Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les microARNs sont reconnus comme des régulateurs essentiels de l'expression des protéines. Des anomalies dans leur fonction sont associées au développement de nombreuses pathologies.tiel des microARNs en tant que biomarqueurs ou cibles thérapeutiques dans une grande variété de pathologies. Dans le cadre de cette thèse, nous avons étudié :1) L'association des microARNs urinaires avec l'évolution de la maladie rénale chronique (MRC) chez l'adulte. La prévalence de la MRC est actuellement estimée à 5-10% de la population et est en constante augmentation. La détection précoce et l'identification de patients ayant une MRC progressant rapidement vers l'insuffisance rénale sont la clé pour une meilleure prise en charge de ces patients. Actuellement les outils non-invasifs comme l'albuminurie ou l'estimation du débit de filtration glomérulaire manquent de précision. Dans notre travail, nous avons tenté d'identifier les modifications urinaires des microRNAs afin d'identifier de nouveaux biomarqueurs non-invasifs associés à la progression de la MRC. Nous avons analysé les modifications des microARNs urinaires par séquençage à haut débit dans des échantillons d'urine de 70 patients atteints de MRC et corrélé leurs profils d'expression à la progression de la maladie. Cela a amené à l'identification de 25 microARNs urinaires (pvalue ajustée <0.05) potentiellement associés à la progression de la MRC. Parmi ceux-là, quatre microARNs (hsa-miR-34c-5p, hsa-miR-410-3p, hsa-miR-301b-3p, and hsa-miR-145-5p) ont été sélectionnés pour être validés dans une cohorte indépendante de 52 patients atteints de MRC. L'augmentation de l'abondance urinaire de hsa-miR-145-5p a été confirmée comme étant associée à la progression de la MRC. Des analyses in vitro de l'effet de l'inhibition de hsa-miR-145-5p dans les cellules rénales ont mis en évidence que ce microARN semblait être impliqué dans le processus de nécrose. En conclusion, cette étude nous a permis d'identifier hsa-miR-145-5p comme Ainsi, de nombreuses études s'intéressent au potenmarqueur potentiel de la progression de la MRC. 2) La présence de microARNs urinaires associés à la néphropathie obstructive, une maladie fréquemment rencontrée chez les enfants qui peut conduire, dans les cas graves, à l'insuffisance rénale précoce. Dans cette étude, nous avons utilisé la biologie des systèmes et avons combiné des données microARN et ARNm de néphropathie obstructive humaine et animale pour obtenir des informations sur les mécanismes possibles impliqués dans cette maladie. En particulier, nous avons étudié simultanément le miRNome urinaire de nourrissons présentant une obstruction de la jonction pyélo-urétérale et le miRNome et le transcriptome tissulaire rénal chez la souris dans le modèle animal d'obstruction urétérale unilatéral (OUU) partiel et néonatal. Plusieurs centaines de microARNs et d'ARNms étant modifiés, la combinaison des microARNs des deux espèces avec les ARNms cibles associés a permis de sélectionner les 5 microARNs et 35 ARNms les plus fortement associés à la néphropathie obstructive. Une validation in vitro et in vivo a mis en avant que let-7a-5p et miR-29-3p ainsi que deux nouvelles cibles potentielles, l'E3 ubiquitin-protein ligase (DTX4) et neuron navigator 1 (NAV1) étaient dérégulées au cours de cette pathologie. Cette étude est la première à corréler le modèle animal d'OUU partiel et néonatal avec l'obstruction pyélo-urétérale chez l'Homme dans une analyse intégrée de biologie des systèmes. Nos résultats ont révélé let-7a et miR-29b en tant que molécules potentiellement impliquées dans le développement de la fibrose dans la néphropathie obstructive via le contrôle de DTX4 chez l'homme et la souris, ce qui n'aurait pas été identifiable autrement. / MicroRNAs are now recognized as key players in the regulation of proteins and any abnormality in their function is a cause for pathway instability, leading to pathological conditions. Numerous reports from a variety of pathologies provide new data about microRNAs function, their targets and their potential as biomarkers and possible ways to control microRNAs' expression for potential therapeutic purpose. A number of reports also connect microRNAs with pathological conditions in the kidney and point to the use of microRNAs as biomarkers for diagnosis and prognosis of kidney disease in blood, serum, tissue and urine samples. In this thesis, we researched:1) A possible role of the microRNAs in the progression of adult chronic kidney disease (CKD), a disease representing a global burden with the tendency to rise worldwide. Progression of CKD is still very hard to detect non-invasively with the currently used clinical tools (eGFR and albuminuria). In our work we studied alterations of the level of the microRNAs in human urine samples of patients with fast or slow progression of CKD, in order to identify new potential biomarkers for non-invasive progression of CKD. Using Next Generation Sequencing, we analyzed urinary microRNA modifications in urine samples of 70 patients with established CKD and correlated their expression profiles to disease progression. This lead to the identification of 25 urinary microRNAs significantly associated to CKD progression (adjusted pvalue<0.05). Among those, four microRNAs (hsa-miR-34c-5p, hsa-miR-410-3p, hsa-miR-301b-3p, and hsa-miR-145-5p) were selected for validation in an independent cohort of 52 patients with CKD. Increased urinary abundance of hsa-miR-145-5p was confirmed to be associated to progression of CKD. In vitro exploration of the effects of hsa-miR-145-5p inhibition in human kidney cells showed that the microRNA seemed to be involved in necrotic processes. In conclusion we have identified hsa-miR-145-5p as potential urinary microRNA marker of CKD progression. 2) The identification of microRNAs associated to obstructive nephropathy, a frequently encountered disease in children that can lead, in severe cases, to end stage renal disease (ESRD). In this study we used a comprehensive system biology analysis in which we combined micro- and mRNA data from human and animal obstructive nephropathy to obtain information on possible mechanisms involved in this disease. In particular, we have studied in parallel the urinary miRNome of infants with ureteropelvic junction (UPJ) obstruction and the kidney tissue miRNome and transcriptome of the corresponding neonatal partial unilateral ureteral obstruction (UUO) mouse model. Several hundreds of microRNAs and mRNAs displayed changed abundance during disease. Combination of microRNAs in both species and associated mRNAs let to the prioritization of 5 microRNAs and 35 mRNAs associated to disease. In vitro and in vivo validation identified consistent dysregulation of let-7a-5p and miR-29-3p and new potential targets, E3 ubiquitin-protein ligase (DTX4) and neuron navigator 1 (NAV1). Our study is the first to correlate a mouse model of neonatal partial UUO with human UPJ obstruction in a comprehensive systems biology analysis. Our data revealed let-7a and miR-29b as molecules potentially involved in the development of fibrosis in UPJ obstruction via the control of DTX4 in both man and mice that would not be identified otherwise.

Le système du complément est une cascade de défense immunitaire complexe et étroitement régulée, conduisant à des dommages tissulaires lorsqu’il est suractivé. L’hème, un motif moléculaire de danger dérivant de l’hémolyse, est capable d’activer le complément dans le sérum et à la surface des cellules endothéliales (CE) in vitro, suggérant un rationel pour examiner l’impact de l’activation du complément dans les maladies hémolytiques. L’objectif de ce projet était d’étudier si et comment l’hémolyse intravasculaire active le complément in vivo, et de comprendre les mécanismes sous-jacent conduisant à l’acquisition d’un phénotype activateur du complément par les CE afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous avons détecté des dépôts de complément, de C3 et de C5b-9, dans des reins de patients souffrants de nephropathie drépanocytaire ainsi que dans un modèle murin de drépanocytose. Nous avons mis en place un modèle murin d’hémolyse intravasculaire massive, déclenchée par la phénylhydrazine (PHZ), et caractérisé l’atteinte rénale. Nous avons détecté des dépôts de C3 au niveau des reins de ces souris. Cet effet a été inhibé par l’administration préventive du scavenger naturel de l’hème, l’hémopexine (Hx), et reproduit par des injections d’hème libre, démontrant une activation hème-dépendante in vivo. Les microvésicules d’érythrocytes (MVs) drépanocytaires représentent une source naturelle d’hème, de par leur concentration en hème trois fois supérieure à celle observée chez les donneurs sains. Nous avons démontré que les MVs drépanocytaires activent le complément dans le sérum et sur les CE, de manière en partie hème-dépendante. Ces résultats révèlent le rôle activateur de l’hème sur le complément dans les maladies hémolytiques. De plus, nous avons démontré que l’interaction de l’hème avec TLR4 peut en partie expliquer les dépôts de C3 sur l’endothélium in vivo et les CE in vitro. L’utilisation d’un inhibiteur de TLR4, le TAK-242, a réduit de 50% les dépôts de complément sur les CE, confirmé par une réduction des dépôts sur l’endothélium vasculaire chez des souris TLR4-/- traitées par PHZ ou hème. De plus, nous avons montré que ces dépôts hème/TLR4 dépendants sont liés à l’expression rapide de P-sélectine, qui recrute C3b et C3(H2O) à la membrane des CE, révélé par l’analyse des interactions protéiques en temps réel et l’utilisation d’un anticorps bloquant anti-P-sélectine. Ensemble, ce projet démontre que l’hème et les MVs sont les produits dérivés de l’hémolyse responsables de l’activation du complément. Au niveau cellulaire, l’induction par l’hème d’un phénotype activateur du complément des CE dépend de l’axe TLR4/P-sélectine, induisant des dépôts de C3 à la surface cellulaire. Ainsi, ces études soulignent les bénéfices potentiels de l’Hx et du TAK-242 contre l’activation du complément dans des pathologies associées à une hémolyse. / Complement system is a complex and tightly regulated innate immune defensive cascade, which can promote tissue damage, when overactivated. Hemolysis-derived danger associated molecular pattern heme is able to activate complement in serum and on endothelial cells (EC) in vitro, providing a rational for scrutinizing the impact of complement activation in hemolytic diseases. The objectives of this work were to study whether and how intravascular hemolysis induces complement activation in vivo, and to understand the underlying mechanism that leads to the acquisition of a complement activating phenotype of the endothelium in order to identify novel therapeutic strategies. We found complement deposits, including C3 activation fragments and C5b-9, within kidneys of patients with sickle cell disease (SCD) nephropathy (a prototypical hemolytic disease) as well as in a mouse model of SCD. We set up and characterized the renal injury of a mouse model of massive intravascular hemolysis, triggered by injection of phenylhydrazine (PHZ). We revealed C3 deposition within kidneys of the PHZ-treated animals. It was prevented by heme scavenging with hemopexin (Hx) and reproduced by injections of free heme, thus demonstrating the importance of heme for the complement activation in vivo. SCD erythrocytes microvesicles (MVs), are a pathologically relevant source of labile heme, since they carry three times more heme on their surface compare to MVs from healthy donors. We demonstrated that MVs, generated from SCD erythrocytes, activate complement in human serum and on EC surface, in part on a heme-dependent manner. These data highlight the importance of heme as a complement activator in hemolytic diseases. Further, we found that the C3 activation fragments deposits on endothelium in vivo and on EC in vitro can be in part explained by interaction of heme with TLR4. Indeed, the use of a specific inhibitor of TLR4, TAK-242, reduced about 50% the complement deposits on EC surface and such deposits on vascular endothelium in PHZ- or heme-injected mice were attenuated TLR4-/- mice. Moreover, we found that heme/TLR4-dependent complement deposition was mediated by the rapid expression of P-selectin, which in turn, recruited C3b and C3(H2O) on the EC surface, as evidenced by real time protein interaction analyses and using of blocking antibodies. Together our results demonstrated that heme and erythrocytes MVs are the hemolysis-derived products which promoted complement activation. At cellular level, heme induced complement-activating phenotype of EC by triggering TLR4/P-selectin axis and resulting in C3 activation fragments on cell surface. Together, these studies underline the potential benefits of Hx and TAK-242 against complement activation in pathologies related to hemolysis.

La NIgA primaire est la plus fréquente des glomérulonéphrites. Elle représente, selon l'origine géographique et ethnique des populations, 10 à 40% des glomérulonéphrites primitives. Le diagnostic de NIgA est fait nécessairement sur la ponction biopsie rénale (PBR) en immunofluorescence. La grande difficulté dans cette maladie se trouve dans la prédiction au moment du diagnostic par les facteurs pronostiques de l'évolution vers l'insuffisance rénale chronique terminale à 10 et 20 ans après le début de la maladie. L'hypertension artérielle, la protéinurie ≥l g/24 h et la sévérité des lésions histologiques sur la biopsie rénale sont les facteurs de risque majeurs qui permettent la prédiction initiale. Objectifs de l'étude : confirmer et valider dans notre cohorte de NIgA les 3 facteurs de risque (FdR) comme facteurs significatifs et indépendants prédictifs d'une évolution ultérieure vers la Dialyse ou le Décès (avant dialyse) et utiliser ces 3 FdR pour développer un modèle simple de Risque Rénal Absolu (RRA) dont le score évalué au moment du diagnostic permettrait une prédiction du devenir à long terme (10 et 20 ans). Notre cohorte de patients (332) avec NIgA a été recrutée par le Service de Néphrologie, Dialyse, et Transplantation Rénale du CHU de Saint Etienne à l'Hôpital Nord (IGAN-STET-CO). La cohorte est prospective et inclut tous les patients avec diagnostic de Néphropathie à IgA primaire dont la biopsie rénale diagnostique a été réalisée entre le 1er janvier 1990 et le 31 décembre 1999. Le diagnostic histologique de NIgA est défini par la présence de dépôts mésangiaux d'IgA, d'intensité au moins 1+ comme immunoglobuline dominante ou codominante en immunofluorescence. L'intervalle de temps entre le début la maladie et la PBR diagnostique a été de : moyenne (déviation standard, DS) = 5.7 (8.5) ans et médiane (extrêmes) = 2.5 (0.1-46.9) ans. La durée totale d'exposition au risque principal entre le début de NIgA et le dernier recul ou le l'évènement principal était: moyenne (DS) = 12.9 (9.5) ans et médiane (extrêmes) = 11.3 (0.l-56.0) ans; chez 44 patients cette durée d'exposition était supérieure à 20 ans (l3.3%). La progression de la NIgA a été basée sur l'apparition de deux évènements : l'évènement principal (primary end-point) était la dialyse (Di; correspondant à la mort rénale avec un DFG de stade V autour de 8 ml/mn/1.73m2S) ou le décès du patient (De; s'il survenait avant le début de la dialyse), et représenté par Di/De ou plus simplement par D/D; l'évènement secondaire (secondary end-point) était la survenue d'un DFGe<60 ml/mn/1.73m2S marquant le début de l'IRC et correspondant à l'entrée dans le stade III de la maladie rénale chronique (MRC-3+). Les facteurs de risque majeurs étudiés dans cette étude sont l'hypertension artérielle (supérieure à 140/90 mmHg), la protéinurie (≥1g/24 h), et le score optique global (GOS ≥8). Le risque rénal absolu (RRA) de dialyse/décès (D/D) a été calculé à partir de ces trois facteurs simplifiés et dichotomiques après avoir confirmé leur caractère indépendant (les uns des autres) et que leur poids spécifique dans cette prédiction était quantitativement très similaire. 0 pour aucun de ces FdR, 3 pour leur présence simultanée et un score intermédiaire de 1 ou de 2 pour la présence de 1 ou 2 parmi ces 3 facteurs. Ce RRA a été utilisé comme une variable qualitative avec 4 catégories. Nous avons utilisé les courbes de survie sans l'évènement étudié selon Kaplan-Meier (KM) et la méthode de régression de Cox qui permet d'étudier l'influence d'une variable sur la survie sans l'évènement et permet ainsi d'isoler des facteurs pronostiques. Le DFG estimé au moment du diagnostic est de: moyenne(DS) = 74.7 (28.3) et médiane = 80 ml/mn/1.73m2S contre au dernier recul: moyenne (DS) = 68.0 (3 l .3) et médiane = 72.5 avec un P très significatif. La répartition des patients selon le RRA était la suivante: 151 patients (45,5%) avec un score de 0, 69 (20,8%) avec un score de 1,65 (19,6%) avec un score de 2, et 47 patients (14,2%) avec un score de 3. Le taux d'incidence cumulative de D/D, respectivement à 10 ans et 20 ans, a été de 2% (81 à risque) et 4% (15 à risque) pour RRA = 0,2% (38 à risque) et 9% (12 à risque) pour RRA = 1,7% (42 à risque) et 18% (9 à risque) pour RRA = 2, et 29% (27 à risque) et 64% (8 à risque) pour RRA = 3 (test du Logrank global; Chi2 = 62,1; P <0,0001). Les courbes de survie des patients sans D/D, selon Kaplan-Meier ont montré une meilleure survie avec un contrôle effectif de l'HTA. Le taux d'incidence cumulée pour dialyse/décès à 10 et à 20 ans était respectivement, pour le groupe non hypertendu de 4% (84 patients à risque) et 5% (17 patients à risque); pour le groupe des patients avec HTA contrôlée de 1% (54 patients à risque) et 19% (14 patients à risque), et pour le groupe des hypertendus non- contrôlés de 19% (50 patients à risque) et 42% (13 patients à risque) avec une différence significative entre les groupes des non hypertendus et des hypertendus contrôlés avec le groupe des hypertendus non contrôlés (P <0,0001). Pour la protéinurie, les courbes de survie des patients sans D/D, selon Kaplan-Meier, ont montré une amélioration significative (p<0,0001) en cas de réduction effective de la protéinurie. Ainsi, le taux d'incidence cumulée pour dialyse/décès à 10 et 20 ans était de 3% (118 à risque) et 5% (25 à risque) pour le groupe avec protéinurie faible/absente, 2% (40 à risque) et 2% (10 à risque) pour le groupe avec " protéinurie réduite", et 29% (30 à risque) et 67% (9 à risque) pour le groupe avec protéinurie non-réduite. Le contrôle des lésions histologiques graves est difficile à estimer à partir de notre cohorte en l'absence de biopsies répétées. Notre score de Risque Rénal Absolu est basé sur trois facteurs de risque majeurs, indépendants et simplifiés prédictifs de la progression vers la MRC-3+, puis vers la dialyse/décès. Ces FdR avaient finalement un poids identique dans cette prédiction à long terme, comme en témoignent : - une valeur de β/SE comprise entre 4 et 5 dans l'analyse monofactorielle et entre 2 et 3 dans l'analyse multifactorielle de Cox, - ainsi que des paramètres d'exactitude quasi similaires: même valeur prédictive négative autour de 0,95 et même valeur prédictive positive autour de 0,30; de même la probabilité de survenue de dialyse/décès était d'environ 31% en leur présence, mais seulement de 3 à 6% en leur absence. Au moment du diagnostic, 47 patients présentaient les 3 FdR ensemble (RRA = 3) et 28 (60%) sont arrivés en dialyse ou sont décédés. La probabilité de l'évolution à long terme vers la dialyse/décès était de 60% chez les patients avec RRA = 3 contre seulement 6% chez les patients avec RRA =0. Nous sommes les premiers à publier sur le Risque Rénale Absolu de dialyse e/o de décès et de proposer un score global avec une application clinique importante. L'utilisation de ce score RRA, nous permet de prédire à 10 et 20 ans après le début de la maladie, le taux d'incidence cumulative de dialyse/décès en retenant les chiffres arrondis à 20ans de 5% si RRA=0, de 10% si RRA=1, de 20% si RRA= 2, et de 60% si RRA=3, et cela dans une population activement traitée. Notre RRA est très simple à calculer par une simple addition des FdR présents au diagnostic, ne nécessite pas de calcul et s'affranchit des autres facteurs de risque (cliniques, biologiques, pathologiques et génétiques) décrits chez les patients avec NIgA comme le sexe ou l'âge du patient au moment de la biopsie ou l'indice de masse corporelle, IMC . Le point important est que l'utilisation du RRA, permettrait de bien sélectionner les patients à inclure dans des essais randomisés et contrôlés L'autre avantage sera dans les études génétiques de démontrer l'impact d'un génotype / allèle spécifique lié à la progression de la maladie en montrant une augmentation pas à pas de la fréquence du génotype/allèle dans les sous- groupes de RRA= 0 à RRA=3

La T-cadhérine est un récepteur de l'adiponectine, protéine impliquée dans la physiopathologie du diabète. Dans les études d'association pangénomiques, les polymorphismes du gène de la T-cadhérine (CDH13) sont associés aux variations de concentrations d'adiponectine. Le but de notre étude est d'approfondir les relations entre les polymorphismes de CDH13, l'adiponectine circulante, et le risque de diabète et de ses complications. Nous avons sélectionné deux polymorphismes du gène CDH13. Les génotypages ont été effectués dans plusieurs cohortes : D.E.S.I.R., issue de la population générale française, DIABHYCAR, cohorte de sujets atteints du diabète de type 2, et trois cohortes de patients diabétiques de type 1, GENESIS, GENEDIAB et SURGENE. Dans la population générale, les polymorphismes de CDH13 sont associés à l'indice de masse corporelle, à l'HbA1c, au Fatty Liver Index, indice de stéatose hépatique, et aux concentrations plasmatiques d'adiponectine. Dans une étude cas-contrôle entre D.E.S.I.R. et DIABHYCAR, les polymorphismes sont associés au risque de diabète de type 2. Ces associations pourraient être dues aux effets bénéfiques de l'adiponectine. Dans les cohortes de sujets diabétiques de type 1, GENESIS et GENEDIAB, nous avons observé des associations entre les polymorphismes de CDH13, la prévalence et l'incidence de la néphropathie. L'analyse dans l'étude prospective SURGENE confirme ces associations. Le sens des relations observées dans cette étude est en faveur d'un rôle délétère de l'adiponectine dans la néphropathie diabétique. En conclusion, les associations observées pourraient s'expliquer par des variations d'adiponectinémie et suggérer un lien de causalité. / T-cadherin is a receptor of adiponectin, a protein involved in the pathophysiology of diabetes. In genome-wide association studies, T-cadherin gene (CDH13) polymorphisms are associated with adiponectin concentrations. The aim of our study was to deepen the relationship between polymorphisms of CDH13, plasma adiponectin, and the risk of diabetes and its complications. We selected two polymorphisms in CDH13. Genotyping was performed in D.E.S.I.R., cohort drawn from the French general population, DIABHYCAR (subjects with type 2 diabetes) and three cohorts of patients with type 1 diabetes, GENESIS, GENEDIAB and SURGENE. In the general population, CDH13 polymorphisms were associated with body mass index, HbA1c, Fatty Liver Index, an index of hepatic steatosis, and plasma adiponectin. In a case-control study between D.E.S.I.R. and DIABHYCAR, polymorphisms were associated with the risk of type 2 diabetes. These associations with clinical phenotypes could be due to the beneficial effects of adiponectin. In subjects with type 1 diabetes from GENESIS and GENEDIAB, we observed associations between polymorphisms of CDH13 and the prevalence and the incidence of kidney disease. The analysis in the SURGENE prospective study confirmed these associations. The direction of the relationships observed in this study is in favor of a deleterious role of adiponectin in diabetic nephropathy. In conclusion, these associations may be explained by variations in adiponectin and suggest a causal relationship.

Toute maladie rénale chronique (MRC) se caractérise par le développement de lésions de fibrose rénale et d’une perte de fonction qui peut, à terme conduire vers l’insuffisance rénale chronique terminale. miR-21-5p est un microARN ubiquitaire impliqué dans le processus de fibrose, notamment rénale. Toutefois, des données expérimentales contradictoires suggèrent que miR-21-5p joue un rôle ambivalent dans la constitution des lésions rénales de fibrose.L’objectif de ce travail est de préciser l’implication de miR-21 au cours des lésions rénales aigües, en s’appuyant sur un modèle murin de toxicité rénale du cisplatine, ou chroniques chez l’homme au cours de la néphropahtie à dépôts mésangiaux d’IgA (maladie de Berger).Dans un premier travail, une cohorte rétrospective de patients porteurs d’une néphropathie à dépôts mésangiaux d’IgA a été caractérisée de façon systématique sur le plan clinico-biologique et anatomo-pathologique (classification d’Oxford). L’expression rénale de trois fibromiR (miR-21-5p, miR-199a-5p et miR-214-3p) est associée aux lésions de fibrose rénale (p ≤ 0,02). Parmi ces microARN, miR-21-5p semble le plus pertinent car il présente des amplitudes de variation d’expression plus importantes selon le niveau de fibrose, il est également associé aux lésions de sclérose glomérulaire (p = 0,001) et son niveau d’expression tissulaire rénale est associée à une moins bonne survie rénale.Un second travail a été mené en utilisant un modèle murin d’insuffisance rénale aiguë secondaire à l’injection intra-péritonéale de cisplatine chez des animaux invalidé pour miR-21a-5p. Deux schémas d’injections ont été réalisés afin explorer le rôle de miR-21a-5p au cours de lésions rénales aiguës (injection d’une dose unique de 10mg/kg de cisplatine) ou subaiguës (injections répétées de 7 mg/kg de cisplatine). Les souris ayant reçu une injection unique de cisplatine ne présentent pas de différence significative d’urée sanguine, de marqueurs de souffrance rénale (NGAL, KIM-1), d’inflammation (TNF-α, IL-6) et de stress oxydant (HO-1, NRF2), ni d’activité apoptotique selon leur statut sauvage ou invalidé pour miR-21a-5p. Le modèle d’injections répétées de cisplatine a, quant à lui, permis de mettre en évidence des lésions plus importantes chez les souris miR-21-/-. En effet, les souris miR-21-/- cisplatine présentent une urée sanguine plus élevée (1,92 g/l ±, 0,72 versus 0,66 g/l ± 0,15 p = 0,014) et une expression rénale de NGAL plus importante (RQ = 118,1 ± 44,8 versus RQ = 45,4 ± 37,7, p= 0,018) que le souris sauvages cisplatine. Enfin les lésions rénales de nécrose tubulaire aiguë observées sont plus sévères chez les souris miR-21-/-.Ainsi ces résultats montrent qu’une forte expression rénale de miR-21-5p est associée à la fibrose et au pronostic rénal chez des patients porteurs d’une néphropathie à dépôts mésangiaux d’IgA. Dans notre modèle expérimental, les souris déficientes pour miR-21a-5p présentent une sensibilité variable au développement de lésions rénales induites par le cisplatine en fonction du type d’administration, aigu ou subaigu. Ces résultats confirment que miR-21-5p joue un rôle ambivalent au cours des lésions rénales, protecteur à la phase précoce d’une agression rénale aiguë et délétère lorsque le processus se prolonge dans le temps. miR-21-5p est présent dans les fluides biologiques, et constitue ainsi un candidat potentiel en tant que biomarqueur de la fibrose rénale. De plus, miR-21-5p constitue une cible thérapeutique innovante, ayant montré son efficacité dans différents modèles murins de fibrose rénale. / Independently of the cause, active CKD leads to the development of fibrotic lesions, responsible for a loss of renal function and ultimately, end-stage renal failure. MiR-21-5p is a ubiquitous microRNA involved in the process of fibrosis, especially renal fibrosis. However, contradictory experimental data suggest that miR-21-5p plays an ambivalent role in the regulation of renal fibrosis.The aim of this work was to investigate the involvement of miR-21 in chronic renal lesions based on human renal samples and in acute lesions by using a murine model of renal toxicity induced by cisplatin.In a first part of the work, a retrospective cohort of patients with IgA nephropathy has been systematically characterized clinically, biologically and pathologically (according to Oxford classification). The renal expression of three FibromiRs (miR-21-5p, miR-199a-5p and miR-214-3p) is associated with renal fibrosis lesions (p ≤ 0.02). Among these microRNAs, miR-21 appears to be the most relevant as it displayed larger amplitudes of variation, it was also associated with glomerular sclerosis (p = 0.001) and its strong expression was associated with lower renal survival.A second part of the work was carried out on a murine model of acute renal failure secondary to the intraperitoneal injection of cisplatin. Two injections schemes were established to investigate the role of miR-21-5p in acute renal lesions (injection of a single dose of 10 mg/kg cisplatin) or subacute (repeated injections of 7 mg/kg cisplatin). After a single injection of cisplatin, no significant difference in blood urea, renal (NGAL, KIM-1), inflammation (TNF-α, IL-6) and oxidative stress (HO-1, NRF2) nor apoptotic activity was observed in miR21-/- mice compared to wild-type mice. In a model of repeated injections of cisplatin, we observed more renal lesions in miR-21-/- mice. Indeed, miR-21-/- mice treated with cisplatin exhibited higher blood urea (1.92 g / l ±, 0.72 versus 0.66 g / l ± 0.15 p = 0.014) and an increased renal expression of NGAL (RQ = 118.1 ± 44.8 versus RQ = 45.4 ± 37.7, p = 0.018) compared to wild-type mice.Thus, these results demonstrate that an increased renal expression of miR-21-5p is associated with fibrosis and renal prognosis in patients with IgA nephropathy. In an experimental model, of cisplatin-induced renal injury, mice deficient for miR-21a-5p exhibit a higher sensitivity when cisplatin was administered several times. These results confirm that miR-21-5p plays an ambivalent role in renal lesions and seems to be protective at an early stage, or deleterious when the process is prolonged over time. As miR-21-5p is present in biological fluids, it might be an efficient biomarker of renal fibrosis. Moreover, miR-21-5p is an innovative therapeutic target validated in several murine models of renal fibrosis.

Suite à des observations cliniques minutieuses réalisées, en particulier, dans le service de Néphrologie de l’hôpital Érasme à Bruxelles, la néphrotoxicité et l’oncogénicité des acides aristolochiques contenus dans les plantes médicinales utilisées en médecine traditionnelle chinoise ont été démontrées. La néphrotoxicité se traduisait par une néphrite interstitielle fibrosante chronique conduisant à l’insuffisance rénale terminale. Ces constatations ont amené à développer, au laboratoire de Néphrologie Expérimentale de la Faculté de la Médecine de l’ULB, un modèle expérimental de la fibrose rénale interstitielle chez le rat, par l’injection sous-cutanée des acides aristolochiques. L’objet du présent travail est d’utiliser ce modèle pour caractériser l’atteinte tubulo-interstitielle et identifier les mécanismes qui vont de l’intoxication de la cellule tubulaire à la fibrose interstitielle chronique. Nous avons ainsi particulièrement étudié :la nécrose et l’apoptose des cellules épithéliales tubulaires, la transition épithélio-mésenchymale des cellules épithéliales tubulaires proximales, l’atrophie tubulaire, le rôle de l’infiltrat inflammatoire interstitiel et des cytokines pro-inflammatoires et pro-fibrosantes. L’introduction inscrira d’abord notre travail dans le cadre général de l’insuffisance rénale chronique et soulignera, dans ce domaine, l’importance du secteur tubulo-interstitiel, pour ensuite retracer l’histoire de la néphropathie aux acides aristolochiques. Nos matériels, méthodes et résultats sont fournis par des copies de trois publications. Ces résultats sont ensuite transversalement discutés, mécanisme par mécanisme. La discussion met l’accent sur l’apport spécifique de nos travaux concernant chacun des mécanismes étudiés. Nous terminerons par l’évocation de quelques perspectives que ce travail est susceptible d’ouvrir. RESUMÉLa néphropathie aux acides aristolochiques (NAA), initialement appelée néphropathie aux herbes chinoises, se caractérise par une progression rapide de l’insuffisance rénale chronique vers le stade terminal. Cette évolution a été attribuée aux lésions tubulo-interstitielles caractéristiques :fibrose interstitielle pauci-cellulaire et atrophie tubulaire sévères. Cependant, les mécanismes impliqués dans l’évolution péjorative de la NAA n’ont pas été élucidés. Divers paramètres biologiques et histologiques ont donc été explorés au cours de la NAA dans le modèle expérimental développé chez le rat Wistar mâle. Le protocole expérimental a consisté à administrer à deux groupes de rats Wistar mâles âgés de 4 semaines des injections sous-cutanées quotidiennes de 10 mg/kg d'AA (rats AA) ou d’un volume correspondant du solvant (témoins) pendant 35 jours. A l’opposé des témoins (structure et fonction rénales normales), une phase d’insuffisance rénale aiguë et transitoire, secondaire à une nécrose tubulaire a été démontrée chez les rats intoxiqués par les AA aux jours 4 et 5. Un infiltrat de cellules mononucléées a été observé dès le 3ème jour jusqu’au jour 35. A partir du jour 10, une atrophie tubulaire et une fibrose interstitielle progressive ont été objectivées. Chez les rats exposés aux AA, la perte du phénotype épithélial par les cellules épithéliales tubulaires proximales (CETP) (disparition de l’expression baso-latérale de la N-cadhérine) a été observée dès le jour 2, en parallèle à l’acquisition du phénotype mésenchymateux (expression de la vimentine). Aucune migration de CETP « dédifférenciées » vers l’interstitium n’a été objectivée malgré la rupture de la membrane basale tubulaire. L’accumulation de myofibroblastes, exprimant l’« alpha smooth muscle actin» était évidente au sein de l’épithélium tubulaire en dégénérescence et dans l’interstitium riche en collagène de type I et III autour des tubes atrophiques. L’apoptose de CETP (expression de la forme active de la caspase-3) était présente dès le jour 5. Au-delà du 10e jour, un défaut de la régénération de CETP a été démontré. Une augmentation significative de l’excrétion urinaire du « Monocyte Chemoattractant Protein-1 » et du « Transforming Growth Factor-β» (TGF-β) a été mesurée durant la phase chronique. Les amas de monocytes/macrophages (Mn/Mφ) et de lymphocytes T CD45RC+, CD3+, CD4+ et CD8+ étaient présents dans l’interstitium des stries médullaires et la partie externe de la médullaire externe (segment S3 des tubes proximaux). L’activation et la prolifération des Mn/Mφ ont été confirmées respectivement par double immunomarquage ED1/complexe majeur d’histocompatibilité de classe II et ED1/Ki-67. La cytotoxicité des cellules CD8+ a été d émontrée par des lésions de tubulite. Une sous-population de lymphocytes T CD8+CD103+a été retrouvée. L’expression du TGF-β et de la protéine nucléaire phosphorylée smad 2/3 était augmentée dans les cellules inflammatoires et les CETP. Ce travail démontre :1) la présence d’une insuffisance rénale aiguë transitoire suite une nécrose tubulaire aiguë méconnue; 2) une induction précoce de la transition épithélio-mésenchymale, un échec de la régénération et une apoptose des CETP étant à l’origine de l’atrophie tubulaire; 3) une inflammation interstitielle précoce et persistante (Mn/Mφ activés, lymphocytes T cytotoxiques CD8+ et sous-population de lymphocytes T CD8+C103+); 4) l’implication du TGF-β dans la fibrogenèse par la voie de signalisation intracellulaire de smad 2/3.En conclusion, au cours de la NAA expérimentale, une intense réaction inflammatoire associée à une sécrétion de TGF-β et à une activation des fibroblastes résidents représentent les mécanismes-clés conduisant à une atrophie tubulaire définitive et à une fibrose interstitielle chronique à partir d’une intoxication tubulaire majeure. Ces observations offrent des perspectives thérapeutiques prometteuses pour la prévention de la fibrose rénale interstitielle et, par voie de conséquence, de la progression des maladies rénales chroniques. / Doctorat en Sciences médicales (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La maladie de Berger est la glomérulonéphrite la plus fréquente avec une estimation selon laquelle 1% de la population mondiale serait touchée. L’agent causal est une immunoglobuline (Ig)A anormale (polymérique et hypogalactosylée) qui se dépose dans le mésangium et provoque un dysfonctionnement rénal (protéinurie, hématurie) et des lésions glomérulaires. Dans 25% des cas, la maladie évolue sur 20 ans vers l’insuffisance rénale terminale. Des évidences, de plus en plus nombreuses, montrent que l’environnement microbien, en particulier bactérien, commensal ou pathogène, a un impact important sur le développement de la maladie. Au cours de ma thèse, j’ai d’abord étudié l’effet d’une molécule de la paroi bactérienne, le lipopolysaccharide (LPS), sur la production des IgA dans les muqueuses chez la souris normale. Les résultats que j’ai obtenus et ceux publiés permettent de proposer que la stimulation chronique des muqueuses par l’environnement microbien conduit à une augmentation de la production d’IgA néphrotoxiques, qui, du fait d’un déficit de leur récepteur pIgR mucosal, sont anormalement dirigées vers la circulation plûtôt que dans la lumière es muqueuses. Dans une seconde partie de mon travail, j’ai étudié l’effet du LPS sur le développement de la maladie de Berger dans un modèle de souris 1KI. Ces souris génétiquement modifiées produisent de l’IgA humaine et développent spontanément des dépôts mésangiaux d’IgA mais n’ont pas de protéinurie, d’hématurie ou de lésions glomérulaires. Nos résultats montrent que le LPS provoque une forte hématurie dans les souris 1KI lorsque celles-ci expriment le récepteur des IgA humaines, CD89, à la surface des polymorphonucléaires neutrophiles. En conclusion, mon travail de thèse a permis de mettre en lumière un impact de l’environnement microbien sur pIgR et sur les polymorphonucléaires neutrophiles dont la déficience ou l’activation pourrait contribuer au développement de la maladie de Berger. / IgA nephropathy is the most frequent glomerulonephritis worldwide. It features mesangial immunoglobulin (Ig)A deposits and proteinuria, hematuria and glomerular histological lesions. In 25% patients, it evolves, within 20 years, towards the end stage renal disease. Microbial environment, through the interaction with mucosa, is believed to play a crucial role in the development of the disease. The objectives of my work were to evaluate the effect of the microbial compound lipopolysaccharide (LPS) on the production of the nephritogenic IgA in the mucosa of mice and on the development of IgA nephropathy in the murine model 1KI that spontaneously develops mesangial IgA deposits without the other signs of the disease. Our results and those previously published suggest that the chronic stimulation of mucosa by microbiota leads to the increased production of nephritogenic IgA in the mucosa. These IgA, thanks to a deficient mucosal receptor pIgR in patients with IgA nephropathy, may be abnormally routed in the blood. We also showed that LPS provokes hematuria in the 1KI mice, when they express a specific IgA receptor, CD89, on the surface of polymorphonuclear neutrophils. Altogether our findings highlight the impact of microbial environment on pIgR and on polymorphonuclear neutrophils and thus, potentially, on IgA nephropathy.

La néphropathie diabétique est l’une des complications les plus fréquentes chez les patients diabétiques à long terme, et est la première cause du besoin de dialyse. Les lésions glomérulaires semblent jouer un rôle clé dans le développement de la néphropathie diabétique. L’épaississement de la membrane basale glomérulaire, l’hypertrophie des cellules glomérulaires et la perte de podocytes font partie des principaux changements pathologiques survenant au cours de la néphropathie diabétique et peuvent conduire à une protéinurie. Il a été suggéré que le dysfonctionnement endothélial joue un rôle important dans la pathogenèse des lésions glomérulaires au cours de la maladie rénale diabétique. En effet, l’altération de la fonction et de l’intégrité des cellules endothéliales glomérulaires est l’une des principales causes de la microalbuminurie observée dans l’insuffisance rénale diabétique précoce. Les lésions des cellules endothéliales glomérulaires peuvent endommager les podocytes et même induire une perte podocitaire ce qui aggrave d’avantage les liaisons des cellules endothéliales glomérulaires et ainsi de suite. Actuellement, les traitements de la néphropathie diabétique visent le contrôle de la glycémie et de la pression artérielle dans le but de maintenir un bon débit de filtration glomérulaire. Cependant, l’étude de traitements pouvant cibler les lésions endothéliales ou les interactions podocyte-cellule endothéliales, qui jouent un rôle essentiel dans la progression de la maladie rénale diabétique, est nécessaire. Les traitements ciblant l’endothélium glomérulaire pourraient offrir des avantages thérapeutiques pour la néphropathie diabétique. En effet, des facteurs anti-angiogéniques tels que les inhibiteurs du VEGF pourraient prévenir les lésions rénales et les altérations glomérulaires sur des modèles de souris diabétiques. Cependant, d’autres données ont montré que des injections d’inhibiteurs du VEGF pouvaient être néfastes pour les cellules endothéliales et podocytaires. Ainsi, de nouvelles molécules ciblant l’endothélium vasculaire pourraient améliorer le pronostic et la qualité de vie chez les patients présentant une insuffisance rénale diabétique à un stade précoce. Nous avons précédemment montré que Alk1, avec son ligand BMP9, joue un rôle important dans le maintien de l’intégrité vasculaire chez les animaux diabétiques. En effet, 4 la perte de signalisation d’Alk1 chez les animaux diabétiques conduit à la dissociation des jonctions vasculaires et à une augmentation des fuites vasculaires dans la rétine. Compte tenu de son rôle dans le maintien de la quiescence et de l’intégrité de l’endothélium, nous avons évalué les effets de la surpression d’Alk1 sur l’intégrité de l’endothélium glomérulaire et la fonction rénale chez la souris diabétique. Nous avons utilisé des souris avec délétion conditionnelle de Alk1 dans l’endothélium (Alk1ΔEC) pour évaluer le rôle de Alk1 dans la filtration glomérulaire chez des souris diabétiques induits par le STZ. Les souris ont été euthanasiées quatre mois après le début du diabète et des analyses sérologiques et urinaires ont été effectuées, ainsi que des études immunohistochimiques. Nous avons démontré que l’haplo-insuffisance d’Alk1 aggrave la microalbuminurie et induit une perte de podocytes chez des souris diabétiques. De plus, une augmentation significative de l’apoptose glomérulaire a été observée chez les souris Alk1ΔEC hétérozygotes diabétiques. L’analyse de souris Alk1ΔEC homozygotes non diabétiques a également révélé une perte importante de cellules endothéliales glomérulaires. Ensemble, ces données suggèrent que la signalisation du récepteur Alk1 joue un rôle essentiel dans le maintien des cellules endothéliales glomérulaires et participe au maintien de l’intégrité glomérulaire à travers un mécanisme de podocyte-endothelial cross-talk. / Diabetic kidney disease one of the most frequent microvascular long-term complications in diabetic patients and is the first cause for the need for dialysis. The glomerular damage seems to play a key role in the development of diabetic nephropathy. Thickening of the glomerular basement membrane, glomerular cell hypertrophy, and podocyte loss is among the main pathological changes occurring during diabetic nephropathy and can lead to proteinuria. Endothelial dysfunction has been suggested to play an important role in the pathogenesis of glomerular damage during diabetic kidney disease. Indeed, alteration of the glomerular endothelial cell function and integrity is a leading cause of microalbuminuria observed in early diabetic kidney disease. Injury to glomerular endothelial cells may lead to podocyte damage, while podocyte loss further exacerbates glomerular endothelial cell injury, forming a vicious cycle. Currently, therapies in diabetic nephropathy are focusing on glycemia control and adequate arterial pressure levels in order to maintain an adequate glomerular filtration rate. However, the study of some treatments that may target endothelial lesions or podocyte-endothelial cell interactions, which play a vital role in the progression of diabetic kidney disease is necessary. It has been suggested that antiangiogenic treatments for diabetic kidney disease could provide therapeutic benefits. Indeed, anti-angiogenic factors such as VEGF inhibitors have been demonstrated to suppress renal damage and glomerular alterations in a diabetic mouse model. However, some other data have shown that anti-VEGF injections could be detrimental for podocytes and endothelial cells. Thus, new molecules targeting the vascular endothelium could possibly improve prognosis and quality of life in patients with early stages of diabetic kidney disease. We have previously shown that Alk1, along with its ligand BMP9, plays an important function to maintain vascular integrity in diabetic animals. Loss of Alk1 signaling in diabetic animals led to dissociation of vascular junctions and increased vascular leakage. Given its role in the maintenance of endothelial quiescence and integrity, we evaluated the effects of Alk1 suppression on kidney integrity and renal function in diabetic mice. 6 We used mice with conditional deletion of Alk1 in the endothelium (Alk1ΔEC) to evaluate the role of Alk1 in glomerular filtration in STZ-induced diabetic mice. Mice were euthanized four months after the onset of diabetes and urine, and serological analyzes were performed, along with immunohistochemical studies. We demonstrated that Alk1 haploinsufficiency worsens microalbuminuria and induces podocyte loss. Furthermore, a significant increase in glomerular apoptosis was observed in Alk1ΔEC mice. Analysis of homozygous Alk1ΔEC mice also revealed a significant loss of glomerular endothelial cells. Together, these data suggest that Alk1/BMP9 signaling plays a critical role in the maintenance of glomerular endothelial cells and has important functions to maintain glomerular integrity through a crosstalk podocyte-endothelial mechanism.

Résumé : Les podocytes, cellules épithéliales rénales, sont nécessaires au maintien de la structure et de la fonction de filtration des glomérules rénaux. La dédifférenciation et l’apoptose des podocytes sont des évènements précoces de la néphropathie diabétique. Des études ont rapporté que l’insuline est nécessaire à la survie des podocytes puisque la délétion du récepteur à l’insuline dans les podocytes de souris entraîne une pathologie glomérulaire semblable à la néphropathie. D’autres études ont montré que la protéine tyrosine phosphatase Src homology-2 domain-containing phosphatase-1 (SHP-1) inhibe les voies de signalisation de l’insuline au niveau du foie et du muscle en déphosphorylant la sous-unité bêta du récepteur à l’insuline (IRβ) et la kinase Phosphatidylinositide 3-kinase (PI3K). Il a récemment été démontré que l’expression de SHP-1 est élevée dans les cortex rénaux de souris diabétiques. Nous avons donc émis l’hypothèse que l’expression de SHP-1 induite par l’hyperglycémie altère les actions de l’insuline dans les podocytes. Nous avons premièrement utilisé un modèle in vivo de souris diabétiques de type 1 (Ins2+/C96Y; Akita). Comparées aux souris contrôles (Ins2+/+), les souris Akita présentaient une apoptose élevée des podocytes ainsi qu’une perte des pédicelles. La phosphorylation de la protéine kinase B (Akt) et de Extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2), suite à une injection systémique d’insuline, était également significativement diminuée dans les cortex rénaux des souris Akita. Cette diminution correspondant à une résistance à l’insuline corrélait avec une augmentation de deux fois de l’expression de SHP-1 dans les glomérules. Nous avons ensuite utilisé une lignée immortalisée de podocytes murins en culture et avons observé que l’exposition à des concentrations élevées de glucose (HG; 25 mM) pendant 96 h, entraînait l’augmentation de l’expression de marqueurs apoptotiques et de l’activité enzymatique de caspase-3/7 en comparaison aux concentrations normales de glucose (NG; 5,6 mM). L’exposition en HG a augmenté l’expression de l’ARNm et protéique de SHP-1, en plus de réduire la signalisation de l’insuline dans les podocytes. La surexpression de la forme dominante-négative de SHP-1 dans les podocytes a permis de renverser les effets de HG et de restaurer les actions de l’insuline. Finalement, l’augmentation de l’expression de SHP-1, tant in vivo qu’in vitro, a été directement corrélée à son association avec IRβ et à la diminution de la phosphorylation de IRβ, Akt et ERK1/2 suite à une stimulation à l’insuline. En conclusion, nous avons montré que l’expression élevée de SHP-1 dans les glomérules cause une résistance à l’insuline et la mort des podocytes contribuant ainsi à la néphropathie diabétique. // Abstract : Podocytes are epithelial renal cells required to preserve glomerular structure and filtration. Their dedifferentiation and apoptosis are early events of diabetic nephropathy progression. Previous studies have shown that insulin action is critical for podocyte survival since deletion of its receptor lead to a glomerular pathology similar to nephropathy. It has also been demonstrated that Src homology-2 domain-containing phosphatase-1 (SHP-1), a protein tyrosine phosphatase, inhibits insulin signaling pathway in liver and muscle by dephosphorylating tyrosine residues on insulin receptor beta-subunit (IRβ) and the Phosphatidylinositide 3-kinase (PI3K). A recent study concluded that SHP-1 is elevated in kidney cortex of type 1 diabetic mice. We hypothesized that hyperglycemia-induced SHP-1 expression may affect insulin actions in podocytes. To confirm this hypothesis, we used type 1 diabetic Akita mice (Ins2+/C96Y). Compared to control littermate mice (Ins2+/+), Akita mice developed elevated podocyte foot process effacement and podocyte apoptosis. In contrast to control mice, insulin-stimulated protein kinase B (Akt) and extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) phosphorylation was remarkably reduced in renal podocytes of Akita mice. This phosphorylation diminution associated to a renal insulin resistance was correlated with a two-fold increase of SHP-1 expression in the glomeruli. We then used cultured murine podocytes cell line to confirm our in vivo results. Podocytes exposed to high glucose concentration (HG; 25 mM) for 96 h exhibited high levels of apoptotic markers and caspase-3/7 enzymatic activity as compared to normal glucose concentration (NG; 5,6 mM). HG exposure raised mRNA and protein levels of SHP-1 and reduced the insulin-signaling pathway in podocytes. Overexpression of dominant-negative SHP-1 in podocytes prevented HG effects and restored insulin actions. Finally, elevated SHP-1 expression induced by high glucose levels was directly correlated to an increased association with insulin receptor-β subunit (IRβ) in vitro and in vivo. This association is therefore leading to the reduction of both IRβ phosphorylation and insulin-stimulated Akt and ERK phosphorylation. In conclusion, our results showed that high levels of SHP-1 in glomeruli cause insulin resistance and podocyte loss, thereby contributing to diabetic nephropathy.