differenzierung von entscheidender Bedeutung. COUP-TFII spielt eine direkte Rolle in der Aufrechterhaltung der venösen Identität. Die Repression von COUP-TFII in venösen Endothelzellen bewirkt, dass sich die Expression des Gens Dll4, das die Notch-Signalkaskade aktiviert, in Richtung des arteriellen Expressionsniveaus bewegt. Für eine Reprogrammierung der venösen Endothelzellen in einen arteriellen Phänotyp ist das venöse Markergen COUP-TFII eines der Zielgene.

Atherosklerotische Arterien unterliegen strukturellem Umbau und chronischer Inflammation, die von einer dynamischen Entwicklung von Vasa vasorum (VV) begleitet wird. Die Beteiligung von Leukozyten und von vaskulären Vorläuferzellen an der Neovaskularisierung sowie die intimale Hyperplasie stehen im Zentrum der Atheroskleroseforschung. Damit verbundene Erkenntnisse könnten neue therapeutische Ansätze ermöglichen. Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit der morphologischen Verteilung von Leukozyten (CD45, CD68, Mastzellen) und von Zellen mit Vorläufermarkern (CD34, CD117, VEGFR-2) in menschlichen Coronararterien mit verschiedenen atherosklerotischen Schweregraden. Mittels immunhistologischer Technik wurden Intima und Adventitia untersucht und die Ergebnisse zu den atherosklerotischen Schweregraden und der Neovaskularisierung korreliert. In Intima, Adventitia und dem perivaskulären Fettgewebe hat die Dichte der CD45+ Lymphozyten ihr Maximum im atherosklerotischen Grad 3. Dabei konnte sowohl in der Intima als auch in der Adventitia gezeigt werden, daß eine lineare Korrelation der CD45+ Lymphozyteninfiltration und VV-Dichte vorliegt. Es wurden zwei unterschiedliche Entzündungsmuster festgestellt. Beide zeigen in Grad 3 eine Zunahme der Zelldichten. In Grad 4-5 fällt die Dichte des einen Musters (CD45+, VEGFR-2+, VV) jedoch ab, während die Dichte des anderen Musters (CD34+, CD68+, Tryptase+, CD117+) in Grad 4-5 keine Veränderung aufweist. Die Ergebnisse deuten darauf hin, daß Leukozyten und vaskuläre Vorläuferzellen im Verlauf der Atherogenese wechselnde Funktionen wahrnehmen können. Sie nehmen offensichtlich VV als Eintrittspforte in die Gefäßwand.