Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

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Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Résumé : La néphropathie diabétique (ND) est la principale cause d’insuffisance rénale de stade terminal en Amérique du Nord. Les podocytes, cellules épithéliales hautement spécialisées du glomérule, supportent et maintiennent les mécanismes de filtration glomérulaire. Des biopsies de reins de patients diabétiques ont montré que le nombre de podocytes est significativement réduit chez les patients avec un diabète récent. Néphrine est une protéine transmembranaire qui a été démontrée comme ayant un rôle majeur dans le maintien de l’intégrité de ces cellules. Une diminution de l’expression de néphrine est observée chez les personnes atteintes de la ND. Des études ont démontré que la phosphorylation en tyrosine de néphrine était impliquée dans la régulation de l’inhibition des voies de l’apoptose et le remodelage du cytosquelette d’actine. Notre laboratoire a publié que l’expression de la tyrosine phosphatase SHP-1 était augmentée dans les podocytes exposés à des concentrations élevées de glucose (HG). Les résidus tyrosines de néphrine sont contenus dans des séquences pouvant être reconnues par SHP-1. Notre hypothèse est que SHP-1 interagit avec néphrine, et que l’augmentation de l’expression de SHP-1 en condition d’hyperglycémie et de diabète viendrait déréguler les voies de signalisation de néphrine, contribuant aux dommages des podocytes dans la maladie. Des coimmunoprécipitations dans des podocytes montrent une interaction entre SHP-1 et néphrine, qui est augmentée en condition HG. Cette augmentation en HG était associée à une baisse des niveaux de phosphorylation de néphrine. La surexpression de la forme inactive de SHP-1 dans les podocyte rétablie les niveaux de phosphorylation de néphrine en condition HG. Dans un modèle de surexpression avec des cellules HEK, la surexpression de SHP-1 diminue les niveaux de phosphorylation des tyrosines 1176/1193 et 1217, qui sont associées au remodelage de l’actine. Des coimmunoprécipitations avec des mutants de néphrine montrent que les tyrosines 1114 et 1138 sont essentielles pour l’interaction de SHP-1 avec néphrine. Dans un modèle murin de diabète de type 1, une diminution de l’expression et de la phosphorylation de néphrine sont observée comparativement aux souris de type sauvage. Ces diminutions sont associées avec une augmentation de l’expression de SHP-1. En conclusion, l’augmentation de l’expression de SHP-1 en condition d’hyperglycémie réduit les niveaux de phosphorylation en tyrosine de néphrine et vient potentiellement inhiber ses voies de signalisation dans le diabète, contribuant à la dysfonction podocytaire et à la néphropathie diabétique. / Abstract : Diabetic nephropathy (DN) is the leading cause of end-stage renal disease in North America. Podocytes are highly specialized epithelial cells involved in the glomerular filtration process. Morphometric observation from kidney biopsies of diabetic patients showed a significant reduction in the number of podocytes in patients with short duration of diabetes before the apparition of microalbuminuria. Nephrin, a transmembrane protein found in the slit diaphragm, has been found to play a key role in the integrity of the podocytes. Clinical observations indicated that nephrin expression was reduced in kidney biopsy of diabetes patients. Recent studies have shown that phosphorylation of tyrosine residues of nephrin participate in intracellular pathways regulating actin dynamics and podocyte survival. Our laboratory has recently published that the expression of the tyrosine phosphatase SHP-1 is elevated in podocytes exposed to high glucose concentrations (HG). Nephrin contains sequences that are known to be potential target for SHP-1. Our hypothesis is that SHP-1 can interact with nephrin, and the increase of SHP-1 expression in diabetic nephropathy deregulates nephrin-mediated pathways, contributing to podocyte’s damage in the disease. Coimmunoprecipitation experiments show an interaction between SHP-1 and nephrin which is increased in podocytes exposed to HG. Overexpression of the inactive form of SHP-1 in podocytes exposed to HG restores nephrin phosphorylation. In HEK cells, overexpression of SHP-1 reduces nephrin phosphorylation specifically on tyrosine 1176/1193 and 1217, which regulates actin dynamics. Coimmunoprecipitation experiments with nephrin mutants show that tyrosine 1114 and 1138 are essentials to the interaction between SHP-1 and nephrin. In a type 1 diabetic murine model, a reduction of the expression and phosphorylation levels of nephrin are observed. Both reductions are associated with an increase in SHP-1 expression. In conclusion, diabetes triggered SHP-1 expression in podocytes which reduces nephrin tyrosine phosphorylation and potentially inhibits nephrin signaling in diabetes, contributing to podocytes dysfunction in diabetic nephropathy.

La néphropathie diabétique (ND) est l'une des complications graves du diabète. Elle affecte environ 30% des patients diabétiques. La microalbuminurie est actuellement l'élément diagnostique principal de la survenue de la ND mais manque de spécificité et précocité. Plusieurs études ont été consacrées à la recherche de nouveaux biomarqueurs (BM) de la ND par des approches protéomiques. Nous avons montré dans la phase initiale de notre travail que si de nombreux candidats BM avaient été identifiés, leur nature ne faisait pas consensus et que de nombreuses études, de par leur conception, ne pouvaient identifier de BM plus précoces que l'albumine. Partant de ce constat, nous avons sélectionné une cohorte originale de diabétiques de type 1 normoalbuminuriques considérés à risque de développer la ND, sur la base de l'apparition d'une microalbuminurie consécutive à un test d'effort. Une cohorte contrôle a été aussi constituée. Dans la première partie de notre travail, nous avons comparé par électrophorèse bidimensionnelle les protéomes urinaires des patients des deux coho rtes. Les BM candidats ont été ensuite identifiés par spectrométrie de masse. L'analyse fonctionnelle de ces protéines a montré que certaines sont impliquées dans la cascade de la coagulation et les mécanismes de dysfonctionnement endothélial. Le caractère diagnostique de ces protéines a été validé dans les mêmes cohortes de patients par des expériences de Western-blot. La compréhension de la nature et de la fonction physiologique des BM candidats identifiés nous a permis de mieux appréhender les mécanismes moléculaires de la pathogénèse de la ND et d'identifier des candidats biomarqueurs plus précoces que l'albumine. Ces résultats sont présentés sous la forme d'un projet d'article .La deuxième partie de notre travail expérimental est constituée d'études préliminaires visant à la recherche de protéines spécifiques urinaires, néphrine et isoformes de l'adiponectine, afin d'évaluer leur potentiel diagnostique. 1 Ben Ameur R. et al Proteomic approaches for discovering biomarkers of diabetic nephropathy. Nephrol Dial Transplant 25, 2866-752 Ben Ameur R. et al Identification of early candidate biomarkers for diabetic nephropathy by urine proteomic analysis. To be submitted / Diabetic nephropathy (DN) is one of the most serious complications of diabetes. It affects about 30% of diabetic patients. Microalbuminuria is currently the main available marker for DN risk, but has inadequate specificity and precocity. Several published studies intended to research new biomarkers (BM) of DN by proteomic approaches. We have shown1 that, if several candidate BM were claimed, there was no consensus about their nature and that a number of studies could not identify BM earlier than albumin because of the study design. Thus, we have selected an original cohort of type 1 diabetic patients considered at risk of developing DN, on the basis of urinary albumin excretion after an exercice test. A control cohort was also enrolled. Using 2D gel electrophoresis we compared the urinary proteomes of patients from both cohorts. Then, candidate BM were identified by mass spectrometry. Functional analysis of these proteins showed that some are involved in the coagulation cascade and in mechanisms of endothelial dysfunction. The diagnostic potential of these proteins was validated by Western blotti ng. The nature and physiological function of candidate biomarkers allowed to better understand the molecular pathogenic mechanisms of DN. Results from this part of the work are shown in the form of an article2. Preliminary studies to assess the diagnostic potential research of specific urinary proteins (nephrin and different isoforms of adiponectin) are also presented.1 Ben Ameur R. et al Proteomic approaches for discovering biomarkers of diabetic nephropathy. Nephrol Dial Transplant 25, 2866-752 Ben Ameur R. et al Identification of early candidate biomarkers for diabetic nephropathy by urine proteomic analysis. To be submitted

La NIgA primaire est la plus fréquente des glomérulonéphrites. Elle représente, selon l’origine géographique et ethnique des populations, 10 à 40% des glomérulonéphrites primitives. Le diagnostic de NIgA est fait nécessairement sur la ponction biopsie rénale (PBR) en immunofluorescence. La grande difficulté dans cette maladie se trouve dans la prédiction au moment du diagnostic par les facteurs pronostiques de l’évolution vers l'insuffisance rénale chronique terminale à 10 et 20 ans après le début de la maladie. L’hypertension artérielle, la protéinurie ≥l g/24 h et la sévérité des lésions histologiques sur la biopsie rénale sont les facteurs de risque majeurs qui permettent la prédiction initiale. Objectifs de l’étude : confirmer et valider dans notre cohorte de NIgA les 3 facteurs de risque (FdR) comme facteurs significatifs et indépendants prédictifs d’une évolution ultérieure vers la Dialyse ou le Décès (avant dialyse) et utiliser ces 3 FdR pour développer un modèle simple de Risque Rénal Absolu (RRA) dont le score évalué au moment du diagnostic permettrait une prédiction du devenir à long terme (10 et 20 ans). Notre cohorte de patients (332) avec NIgA a été recrutée par le Service de Néphrologie, Dialyse, et Transplantation Rénale du CHU de Saint Etienne à l’Hôpital Nord (IGAN-STET-CO). La cohorte est prospective et inclut tous les patients avec diagnostic de Néphropathie à IgA primaire dont la biopsie rénale diagnostique a été réalisée entre le 1er janvier 1990 et le 31 décembre 1999. Le diagnostic histologique de NIgA est défini par la présence de dépôts mésangiaux d’IgA, d’intensité au moins 1+ comme immunoglobuline dominante ou codominante en immunofluorescence. L’intervalle de temps entre le début la maladie et la PBR diagnostique a été de : moyenne (déviation standard, DS) = 5.7 (8.5) ans et médiane (extrêmes) = 2.5 (0.1-46.9) ans. La durée totale d’exposition au risque principal entre le début de NIgA et le dernier recul ou le l’évènement principal était: moyenne (DS) = 12.9 (9.5) ans et médiane (extrêmes) = 11.3 (0.l-56.0) ans; chez 44 patients cette durée d’exposition était supérieure à 20 ans (l3.3%). La progression de la NIgA a été basée sur l’apparition de deux évènements : l’évènement principal (primary end-point) était la dialyse (Di; correspondant à la mort rénale avec un DFG de stade V autour de 8 ml/mn/1.73m2S) ou le décès du patient (De; s’il survenait avant le début de la dialyse), et représenté par Di/De ou plus simplement par D/D; l’évènement secondaire (secondary end-point) était la survenue d’un DFGe<60 ml/mn/1.73m2S marquant le début de l’IRC et correspondant à l’entrée dans le stade III de la maladie rénale chronique (MRC-3+). Les facteurs de risque majeurs étudiés dans cette étude sont l’hypertension artérielle (supérieure à 140/90 mmHg), la protéinurie (≥1g/24 h), et le score optique global (GOS ≥8). Le risque rénal absolu (RRA) de dialyse/décès (D/D) a été calculé à partir de ces trois facteurs simplifiés et dichotomiques après avoir confirmé leur caractère indépendant (les uns des autres) et que leur poids spécifique dans cette prédiction était quantitativement très similaire. 0 pour aucun de ces FdR, 3 pour leur présence simultanée et un score intermédiaire de 1 ou de 2 pour la présence de 1 ou 2 parmi ces 3 facteurs. Ce RRA a été utilisé comme une variable qualitative avec 4 catégories. Nous avons utilisé les courbes de survie sans l’évènement étudié selon Kaplan-Meier (KM) et la méthode de régression de Cox qui permet d’étudier l’influence d’une variable sur la survie sans l’évènement et permet ainsi d’isoler des facteurs pronostiques. Le DFG estimé au moment du diagnostic est de: moyenne(DS) = 74.7 (28.3) et médiane = 80 ml/mn/1.73m2S contre au dernier recul: moyenne (DS) = 68.0 (3 l .3) et médiane = 72.5 avec un P très significatif. La répartition des patients selon le RRA était la suivante: 151 patients (45,5%) avec un score de 0, 69 (20,8%) avec un score de 1,65 (19,6%) avec un score de 2, et 47 patients (14,2%) avec un score de 3. Le taux d'incidence cumulative de D/D, respectivement à 10 ans et 20 ans, a été de 2% (81 à risque) et 4% (15 à risque) pour RRA = 0,2% (38 à risque) et 9% (12 à risque) pour RRA = 1,7% (42 à risque) et 18% (9 à risque) pour RRA = 2, et 29% (27 à risque) et 64% (8 à risque) pour RRA = 3 (test du Logrank global; Chi2 = 62,1; P <0,0001). Les courbes de survie des patients sans D/D, selon Kaplan-Meier ont montré une meilleure survie avec un contrôle effectif de l’HTA. Le taux d'incidence cumulée pour dialyse/décès à 10 et à 20 ans était respectivement, pour le groupe non hypertendu de 4% (84 patients à risque) et 5% (17 patients à risque); pour le groupe des patients avec HTA contrôlée de 1% (54 patients à risque) et 19% (14 patients à risque), et pour le groupe des hypertendus non- contrôlés de 19% (50 patients à risque) et 42% (13 patients à risque) avec une différence significative entre les groupes des non hypertendus et des hypertendus contrôlés avec le groupe des hypertendus non contrôlés (P <0,0001). Pour la protéinurie, les courbes de survie des patients sans D/D, selon Kaplan-Meier, ont montré une amélioration significative (p<0,0001) en cas de réduction effective de la protéinurie. Ainsi, le taux d'incidence cumulée pour dialyse/décès à 10 et 20 ans était de 3% (118 à risque) et 5% (25 à risque) pour le groupe avec protéinurie faible/absente, 2% (40 à risque) et 2% (10 à risque) pour le groupe avec « protéinurie réduite», et 29% (30 à risque) et 67% (9 à risque) pour le groupe avec protéinurie non-réduite. Le contrôle des lésions histologiques graves est difficile à estimer à partir de notre cohorte en l'absence de biopsies répétées. Notre score de Risque Rénal Absolu est basé sur trois facteurs de risque majeurs, indépendants et simplifiés prédictifs de la progression vers la MRC-3+, puis vers la dialyse/décès. Ces FdR avaient finalement un poids identique dans cette prédiction à long terme, comme en témoignent : - une valeur de β/SE comprise entre 4 et 5 dans l’analyse monofactorielle et entre 2 et 3 dans l’analyse multifactorielle de Cox, - ainsi que des paramètres d’exactitude quasi similaires: même valeur prédictive négative autour de 0,95 et même valeur prédictive positive autour de 0,30; de même la probabilité de survenue de dialyse/décès était d'environ 31% en leur présence, mais seulement de 3 à 6% en leur absence. Au moment du diagnostic, 47 patients présentaient les 3 FdR ensemble (RRA = 3) et 28 (60%) sont arrivés en dialyse ou sont décédés. La probabilité de l'évolution à long terme vers la dialyse/décès était de 60% chez les patients avec RRA = 3 contre seulement 6% chez les patients avec RRA =0. Nous sommes les premiers à publier sur le Risque Rénale Absolu de dialyse e/o de décès et de proposer un score global avec une application clinique importante. L'utilisation de ce score RRA, nous permet de prédire à 10 et 20 ans après le début de la maladie, le taux d’incidence cumulative de dialyse/décès en retenant les chiffres arrondis à 20ans de 5% si RRA=0, de 10% si RRA=1, de 20% si RRA= 2, et de 60% si RRA=3, et cela dans une population activement traitée. Notre RRA est très simple à calculer par une simple addition des FdR présents au diagnostic, ne nécessite pas de calcul et s’affranchit des autres facteurs de risque (cliniques, biologiques, pathologiques et génétiques) décrits chez les patients avec NIgA comme le sexe ou l’âge du patient au moment de la biopsie ou l’indice de masse corporelle, IMC . Le point important est que l'utilisation du RRA, permettrait de bien sélectionner les patients à inclure dans des essais randomisés et contrôlés L’autre avantage sera dans les études génétiques de démontrer l'impact d'un génotype / allèle spécifique lié à la progression de la maladie en montrant une augmentation pas à pas de la fréquence du génotype/allèle dans les sous- groupes de RRA= 0 à RRA=3 / For the individual patient with primary IgA nephropathy (IgAN), it remains a challenge to predict accurately the long term outcome at 10 and 20 years after disease onset. We studied it in a prospective cohort of 332 (237 males, 71.4%) biopsy-proven IgAN patients, the IGAN-STET-CO, aged at diagnosis of mean = 41.4 (SD=15.1) years, with a total exposure time of mean = 12.9 (9.5) y. Using three consensual risk factors (RF) simplified as dichotomous covariates : occurrence of hypertension, proteinuria ≥1 g/d, and severe pathological lesions (global optical score ≥8), we calculated an absolute renal risk (ARR) of dialysis/death (D/D), in analogy to the absolute cardiovascular risk. The ultimate prediction according to the number of RF present at diagnosis (ARR score: 0, 1, 2, or 3) was done by the Cox regression and the Kaplan-Meier survival methods. Overall, this ARR scoring permitted significant (P<0.0001) stratification of the risk. The cumulative incidence rate of D/D events (N=45), respectively at 10 and 20y, was 2 and 4% for ARR=0 (45.5% of all cases), 2 and 9% for ARR=1 (20.8%), 7 and 18% for ARR=2 (19.6%), and 29 and 64% for ARR=3 (N=47; 14.1%) in adequately treated patients. Effective control of hypertension and reduction of proteinuria improved survival without D/D when achieved. This absolute renal risk score evaluated at diagnosis, allowed accurate prediction of ultimate dialysis/death risk and was also validated in another cohort. This is a significant progress in the management of the individual patient with lgA nephropathy

L’immunoglobuline A (IgA) est l’immunoglobuline la plus abondamment synthétisée chez les mammifères. Ses propriétés ambivalentes l’impliquent non seulement dans des fonctions de protection contre les agents pathogènes mais aussi dans des phénomènes de tolérance immunitaire vis-à-vis des germes commensaux du microbiote. Toutefois, les IgA peuvent développer des propriétés pathogènes. Dans la première partie de mon travail de thèse, nous avons étudié les effets pathogènes de l’IgA. Les dépôts d’IgA sur le mésangium sont la caractéristique de l’IgAN. La physiopathologie de cette maladie est mal connue. L’hypothèse d’un défaut de glycosylation de l’IgA est souvent retenue ; ce défaut peut être la cause de sa polymérisation et de son antigénicité, il peut aussi favoriser le clivage du récepteur CD89. Nous avons analysé l’effet du défaut d’affinité de la région variable des IgA, de la substitution de la chaîne légère ainsi que de l’association des IgA à leur récepteur, le CD89 sur l’induction des lésions et le dysfonctionnement rénal chez quatre modèles murins différents générés au laboratoire et suivis pendant 12 mois. Nous avons également étudié les propriétés physico-chimiques des IgA de 28 patients ayant une dysglobulinémie et de 28 IgA produites par des hybridomes ; la relation entre ces propriétés et la capacité des IgA à se déposer a été observée. Dans une seconde partie, nous avons étudié l’aspect immunomodulateur et les propriétés antiinflammatoires conférées par l’IgA humaine surexprimée chez un modèle murin de lupus systémique (souris MRL/lpr). Dans la dernière partie du travail, nous avons contribué à la caractérisation d’un modèle de souris transgénique exprimant l’IgA de classe 2 et à l’étude de l’effet de signalisation médiée par cette IgA2 sur le développement des populations lymphocytaires. L’ensemble de ces travaux a montré l’effet pathogène des IgA naturelles ayant une faible affinité sur le développement de la néphropathie à IgA ; ainsi les analyses des IgA des patients et des hybridomes montrent que c’est la stabilité moléculaire de préférence au profil de glycosylation qui joue un rôle crucial dans leur capacité de dépôt. L’expression des IgA humaines chez les souris lupiques a considérablement prolongé leur durée de vie et a ralenti la survenue de l’auto-immunité et de l’atteinte rénale ce qui témoigne du rôle anti-inflammatoire des IgA. L’étude du modèle murin exprimant l’IgA2 humaine a montré que la signalisation via l’IgA2 joue un rôle inhibiteur sur le développement précoce de certaines sous-populations de cellules B. L’ensemble de ces résultats montrent la multitude d’effets de l’IgA lui permettant d’intervenir d’une part dans la pathogenèse d’une maladie complexe (l’IgAN) et d’autre part dans la protection de l’auto-immunité, témoignant de la complexité des interactions mises en jeu et du caractère régulateur de cette immunoglobuline. / Immunoglobulin A (IgA) is the most synthetized immunoglobulin in mammals. IgA has ambivalent properties: it is implicated in the mechanisms of defense against pathogens but also in the immune tolerance of commensal microbiota. However, IgA can develop pathogenic properties. In the first part of my thesis, we studied the pathogenic effects of IgA. IgA deposits are the main characteristic of IgA nephropathy (IgAN). IgAN physiopathology is not yet clearly understood. The hypothesis of a glycosylation defect is strongly adapted. This defect can be due to IgA polymerization or antigenicity. It can also induce shedding of CD89 (IgA Fc receptor) or other factors. We studied the effect of variable region altered affinity, the light chain substitution and the association of IgA with CD89 on the development of kidney lesions and impairment of kidney function in four mouse models followed up during 12 months. In addition, we studied the physico-chemical properties of 28 IgA purified from patients with dysglobulinaemia and 28 chimeric IgA produced by hybridomas. The effect of these properties on the propensity of IgA for mesangial deposition was explored. In the second part, we studied the immunomodulatory and anti-inflammatory properties conferred by the overexpression of human IgA in a mouse model with systemic lupus (MRL/lpr model). In the last part, we contributed to the characterization of a transgenic mouse model producing IgA class 2 and to the study of the effect of IgA2-mediated signaling on B lymphocyte development. Altogether, obtained results show the pathogenic effect of low affinity-IgA on the development of IgA nephropathy. In addition, different analyses showed that molecular stability but not glycosylation profile is the determining factor for IgA deposition. On the other hand, IgA expression in lupus-prone mice extended their survival, delayed the onset of auto-immunity and ameliorated kidney functions in these animals which supports IgA anti-inflammatory properties. The study of IgA2-mediated signaling in the transgenic model showed the inhibitory effect of IgA2 on the early development of several B cell sub-populations. All of these results show the multiple effects of IgA which contribute on one hand to the pathogenesis of a complex disease (IgAN) and on the other hand to protection from autoimmunity, demonstrating the complexity of interactions and the regulatory character of this immunoglobulin.

La néphropathie diabétique (ND), principale cause d’insuffisance rénale chronique, est caractérisée par une dysfonction des podocytes rénaux. Cette dysfonction podocytaire peut être causée par une résistance à l’insuline induite suite à l’exposition des podocytes aux acides gras libres (AGL). L’un des mécanismes par lequel les AGL réduisent les actions de l’insuline serait l’activation de la voie de Mammalian target of rapamycin (mTOR). Les objectifs sont de caractériser les mécanismes de résistance à l’insuline par les AGL dans les podocytes et d’étudier l’implication de la voie du complexe mTORC1 menant à la ND dans un modèle de diabète de type 2. In vivo, la fonction et la pathologie rénale des souris diabétiques de type 2 (db/db) ont été évaluées. Des podocytes murins ont été cultivés pendant 96 h en conditions normales (5,6 mM, NG) ou élevées (25 mM, HG) de glucose avec ou sans palmitate (25 μM) pour les dernières 24 h. In vitro, les podocytes exposés en HG ont montré une diminution de l’activation d’Akt induite par l’insuline. Le palmitate seul a diminué de 50% l’activation d’Akt alors que la combinaison HG + palmitate a accentué cette diminution en la réduisant de 72%. Cette inhibition se ferait via la phosphorylation en sérine d’IRS1. En effet, en présence de palmitate, la phosphorylation d’IRS1 (ser307) est augmentée d’environ 2 fois. De plus, la phosphorylation d’IRS1 par le palmitate est corrélée à une augmentation de la phosphorylation de mTOR (ser2448) et de son substrat S6 (ser240/244). L’inhibition de la voie de signalisation de l’insuline par la voie mTOR serait due à l’activation de la PKC-α suite à une stimulation au palmitate. Pour ce qui est de mTORC2, la phosphorylation inhibitrice de Rictor (thr1135) augmente de 47% en présence de palmitate. In vivo, dans les souris db/db, l’augmentation des marqueurs de la ND (albuminurie, expansion du mésangium, hypertrophie du glomérule et expression de TGF-beta) est associée à une élévation de la p-mTOR, p-Rictor et de p-S6 dans les glomérules rénaux. En conclusion, le phénomène de résistance à l’insuline par les AGL dans les podocytes serait causé par l’activation de PKC-α/mTORC1 menant à la phosphorylation d’IRS1 en sérine 307, un mécanisme complémentaire aux actions de l’hyperglycémie, et contribuant de façon indépendante à la progression de la ND. De plus, l’inhibition du complexe mTORC2 contribue à la diminution de la signalisation de la voie de l’insuline. / Abstract : Diabetic nephropathy (DN) is the leading cause of chronic renal failure in diabetic patients and is characterized by the dysfunction of podocytes. Our laboratory has shown that hyperglycemia caused podocyte insulin unresponsiveness and cell death via the upregulation of PKC- and SHP-1, a tyrosine phosphatase. In contrast, free fatty acids (FFA)-induced insulin resistance in podocytes is not associated with SHP-1 expression. Thus, other signaling pathways could be implicated including the activation of the Mammalian target of rapamycin (mTOR) complexes pathway. The aim of this study was to investigate the insulin resistance mechanisms caused by FFA in podocytes leading to DN in type 2 diabetes. In vitro, cultured podocytes were exposed to normal (5.6 mmol/L; NG) or high glucose (25 mmol/L; HG) levels for 96 h and to palmitate (25 µmol/L) the last 24h with or without insulin stimulation (10 nmol/L). As previously showed, podocytes exposed to HG decreased Akt activation upon insulin stimulation. Palmitate treatment alone reduced insulin-induced Akt phosphorylation by 50% while a combination of palmitate and HG blunted Akt activation by 72%. The inhibition of Akt by palmitate was associated with the increase of PKC- activation leading to mTOR phosphorylation and its substrate S6. Moreover, the mTORC1 complex activation enhanced the serine 307 phosphorylation of IRS1 known to de-activate IRS1. Furthermore, palmitate also mediated the mTORC2 complex inhibition via the Thr1135 phosphorylation of Rictor. In vivo, the implication of mTORC1 complex in DN development was evaluated using 25 weeks old type 2 diabetes mice (db/db). Mice developed increased albuminuria, mesangial cell expansion and glomerular hypertrophy compared to non-diabetic mice, which correlated with the phosphorylation of mTOR, Rictor and S6. In conclusion, elevated FFA levels caused activation of PKC-/mTORC1 pathway and inhibition of mTORC2 leading to insulin resistance in podocytes and DN progression.

En marge d'expériences actuelles visant à développer une méthodologie analytique sur la pharmacocinétique-pharmacodynamique de la N-acétyl-cystéine (NAC) en prévention de la néphropathie liée à l'exposition aux substances de contraste (NESC), une mesure de la clairance des substances de contraste a été mise au point comme marqueur de filtration glomérulaire (FG) étant donné que celles-ci sont totalement éliminées par FG. Ainsi, la mesure de la FG a été déterminée par la clairance de l'iohexol, substance de contraste utilisée en imagerie médicale. L'originalité de ce projet est triple: (1) mesurer la clairance de l'iohexol (Omnipaque) chez des patients recevant également de l'iodixanol (Visipaque), substance de contraste de plus en plus utilisée; (2) explorer la mesure de la clairance d'iodixanol et (3) utiliser la spectrométrie de masse couplée à la chromatographie liquide, qui depuis les dernières années s'est taillée une place de plus en plus importante, pour le dosage de l'iohexol et de l'iodixanol. Le projet actuel s'est déroulé chez 17 sujets avec divers niveaux de fonction rénale devant subir des examens d'imagerie avec des substances de contraste. Une dose-traceur d'iohexol (5 ml) a été co-administrée avec l'iodixanol (environ 95 ml). Des spécimens sanguins ont été obtenus 0, 1, 2, 3, 4, 8 et 24 heures post-imagerie pour mesurer les clairances de l'iohexol et de l'iodixanol. Le comportement des autres marqueurs conventionnels de FG, soit le taux créatinine plasmatique et la clairance de la créatinine, ainsi que la clairance de la cystatine C et la clairance d'iodixanol ont été comparés à la clairance d'iohexol. Par conséquent, un protocole scientifique par HPLC-MSD Tof a été développé afin de séparer et de quantifier les molécules iohexol et iodixanol co-administrées dans le plasma des sujets. Les mesures des taux plasmatiques de ces deux molécules ont permis de déterminer par des calculs pharmacocinétiques que la clairance de l'iohexol discrimine bien la fonction rénale des sujets avec une fonction rénale normale de ceux avec une fonction rénale diminuée. De plus, il a été démontré qu'une seule mesure post-4 heures est suffisante pour diagnostiquer l'état de la fonction rénale d'un patient qui a subi une intervention demandant une exposition aux substances de contraste. Les corrélations entre la clairance de l'iohexol et d'autres marqueurs conventionnels de FG ainsi que celle de l'iodixanol ont illustré que la clairance de la créatinine calculée soit par l'équation MDRD (r = 0,714 et p = 0,001) ou par Cockcroft et Gault (r = 0,518 et p = 0,033) et la clairance de la cystatine C (r = 0,671 et p = 0,003) corrèlaient de manière significative avec l'étalon d'or, soit la clairance de l'iohexol. C'est pourquoi, il pourrait être possible de se fier à la mesure de la clairance de l'iohexol comme meilleur marqueur de FG afin de prévenir, de diagnostiquer et de traiter la NESC. De plus, des expériences scientifiques en recherche fondamentale pourront enfin être menées pour déterminer la relation pharmacodynamique- pharmacocinétique de la N-acétylcystéine dans la prévention de la NESC à l'aide de la mesure de la clairance de l'iohexol comme marqueur fiable de la FG. Enfin, les mécanismes d'action qui interviennent dans la NESC pourront être mieux évalués.

Résumé : La néphropathie diabétique (ND) est une complication microvasculaire du diabète évoluant ultimement en insuffisance rénale et l’hyperglycémie est connue comme étant l’un des facteurs de risques. De larges études cliniques, tel que le DCCT et l’UKPDS, ont montré que si le contrôle intensif de la glycémie se faisait de façon précoce, il serait possible de retarder le développement de la ND. Cependant, les résultats de l'EDIC montrent que si ce contrôle intensif se faisait plus tardivement, suite à une période d’hyperglycémie, il n’empêcherait plus sa progression. Les podocytes ont un rôle critique dans le maintien des fonctions rénales et leur apoptose corrèle de façon très spécifique avec la progression de la ND. Récemment, nous avons rapporté que SHP-1, une protéine tyrosine phosphatase, était augmentée en concentrations élevées de glucose (HG), menant à une inhibition des voies de signalisation de l'insuline. Notre hypothèse est que l’augmentation de l’expression de SHP-1 causée par l’hyperglycémie persiste même après réduction des niveaux de glucose, phénomène de mémoire hyperglycémique, causant une résistance à l'insuline, la mort des podocytes et une absence de réversibilité liée à la progression de ND. Les résultats in vivo montrent que la fonction et la pathologie rénale continuent de progresser et ce en dépit de la normalisation des niveaux de glucose avec implants d’insuline de 5 à 7 mois d’âge La progression de la pathologie corrèle avec le maintien de l’augmentation de l’expression de SHP-1, contribuant au maintien de l’inhibition des voies de l’insuline. En culture, des podocytes murins exposés en HG pendant 96 h et ensuite exposés en condition normale de glucose(NG) pour les dernières 24 h montrent une persistance de l’inhibition des voies de signalisation de l’insuline qui corrèle avec l’augmentation persistante de l’expression et l’activité phosphatase de SHP-1. L’activité des caspases 3/7 dans les podocytes est plus élevée lorsque ceux-ci sont exposés en HG qu’en NG. Le retour en NG pour les dernières 24 h n’a aucun effet bénéfique à réduire l’activité des caspases 3/7. Finalement, l’analyse épigénétique a été suggérée comme étant une explication du phénomène de mémoire hyperglycémique. La monométhylation de la lysine 4 de l’histone 3 (H3K4me1), un marqueur d’activation génique, est augmentée sur le promoteur de SHP-1 en HG et demeure élevée malgré le retour en NG pendant les dernières 24 h. En conclusion, l’hyperglycémie engendre une augmentation persistante de SHP-1 due possiblement à des modifications épigénétiques, causant le maintien de l’inhibition les voies de signalisation de l’insuline même après un retour à des niveaux normaux de glucose, contribuant à la progression de la ND. / Abstract : Diabetic nephropathy (DN) is the leading cause of end-stage renal disease. Renal podocytes apoptosis induced by hyperglycemia is an early event of DN. Clinical studies have shown that intensive blood glucose control reduced the development of DN but is not sufficient, if started late, to prevent its progression, introducing the concept of “hyperglycemic memory”. We have recently published that the tyrosine phosphatase SHP-1 is elevated in renal cortex of type 1 diabetic mice (Akita), contributing to insulin unresponsiveness and DN. We hypothesized that SHP-1 expression remains elevated regardless of systemic blood glucose normalization, and is responsible for hyperglycemic memory in podocytes leading to DN progression. In vivo contribution of SHP-1 in hyperglycemic memory was evaluated using Akita mice treated with insulin implants after 4 months of diabetes. Both urinary albuminuria and glomerular filtration rate were significantly increased in diabetic mice compared to non-diabetic mice and remained elevated despite normalization of blood glucose levels. Renal dysfunction was associated with a persistent increase of SHP-1 expression in renal cortex and inhibition of insulin action that were not normalized following insulin implants. Mouse podocytes were cultured in normal (5.6mM; NG), high glucose concentrations (25mM; HG) for 120 h or HG (96 h) followed by NG for an additional 24 h (HG+NG). We observed that Akt and ERK phosphorylation induced by insulin was inhibited in HG and were not restored despite returning glucose level to 5.6 mM after the HG period. This inhibition was associated with persistent increase of SHP-1 expression and phosphatase activity, leading to insulin signaling pathway inhibition. Moreover, caspase 3/7 activity in podocytes exposed to HG was higher than in podocytes cultured in NG and returning glucose concentrations to normal range for the last 24 h after the 96 h HG exposure had no effect on reducing caspase 3/7 activity. Epigenetic changes were studied to explain the hyperglycemic memory effect. On SHP-1 promoter, H3K4me1 levels, an activation mark, tended to be more elevated in podocytes exposed to HG and were maintained despite returning to NG levels after the HG conditions. In conclusion, hyperglycemia induces persistent and epigenetic changes of SHP-1 causing insulin unresponsiveness in the podocytes contributing to DN progression.