Thesis--Catholic Univ. of America. / Includes bibliographical references (p. 70-73).

ChuS est une protéine provenant d'une bactérie pathogène de l'humain qui a la capacité de lier et de dégrader l'hème de l'hôte pour en libérer le fer nécessaire à la croissance bactérienne. Deux résidus potentiellement importants du site actif, l'arginine 100 (R100) et l'acide aspartique 191 (D191) ont été investigués afin de mieux comprendre leur rôle dans la catalyse par ChuS. Nos résultats révèlent que le résidu D191 n'est pas essentiel à l'activité catalytique, mais qu'il est important pour la stabilité du complexe entre l'enzyme et l'un de ses substrats (hème) alors que le résidu R100 est absolument essentiel à l'activité catalytique. Nos études cinétiques et spectroscopiques détaillées fournissent des informations qui permettent de mieux comprendre le mécanisme catalytique de ChuS. Elles aident ainsi à obtenir une meilleure compréhension des voies d'acquisition de l'hème comme source de fer chez les bactéries pathogènes et à définir de nouvelles cibles thérapeutiques.

La chymosine, enzyme utilisée dans l´industrie fromagère pour coaguler le lait, est traditionnellement extraite à partir du quatrième estomac de veaux non sevrés. La préparation ainsi obtenue dénommée présure a été depuis un certain nombre d´années substituée par divers coagulants d´origine microbienne et de plantes car la production de cette enzyme seule n´était plus capable de répondre à la demande mondiale du fait notamment de l´augmentation de la production fromagère. La chymosine est cependant toujours considérée comme étant la meilleure enzyme pour coaguler le lait dans l´industrie fromagère. Ainsi, les techniques d´ingénierie génétique ont été utilisées pour produire de la chymosine bovine recombinante. C´est en utilisant ces techniques que nous proposons d´établir un procédé de production de chymosine bovine recombinante permettant l'innovation technologique et contribuant au maintien et au développement d'entreprises agro-alimentaires brésiliennes et des pays du Marché Economique du « Cone Sul » (MercoSul).<br />Nous avons ainsi cloné les séquences codant la préprochymosine A et la préprochymosine B à l'aide des techniques classiques de biologie moléculaire. Nous avons observé la présence de mutations dans la partie du propeptide de la prochymosine A et dans la partie mature de la prochymosine B. Cette dernière mutation, S79N, se situe dans la partie du tampon (résidus 72 à 86) qui constitue une anse externe mobile recouvrant le sillon du site actif. La conformation de ce tampon est caractéristique de la chymosine et serait en partie responsable pour sa grande spécificité. Nous avons modélisé cette mutation, qui semble entraîner des changements dans le réseau de liaisons hydrogène du tampon. Les séquences obtenues ont ainsi été introduites dans différents vecteurs d´expression puis clonées chez Escherichia coli et Pichia pastoris. L'expression des protéines a été suivie à l'aide d'anticorps spécifiques et au moyen de tests d'activité. Les différentes protéines sont toutes actives et ont été purifiées à l'homogénéité. Nous avons alors étudié leurs propriétés cinétiques à l'aide de différents substrats. Les chymosines B et BS79N ont un optimum de pH qui les différencie de la chymosine A. Le mutant B S79N a des propriétés cinétiques améliorées avec l´hexapeptide synthétique. La mutation S79N n´entraîne toutefois qu´une petite augmentation de la constante d´efficacité concernant les hydrolyses de la caséine Κ et du lait, bien que ses vitesses de réactions catalytiques soient supérieures à celles de la chymosine B. Ces résultats sont expliqués par les modifications dans le réseau de liaisons hydrogène du tampon, et par le fait que le nombre d'interactions entre le substrat et l'enzyme est une fonction de la masse moléculaire et de la nature du substrat.

L'élimination des protéines est une étape clé lors de la production du vin blanc afin d'éviter l'apparition éventuelle d'un voile inoffensif mais inesthétique. Des solutions de rechange à l'utilisation de la bentonite sont activement recherchées en raison des problèmes technologiques, organoleptiques et de durabilité associés à son utilisation. Dans cette étude, MpAPr1, une protéase aspartique extracellulaire préalablement isolée et partiellement caractérisée à partir de la levure Metschnikowia pulcherrima, a été clonée et exprimée de manière hétérologue dans la levure Komagataella pastoris. Les propriétés enzymatiques de MpAPr1 ont été initialement caractérisées dans un extrait brut. Après plusieurs essais faisant appel à différentes techniques, MpAPr1 a été purifié avec succès par chromatographie échangeuse de cations. Son activité contre les protéines de raisin a été initialement testée dans une solution modèle dans des conditions environnementales optimales pour l'activité de MpAPr1 puis dans celles qui règnent lors de la vinification. Ensuite, l'activité de MpAPr1 a été évaluée dans du moût de raisin et au cours de la fermentation alcoolique. La présence de MpAPr1, supplémenté au moût de raisin, a entraîné une dégradation partielle des protéines de raisin tout au long de la fermentation et une légère différence dans la composition en composés volatils du vin. L'étude a confirmé que les protéases aspartiques pourraient représenter une alternative à la bentonite pour l'industrie du vin et que les levures non-Saccharomyces telles que M. pulcherrima pourraient avoir un impact bénéfique sur les propriétés du vin. / Protein removal is a key step during the production of white wine in order to avoid the possible appearance of a harmless but unsightly haze. Alternatives to the use of bentonite are actively sought because of technological, organoleptic and sustainability issues associated with its use. In this study, MpAPr1, an extracellular aspartic protease previously isolated and partially characterised from the yeast Metschnikowia pulcherrima, was cloned and expressed heterologously in Komagataella pastoris. Enzymatic properties of MpAPr1 were initially characterised in a crude extract. After several attempts using different techniques, MpAPr1 was successfully purified via cation exchange chromatography. Its activity against haze-forming grape proteins was initially tested in a model solution under optimal environmental conditions for MpAPr1 activity and under those occurring during winemaking. Thereafter, MpAPr1 activity was evaluated in grape must and throughout alcoholic fermentation. The presence of MpAPr1, supplemented to grape must, resulted in the partial degradation of grape proteins throughout fermentation and ultimately in a slight difference in the wine’s composition in volatile compounds. The study provides further evidence that aspartic proteases could represent a potential alternative to bentonite for the wine industry and that non-Saccharomyces yeasts such as M. pulcherrima could have a beneficial impact on wine properties.

Lors de ces travaux de thèse, nous nous sommes intéressés à de nouveaux développements méthodologiques en cycloaddition 1,3-dipolaire de nitrones suivant deux axes principaux :<br />• l'étude de la réactivité des N-alcényloxazolidin-2-ones en tant que nouveaux dipolarophiles aza-substitués en cycloaddition 1,3-dipolaire à demande inverse vis-à-vis de nitrones.<br />• la mise en jeu de nitrones aspartiques originales en cycloaddition vis-à-vis de différents alcènes pour fournir des précurseurs d'aspartates α-substitués par une chaîne fonctionnelle.<br />Dans un premier temps, nous avons mis au point deux méthodes inspirées de celles de la littérature en partant d'une oxazolidin-2-ones pour synthétiser les N-alcényloxazolidin-2-ones: (i) vinylation cupro-catalysée utilisant un bromure d'alcényle, (ii) condensation avec un aldéhyde. Ces méthodes simples, générales, directes et à hauts rendements nous ont permis d'accéder aux N-alcényloxazolidin-2-ones de structure diverse.<br />Ces N-alcényloxazolidin-2-ones ont montré une grande réactivité en tant que dipolarophile vis-à-vis de diverses nitrones dans différentes conditions : thermiques (avec/sans solvant) et promues par TMSOTf. Les 5-aza-isoxazolidines diversement substituées originales ont été obtenues avec des rendements élevés mais de faibles stéréosélectivités. Cette limitation − due à l'instabilité configurationnelle des nitrones activées et à la flexibilité conformationnelle des N-alcényloxazolidin-2-ones − a été résolue par utilisation de la nitrone chirale à géométrie fixe de Tamura : les adduits trans-β sont obtenus avec d'excellents sélectivités<br />La tranformation des adduits issus de la N-benzyl-α-carbonyloxyéthylnitrone en dérivés aspartates carboxy-différenciés a été ensuite étudiée par une séquence en deux étapes (i) ouverture du cycle isoxazolidinique en aspartimide via N-quaternarisation par benzylation (ii) attaque chimiosélective d'un hétéronucléophile sur la fonction amide. Les aspartates carboxy-différenciés ont été obtenus avec de bons rendements, des excès énantiomériques élevés en version non-racémique, et un grand degré de diversité fontionnelle en ω (ester, amide, acide).<br />L'étude a été étendu à la cycloaddition 1,3-dipolaire des N-vinyloxazolidin-2-ones β,β-difluorées originales avec la N-benzyl-α-carbonyloxyéthylnitrone : les 4,4-difluoro-5-aza-isoxazolidines sont obtenues avec de bons rendements malgré une faible stéréosélectivité probablement due à un mécanisme non-concerté.<br />Notre étude a été complétée par l'accès à des dérivés d'α-aminoacides α,α-disubstitués via cycloaddition 1,3-dipolaire mettant en jeu de nouvelles nitrones aspartiques d'une stablilité configurationnelle inédite. Ce type de nitrones − préparé facilement par addition d'une N-benzylhydroxylamine sur un acétylènedicarboxylate – a montré une grande réactivité vis-à-vis d'une large gamme d'alcènes de différents natures électroniques. Les adduits issus des éthers vinyliques ont été obtenus avec de hauts sélectivités trans. L'extension asymétrique utilisant soit un éther vinylique chiral , soit une nitrone chirale a été effectuée et a permis l'obtention facile des adduits diastéréomériquement enrichis. A partie de ces adduits, un premier accès réussi aux dérivés aminoacides α,α-disubstitués a été réalisé en trois étapes. La diversification de cette méthodologie a été effectuée en utilisant une nitrone aspartique carboxy-différenciée.