Titre de l'écran-titre (visionné le 25 septembre 2023) / Les bactéries telles qu'Escherichia coli O157 : H7, un pathogène pour l'humain, ont besoin de fer pour survivre et croitre. Puisque chez les mammifères ce nutriment est principalement contenu dans l'hème de l'hémoglobine, plusieurs bactéries ont évolué pour mener à l'obtention de voies métaboliques dédiées à l'acquisition et la dégradation de l'hème. Chez E. coli O157 : H7, un groupe de 8 gènes nommé chu est responsable de ces activités. L'un de ces gènes code pour la protéine ChuS pouvant dégrader l'hème d'une manière inédite en condition aérobie. La réaction effectuée par ChuS peut être alimentée par du peroxyde d'hydrogène et de l'oxygène moléculaire, et mène à la dégradation de l'hème en tripyrrole et acide hématique ce qui libère le fer et produit également du monoxyde de carbone. De plus, la réaction catalysée par ChuS est facilitée par la présence d'une seconde enzyme, ChuY, qui est une réductase de la famille des hydrogénases/réductases à courtes chaines. Les objectifs de ce projet étaient de mieux comprendre les réactions catalysées par ChuS et le duo ChuS/ChuY ainsi que leurs intermédiaires et produits de réaction. L'étude de la protéine ChuS in vitro montre que la réaction de dégradation de l'hème doit être préférablement effectuée dans le tampon phosphate de sodium ou le tampon citrate pour mener à une réaction complète qui libère le fer car d'autres tampons affectent différemment l'activité enzymatique. Au cours de la réaction de dégradation de l'hème, nous avons déterminé que ChuS génère deux isomères de l'intermédiaire verdohème, soit les isomères bêta et delta, contrairement à l'hème oxygénase humaine qui génère spécifiquement l'isomère alpha. Globalement, cette étude a permis une meilleure compréhension du mécanisme de dégradation de l'hème par la protéine ChuS in vitro et ouvre la voie à une meilleure compréhension de sa réaction en contexte biologique chez le pathogène.

Les microorganismes pathogènes qui infectent l’être humain ont besoin de fer pour croître et se multiplier. Chez l’humain, la majorité du fer est séquestré dans l’hème et dans des protéines à cause de sa faible solubilité au pH physiologique en présence d’oxygène. Les bactéries pathogènes ont dû développer divers systèmes d’acquisition afin d’utiliser l’hème comme source de fer. Les protéines ChuX, ChuY et ChuW sont codées par des gènes faisant partie du regroupement de gènes chu codant pour une voie d’acquisition directe de l’hème chez la bactérie E. coli O157:H7. Peu d’attention a été portée à ces trois protéines et les fonctions prédites selon leur séquence primaire ont été investiguées. Dans ce mémoire, nos résultats révèlent que la protéine ChuY, faisant partie de la famille des réductases à courtes chaînes atypiques, réduit le tripyrrole issu de la réaction de dégradation de l’hème catalysée par ChuS en utilisant le NADPH comme cofacteur. Cette réductase accélère aussi de neuf fois la vitesse de l’étape limitante de la réaction de ChuS, soit l’ouverture du porphyrine du verdohème. Les études spectroscopiques et la détermination des constantes cinétiques pré-stationnaires ont permis de confirmer que ChuY agit de façon catalytique. Les résultats permettent aussi de proposer un modèle de dégradation de l’hème impliquant les protéines ChuS et ChuY. La protéine ChuX aurait un rôle dans le transport et le stockage de l’hème. Nos résultats ont montré que la protéine holo-ChuX transfère l’hème à la protéine apo-ChuS rapidement, et que celle-ci assure ensuite sa dégradation. Finalement, aucun essai enzymatique n’a été effectué avec la protéine ChuW à cause de son insolubilité. Dans l’ensemble, cette étude a permis d’obtenir une meilleure compréhension du rôle respectif des protéines ChuY et ChuX dans le système d’acquisition de l’hème par E. coli O157:H7. / Pathogenic microorganisms that infect a mammalian host need iron to survive and grow. However, because of its low solubility at physiologic pH in aerobic environment, the majority of iron is sequestered in heme and proteins. Pathogenic bacteria have developed ways to acquire heme from the host as a source of iron. ChuX, ChuY and ChuW are proteins encoded by a gene cluster involved in direct heme acquisition in Escherichia coli O157:H7. So far, these three proteins have received little attention. In this study, the functions of these proteins have been investigated based on predictions from the primary sequence analyses. Our results reveal that the ChuY protein, belonging to the short chain dehydrogenase/reductase family, reduces the tripyrrole derived from the heme degradation reaction catalyzed by the ChuS protein using NADPH as cofactor. ChuY also accelerates nine times the rate-limiting step of the ChuS reaction, which is the opening of the porphyrin ring of verdoheme. Spectroscopic studies and the determination of the pre-stationary kinetic constants have confirmed the catalytic reductase activity of ChuY. From our results, a model of heme degradation involving both the ChuY and ChuS proteins is proposed. The ChuX protein is predicted to have a role in the transport and storage of heme. Our results show that holo-ChuX can transfer heme to the apo-ChuS protein quickly, after which heme degradation can start. Enzymatic testing of the ChuW protein could not be carried out because of the insolubility of this protein. Overall, this study has resulted in a better understanding of the respective role of the ChuY and ChuX proteins in the direct heme acquisition system of E. coli O157:H7.

La découverte de l'activité antipaludique et antischistosomose de l'artémisinine, une molécule d'origine naturelle, met en lumière une nouvelle famille de composés actifs : les trioxanes. L'activation réductrice du peroxyde par un centre métallique de bas degré d'oxydation en fait des alkylants efficaces de l'hème. Les propriétés d'alkylation de dérivés de l'artémisinine vis-à-vis de l'hème libéré lors de la digestion de l'hémoglobine par Plasmodium ont été étudiées. Les schistosomoses, maladies dues à un parasite sanguin Schistosoma, sont une des premières causes infectieuses de mortalité au monde, pour lesquelles le praziquantel est le seul médicament disponible. Les schistosomes digèrent l'hémoglobine de l'hôte et forment un pigment d'hème semblable à celui produit par Plasmodium. Les trioxaquantels, molécules duales associant de façon covalente un trioxane à la pyrazino-isoquinoléine du praziquantel, ont été synthétisées et leurs activités biologiques évaluées sur schistosomes.

Le monoxyde de carbone (CO) est un gaz diffusible dont la production à l'état physiologique est majoritairement issue de la dégradation de l’hème par l’hème oxygénase (HO). Le CO endogène a des propriétés vasorelaxantes comparables à celles du monoxyde d’azote. L’effet du CO a été étudié dans des modèles d’ischémie coronarienne, d’insuffisance rénale aigue et d’hypertension artérielle : des propriétés anti-agrégantes, anti-prolifératives, anti-inflammatoires et anti-apoptotiques ont été mises en évidence. Ces propriétés suggèrent que le CO pourrait aussi jouer un rôle dans la prévention de la thrombose vasculaire, et la prévention de la progression de l’insuffisance rénale chronique. Dès lors, les objectifs de cette thèse ont été : 1) d’évaluer les effets in vivo d’un inducteur de l’HO-1, l’hémine, administré en chronique respectivement dans un modèle de thrombose carotidienne et dans un modèle d’insuffisance rénale chronique chez le rat et ; 2) de fournir des éléments susceptibles d’expliquer la mécanistique qui sous-tend les effets liés à l’induction de l’HO-1. Dans le modèle de thrombose artérielle validé chez le rat par notre laboratoire, l’administration chronique d’hémine à la dose de 50 mg/kg a réduit significativement le taux d’occlusion vasculaire par rapport aux animaux non traités (7,2% versus 71%; p<0,01). A l’inverse, les animaux traités par l’hémine recevant parallèlement un inhibiteur de l’HO-1 ont présenté des taux d’occlusion vasculaire comparables à ceux des animaux "contrôles". Ces résultats suggèrent que la réduction du taux d’occlusion artérielle observée, qui ne s’est pas accompagnée de modifications significatives de la pression artérielle, des paramètres sanguins ou de l’hémostase, est directement liée à l'expression vasculaire de l’HO-1. Dans le modèle d’insuffisance rénale chronique par néphrectomie des 5/6 chez le rat, l’administration chronique 2 fois par semaine d’hémine à la dose de 50 mg/kg a diminué significativement, par rapport aux animaux contrôles, la protéinurie (1,0 versus 7,3 g/mmol de créatinine), les index de glomérulosclérose (0,84 versus 2,53) et d’atrophie tubulaire rénale (0,9 versus 2,33), l’expression des protéines impliquées dans la progression de l’insuffisance rénale [(TGF-???0,62 versus 1,0) caspase-3 (0,35 versus 0,71); BMP-4 (0,11 versus 0,32)] et a augmenté significativement l’expression de la protéine BMP-7 néphroprotectrice (1,31 versus 0,38). Par rapport aux animaux recevant un antagoniste des récepteurs AT1 de l'angiotensine II (losartan à la dose de 20 mg/kg), traitement de référence utilisé au cours de l'étude, les effets de l'hémine ont été comparables pour l’expression de TGF-?? (0,62 versus 0,65) voire supérieurs pour son effet sur protéinurie (1 g/mmol de créatinine versus 2,2 g/mmol de créatinine), l’index de glomérulosclérose (0,84 versus 1,68) et d’atrophie tubulaire (0,9 versus 1,66), malgré une réduction de la pression artérielle plus faible (152,4 mmHg versus 134,7 mmHg). D’autres travaux doivent à présent être entrepris afin d’évaluer si l’induction de l’HO-1 peut constituer une approche thérapeutique d’avenir dans la prévention de la thrombose carotidienne et dans la progression de l’IRC. / No summary available.

Le monoxyde de carbone (CO) est un gaz diffusible dont la production à l'état physiologique est majoritairement issue de la dégradation de l’hème par l’hème oxygénase (HO). Le CO endogène a des propriétés vasorelaxantes comparables à celles du monoxyde d’azote. L’effet du CO a été étudié dans des modèles d’ischémie coronarienne, d’insuffisance rénale aigue et d’hypertension artérielle : des propriétés anti-agrégantes, anti-prolifératives, anti-inflammatoires et anti-apoptotiques ont été mises en évidence. Ces propriétés suggèrent que le CO pourrait aussi jouer un rôle dans la prévention de la thrombose vasculaire, et la prévention de la progression de l’insuffisance rénale chronique. Dès lors, les objectifs de cette thèse ont été : 1) d’évaluer les effets in vivo d’un inducteur de l’HO-1, l’hémine, administré en chronique respectivement dans un modèle de thrombose carotidienne et dans un modèle d’insuffisance rénale chronique chez le rat et ; 2) de fournir des éléments susceptibles d’expliquer la mécanistique qui sous-tend les effets liés à l’induction de l’HO-1. Dans le modèle de thrombose artérielle validé chez le rat par notre laboratoire, l’administration chronique d’hémine à la dose de 50 mg/kg a réduit significativement le taux d’occlusion vasculaire par rapport aux animaux non traités (7,2% versus 71%; p<0,01). A l’inverse, les animaux traités par l’hémine recevant parallèlement un inhibiteur de l’HO-1 ont présenté des taux d’occlusion vasculaire comparables à ceux des animaux "contrôles". Ces résultats suggèrent que la réduction du taux d’occlusion artérielle observée, qui ne s’est pas accompagnée de modifications significatives de la pression artérielle, des paramètres sanguins ou de l’hémostase, est directement liée à l'expression vasculaire de l’HO-1. Dans le modèle d’insuffisance rénale chronique par néphrectomie des 5/6 chez le rat, l’administration chronique 2 fois par semaine d’hémine à la dose de 50 mg/kg a diminué significativement, par rapport aux animaux contrôles, la protéinurie (1,0 versus 7,3 g/mmol de créatinine), les index de glomérulosclérose (0,84 versus 2,53) et d’atrophie tubulaire rénale (0,9 versus 2,33), l’expression des protéines impliquées dans la progression de l’insuffisance rénale [(TGF-???0,62 versus 1,0) caspase-3 (0,35 versus 0,71); BMP-4 (0,11 versus 0,32)] et a augmenté significativement l’expression de la protéine BMP-7 néphroprotectrice (1,31 versus 0,38). Par rapport aux animaux recevant un antagoniste des récepteurs AT1 de l'angiotensine II (losartan à la dose de 20 mg/kg), traitement de référence utilisé au cours de l'étude, les effets de l'hémine ont été comparables pour l’expression de TGF-?? (0,62 versus 0,65) voire supérieurs pour son effet sur protéinurie (1 g/mmol de créatinine versus 2,2 g/mmol de créatinine), l’index de glomérulosclérose (0,84 versus 1,68) et d’atrophie tubulaire (0,9 versus 1,66), malgré une réduction de la pression artérielle plus faible (152,4 mmHg versus 134,7 mmHg). D’autres travaux doivent à présent être entrepris afin d’évaluer si l’induction de l’HO-1 peut constituer une approche thérapeutique d’avenir dans la prévention de la thrombose carotidienne et dans la progression de l’IRC. / No summary available.

Les membranes impliquées dans les processus bioénergétiques arborent une très grande densité de protéines, paramètre déterminant pour leur organisation supra-moléculaire. Dans ce travail, nous avons utilisé la bactérie thermophile Geobacillus stearothermophilus comme modèle pour étudier la formation de super-complexes de protéines membranaires, en vue d'une étude structurale. Nous avons purifié et caractérisé un super-complexe comprenant une menaquinol: cytochrome c oxydoréductase (b6c), un cytochrome c550 et une cytochrome c oxydase caa3. En combinant des titrations par spectroscopie optique et résonance paramagnétique électronique, nous avons pu déterminer les potentiels d'oxydo-réduction de la plupart des cofacteurs et combler ainsi une lacune dans l'étude des chaînes de transfert d'électrons utilisant des quinones à bas potentiel redox, les ménaquinones. Nous avons ainsi montré que les potentiels redox des cofacteurs du cytochrome b6c terminés par celui des quinones. Ce travail va à l'encontre de données partielles antérieures publiées, mais est en parfait accord avec les modèles du Q-cycle de Peter Mitchell. Les résultats obtenus ont des répercussions sur les rendements bioénergétiques des différents maillons de la chaîne de transfert. / Bioenergetic membranes present a high protein density - a crucial factor for their organizationinto super-complexes. This project uses the thermophilic bacteria Geobacillus stearothermophilusas a model to study the formation of membrane protein super-complexes with the aim of structuralstudies. We purified and characterized a super-complex between a menaquinone : cytochromec oxidoreductase (b6c), a cytochrome c550, and a cytochrome c oxidase caa3. Using both opticaland EPR spectroscopy methods, we performed the redox titrations of most of the redox cofactorsof the super-complex. Thus, these results enable a new understanding of menaquinone-usingelectron transport chains, showing that quinones’ redox potential determines the redox potentialof the cytochrome b6c’s cofactors. The conclusions differ from previous partial data, althoughthey fit perfectly with Peter Mitchell’s model of the Q-cycle. These unexpected redox potentialsimpact bioenergetic yields at different levels of the electron transfer chain.

Le microbiote intestinal comprend l’ensemble des micro-organismes présents dans le tractus digestif. Cette flore et sa variabilité est unique et spécifique à chaque individu. L’équilibre microbien, état critique pour la santé, se développe progressivement à partir de la naissance. En complément de la fonction connue du microbiote dans la digestion, son rôle est maintenant avéré comme central dans le métabolisme humain. Dans cet écosystème complexe dans lequel cohabitent et interagissent 10¹³ bactéries, les Bacteroides, genre majoritaire au sein du microbiote, prennent en charge les fibres non digestibles de l’alimentation. Ces bactéries, anaérobies à Gram négatif, sont particulièrement bien adaptées à l’environnement intestinal tout particulièrement dans le domaine de la prise en charge des polysaccharides complexes et celui de la résistance à l’oxygène. Etonnamment, bien que l’hème soit un métabolite requis pour la croissance des Bacteroides, ces bactéries sont incapables de le synthétiser. L’hème, constitué d’un atome de fer fixé sur une porphyrie, est un cofacteur impliqué dans de nombreuses réactions enzymatiques essentielles au métabolisme central. Sa réactivité biochimique le rend responsable d’une induction de phénomènes inflammatoire de l’intestin. Nous avons étudié les interactions entre la bactérie Bacteroides thetaiotaomicron et l’hème environnemental. Nous avons d’abord développé un test permettant la détection de quantités d’hème de l’ordre du nanogramme dans des milieux complexes tels que le contenu intestinal. Nous avons ensuite montré que la bactérie commensale E. coli n’est pas la principale source d’hème lors de la colonisation du tractus digestif par Bacteroides dans un modèle de souris axénique et que l’hôte rempli ce rôle. Nous avons mis en place un système permettant de moduler la quantité d’hème présente dans le tractus digestif en piégeant la molécule sur l’hémophore HasA de Serratia marcescens. Nous avons confirmé que le système HasA était actif in vitro. Les résultats préliminaires montrent que d’une part il réduit la quantité d’hème intestinal disponible et d’autre part cela entraine un retard lors de la colonisation du tractus digestif par Bacteroides. Ce travail fournit des outils permettant de mieux comprendre les facteurs influant sur l’implantation des Bacteroides et souligne l’importance de l’hème dans le processus crucial de la primo-colonisation. Mais cela autorise également à plus long terme d’envisager l’utilisation de ce système pour diminuer la quantité d’hème disponible dans l’intestin et donc son effet pro-inflammatoire, dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. / The intestinal microbiota comprises the numerous microorganisms colonizing the digestive tract. This flora, and the variations it undergoes are unique and specific to each individual. The microbial balance, which is a determinant of our state of health, develops gradually from birth. In addition to the known roles of the microbiote in digestion, it is now recognized as an important contributor to human metabolism. Among the 10¹³ bacteria inhabiting the human gut, the genus Bacteroides comprises the dominant genus, and is needed to digest complex dietary polysaccharide fibers. This feature, and the resistance to trace oxygen of these Gram-negative anaerobes make them particularly well adapted to the intestinal environment. Remarkably, although heme is a required metabolite for Bacteroides growth, these bacteria are incapable of heme synthesis. Heme, which comprises an iron atom trapped within a porphyrin ring, is a cofactor involved in numerous enzymatic reactions essential to central metabolism. Its bioactivity may also provoke intestinal inflammatory phenomena. We investigated the interactions between the bacterium Bacteroides thetaiotaomicron and environmental heme. We first developed a test to detect nanogram amounts of heme in complex media such as intestinal contents. We then showed that the commensal bacterium Escherichia coli donates heme to B. thetaiotaomicron in vitro. Nevertheless, we found that E. coli is not the major heme source for Bacteroides colonization, as tested in a germfree mouse model. This study led us to conclude that the host must be the major heme donor. We then set up a system to modulate heme availability in the digestive tract by capturing free heme on a hemophore HasA, from Serratia marcescens. We confirmed the HasA system was active in vitro. Preliminary experiments indicate that it 1- reduces levels of intestinal heme, and 2- delays B. thetaiotaomicron colonization. The present work provides tools for better understanding the factors needed for Bacteroides implantation in the gut and underlines the importance of heme in this crucial process of primocolonization. In the longer term, the bacterial heme-capture system may be considered as a means of decreasing free intestinal pools of heme and thereby its pro-inflammatory effect, in chronic inflammatory bowel diseases.

ChuS est une protéine provenant d'une bactérie pathogène de l'humain qui a la capacité de lier et de dégrader l'hème de l'hôte pour en libérer le fer nécessaire à la croissance bactérienne. Deux résidus potentiellement importants du site actif, l'arginine 100 (R100) et l'acide aspartique 191 (D191) ont été investigués afin de mieux comprendre leur rôle dans la catalyse par ChuS. Nos résultats révèlent que le résidu D191 n'est pas essentiel à l'activité catalytique, mais qu'il est important pour la stabilité du complexe entre l'enzyme et l'un de ses substrats (hème) alors que le résidu R100 est absolument essentiel à l'activité catalytique. Nos études cinétiques et spectroscopiques détaillées fournissent des informations qui permettent de mieux comprendre le mécanisme catalytique de ChuS. Elles aident ainsi à obtenir une meilleure compréhension des voies d'acquisition de l'hème comme source de fer chez les bactéries pathogènes et à définir de nouvelles cibles thérapeutiques.

Le syndrome hémolytique et urémique atypique (SHUa) est une microangiopathie thrombotiquecomplément-dépendante dont l'atteinte majoritairement rénale reste, à ce jour, incomprise.L'objectif de ce travail était d'améliorer la compréhension de ce tropisme d’organe au moyen dedeux axes d'étude : i) la susceptibilité de l'endothélium glomérulaire à l'hémolyse, celle-ci étant à la fois la conséquence des microthromboses dans le SHUa et un amplificateur de la voie alterne du complément via l'hème libre, molécule issue des globules rouges lysés ; ii) le rôle potentiel du récepteur aux produits de glycation avancés ou RAGE. Ce récepteur membranaire aux fortes propriétés pro inflammatoires et pro thrombotiques a en effet été impliqué dans de nombreuses pathologies rénales, et sa liaison au C3a - anaphylatoxine libérée dans l'activation du complément - a été rapportée par une équipe.La première partie de ce travail a visé à expliquer la vulnérabilité de l'endothélium glomérulaire sous l'effet d'une hémolyse. Nous avons étudié plusieurs types de cellules endothéliales exposées +/- à l'hème, et mis au point un modèle murin traité par de l'hème. En conditions hémolytiques, plusieursfacteurs pouvant participer à cette susceptibilité endothéliale glomérulaire ont ainsi été mis en avant: i) une moindre liaison du facteur H, principal régulateur du complément, à sa surface ; ii) une faible expression de la thrombomoduline, protéine de la coagulation et régulatrice du complément ; iii) une faible expression de l'enzyme principale de dégradation de l'hème, l'hème-oxygénase 1. Ces deux derniers points étaient rattachés à une faible induction endothéliale glomérulaire de leurs facteurs de transcription, KFL2 et KLF4.La seconde partie de ce travail s'est concentrée sur le RAGE. N'ayant pas réussi à reproduire l'interaction RAGE/C3a, nous avons exploré l'hypothèse d'une liaison du RAGE à l'hème. En effet, le seul récepteur endothélial connu jusqu'à présent est le Toll Like Receptor 4 (TLR4), qui partage plusieurs ligands communs avec le RAGE (LPS - lipopolysaccharide, HMGB1 - high–mobility group box1). Nous avons découvert que le RAGE était un récepteur de l'hème, et identifié que le site de liaisonse trouvait sur le domaine V. A l'aide d'un modèle murin invalidé pour le RAGE et traité +/- par l'hème, nous avons mis en évidence que : i) l'invalidation de RAGE avait un effet protecteur en cas d’exposition à l'hème, marqué par une diminution de l'expression de gènes de l'inflammation (IL1β,TNFα) et du facteur tissulaire au niveau pulmonaire, organe exprimant le plus fortement RAGE ; ii)l'hème activait la phosphorylation des voies ERK1/2 et Akt via le RAGE.Par ces travaux, nous avons précisé les liens entre activation du complément, hémolyse et susceptibilité endothéliale glomérulaire dans le SHUa. Parallèlement, nous avons identifié le RAGE comme un nouveau récepteur à l'hème, dont la liaison à ce récepteur activerait différentes voies designalisation de l'inflammation. Le contrôle de l'hème et du RAGE pourrait ainsi constituer de nouvelles voies thérapeutiques dans le SHUa et les maladies hémolytiques. / The atypical haemolytic uremic syndrome (aHUS) is a thrombotic microangiopathy of which the predominantly renal damage remains, to date, misunderstood. The aim of this work was to improve the understanding of this organ tropism by two axes of study: i) the susceptibility of the glomerular endothelium to hemolysis, which is the consequence of microthrombosis in aHUS, and also an complement pathway enhancer via free heme, hemoglobin-mediated hemolysis molecule, ii) the potential role of the receptor for advanced glycation end products, RAGE. Indeed, RAGE is described as an endothelial receptor with high proinflammatory and prothrombotic potential, involved in many kidney diseases; a team also reported that it was a receptor for the C3a molecule, anaphylatoxin released in complement activation.The first part of this work aimed to explain the vulnerability of the glomerular endothelium under the effect of hemolysis. We studied several types of endothelial cells exposed +/- to heme, and developed a murine model treated with heme. In hemolytic conditions, several factors that could participate in the endothelial glomerular susceptibility have been put forward: i) less binding of factor H, the main complement regulator, on its surface; ii) low expression of thrombomodulin, coagulation protein and complement regulator; iii) low expression of heme-oxygenase 1, the main heme degradation enzyme. These last two points were related to low induction, on glomerular endothelial cells, of transcription factors, KFL2 and KLF4.The second part of this work focused on RAGE. Having failed to reproduce the RAGE / C3a interaction, we explored the hypothesis of a linkage of RAGE to heme. Indeed, the only known endothelial receptor is Toll Like Receptor 4 (TLR4), which shares several common ligands (LPS - lipopolysaccharide, HMGB1 - high-mobility group box 1). We found that RAGE was a heme receptor, and identified that the binding site was on domain V. Using a mouse model knock out for RAGE and treated +/- with heme, we demonstrated that i) the invalidation of RAGE had a protective effect in case of exposure to heme, marked by a decrease in the expression of genes of inflammation (IL1β; TNFα; and tissue factor) at the pulmonary level, organ expressing most strongly RAGE, ii) the heme is an activator or the phosphorylation of ERK1 / 2 and Akt pathways via RAGE.Through this work, we have clarified the links between complement activation, hemolysis and glomerular endothelial susceptibility in aHUS. At the same time, we have identified RAGE as a new heme receptor, whose RAGE/heme bindind would activate different signaling pathways for inflammation. The control of heme and RAGE could constitute new therapeutic pathways in the aHUS, and hemolytic diseases.

Le système du complément est une cascade de défense immunitaire complexe et étroitement régulée, conduisant à des dommages tissulaires lorsqu’il est suractivé. L’hème, un motif moléculaire de danger dérivant de l’hémolyse, est capable d’activer le complément dans le sérum et à la surface des cellules endothéliales (CE) in vitro, suggérant un rationel pour examiner l’impact de l’activation du complément dans les maladies hémolytiques. L’objectif de ce projet était d’étudier si et comment l’hémolyse intravasculaire active le complément in vivo, et de comprendre les mécanismes sous-jacent conduisant à l’acquisition d’un phénotype activateur du complément par les CE afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous avons détecté des dépôts de complément, de C3 et de C5b-9, dans des reins de patients souffrants de nephropathie drépanocytaire ainsi que dans un modèle murin de drépanocytose. Nous avons mis en place un modèle murin d’hémolyse intravasculaire massive, déclenchée par la phénylhydrazine (PHZ), et caractérisé l’atteinte rénale. Nous avons détecté des dépôts de C3 au niveau des reins de ces souris. Cet effet a été inhibé par l’administration préventive du scavenger naturel de l’hème, l’hémopexine (Hx), et reproduit par des injections d’hème libre, démontrant une activation hème-dépendante in vivo. Les microvésicules d’érythrocytes (MVs) drépanocytaires représentent une source naturelle d’hème, de par leur concentration en hème trois fois supérieure à celle observée chez les donneurs sains. Nous avons démontré que les MVs drépanocytaires activent le complément dans le sérum et sur les CE, de manière en partie hème-dépendante. Ces résultats révèlent le rôle activateur de l’hème sur le complément dans les maladies hémolytiques. De plus, nous avons démontré que l’interaction de l’hème avec TLR4 peut en partie expliquer les dépôts de C3 sur l’endothélium in vivo et les CE in vitro. L’utilisation d’un inhibiteur de TLR4, le TAK-242, a réduit de 50% les dépôts de complément sur les CE, confirmé par une réduction des dépôts sur l’endothélium vasculaire chez des souris TLR4-/- traitées par PHZ ou hème. De plus, nous avons montré que ces dépôts hème/TLR4 dépendants sont liés à l’expression rapide de P-sélectine, qui recrute C3b et C3(H2O) à la membrane des CE, révélé par l’analyse des interactions protéiques en temps réel et l’utilisation d’un anticorps bloquant anti-P-sélectine. Ensemble, ce projet démontre que l’hème et les MVs sont les produits dérivés de l’hémolyse responsables de l’activation du complément. Au niveau cellulaire, l’induction par l’hème d’un phénotype activateur du complément des CE dépend de l’axe TLR4/P-sélectine, induisant des dépôts de C3 à la surface cellulaire. Ainsi, ces études soulignent les bénéfices potentiels de l’Hx et du TAK-242 contre l’activation du complément dans des pathologies associées à une hémolyse. / Complement system is a complex and tightly regulated innate immune defensive cascade, which can promote tissue damage, when overactivated. Hemolysis-derived danger associated molecular pattern heme is able to activate complement in serum and on endothelial cells (EC) in vitro, providing a rational for scrutinizing the impact of complement activation in hemolytic diseases. The objectives of this work were to study whether and how intravascular hemolysis induces complement activation in vivo, and to understand the underlying mechanism that leads to the acquisition of a complement activating phenotype of the endothelium in order to identify novel therapeutic strategies. We found complement deposits, including C3 activation fragments and C5b-9, within kidneys of patients with sickle cell disease (SCD) nephropathy (a prototypical hemolytic disease) as well as in a mouse model of SCD. We set up and characterized the renal injury of a mouse model of massive intravascular hemolysis, triggered by injection of phenylhydrazine (PHZ). We revealed C3 deposition within kidneys of the PHZ-treated animals. It was prevented by heme scavenging with hemopexin (Hx) and reproduced by injections of free heme, thus demonstrating the importance of heme for the complement activation in vivo. SCD erythrocytes microvesicles (MVs), are a pathologically relevant source of labile heme, since they carry three times more heme on their surface compare to MVs from healthy donors. We demonstrated that MVs, generated from SCD erythrocytes, activate complement in human serum and on EC surface, in part on a heme-dependent manner. These data highlight the importance of heme as a complement activator in hemolytic diseases. Further, we found that the C3 activation fragments deposits on endothelium in vivo and on EC in vitro can be in part explained by interaction of heme with TLR4. Indeed, the use of a specific inhibitor of TLR4, TAK-242, reduced about 50% the complement deposits on EC surface and such deposits on vascular endothelium in PHZ- or heme-injected mice were attenuated TLR4-/- mice. Moreover, we found that heme/TLR4-dependent complement deposition was mediated by the rapid expression of P-selectin, which in turn, recruited C3b and C3(H2O) on the EC surface, as evidenced by real time protein interaction analyses and using of blocking antibodies. Together our results demonstrated that heme and erythrocytes MVs are the hemolysis-derived products which promoted complement activation. At cellular level, heme induced complement-activating phenotype of EC by triggering TLR4/P-selectin axis and resulting in C3 activation fragments on cell surface. Together, these studies underline the potential benefits of Hx and TAK-242 against complement activation in pathologies related to hemolysis.