Würzburg, University, Diss., 2006.

Enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) gehören zu den wichtigsten der sich in jüngster Zeit verbreitenden Pathogene und verursachen die verschiedensten Durchfallerkrankungen von unblutiger Diarrhö bis zu hämorrhagischer Kolitis, oftmals unter Ausprägung von lebensbedrohlichen extraintestinalen Symptomen wie dem hämolytisch-urämischen Syndrom. Die wichtigsten Virulenzfaktoren dieser Pathogene sind Shiga-Toxine (Stx) und Faktoren, die an der Ausprägung der sog. "attaching and effacing"-Läsionen auf Darmepithelzellen beteiligt sind. Vor allem Kinder und ältere Menschen sind von den Infektionen, die häufig in Form von Ausbrüchen auftreten, betroffen. Die Übertragung erfolgt meist über fäkal kontaminierte Nahrungsmittel. Da die Behandlung von EHEC-Infektionen mit manchen Antibiotika die Entwicklung der extraintestinalen Symptome noch verstärken kann, wäre die Impfung gefährdeter Personen der beste Weg für die Bekämpfung dieser Erreger. Eine weitere Möglichkeit der Prävention wäre die Eradikation dieser Organismen in ihren asymptomatischen Wirten, über die EHEC in die menschliche Nahrungskette gelangen können. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war unter anderem die Etablierung der Grundlagen für einen Lebendvakzinstamm zur Prävention von EHEC-Infektionen. Zu diesem Zweck wurden unterschiedliche Strategien mit dem Ziel verfolgt, einen Stx2-produzierenden EHEC-Stamm zu attenuieren. Eine Attenuierungsstrategie für EHEC ist die direkte Ausschaltung von Virulenzfaktor-Strukturgenen wie den Toxingenen. Zu diesem Zweck wurde eine stx2-negative Mutante des EHEC-Stammes O157:H7 86-24 durch eine Deletion im Zentrum des stx2-Genclusters konstruiert, was zur Fusion der 154 N-terminalen Aminosäuren von StxA2 mit den 62 C-terminalen Aminosäuren von StxB2 führte. Die Charakterisierung der Mutante zeigte, daß der Toxin-konvertierende Bakteriophage noch intakt war. Das Fusionsprotein hatte seine zytotoxische Aktivität zwar vollständig verloren, konnte jedoch durch Stx2-spezifisches Schweineantiserum detektiert werden. Daraus wurde geschlossen, daß das mutierte Protein einen Teil seiner antigenen Strukturen behalten hatte und daß es potentiell für die Impfung gegen Stx2-spezifische Schädigungen verwendet werden könnte. Eine weitere Strategie mit dem Ziel der Attenuierung von EHEC-Stämmen war die Deletion von Genen, die in die Regulation von Virulenzfaktoren involviert sind. Auf diese Weise sollte die Expression von Pathogenitätsfaktoren verhindert werden. Als erstes wurde versucht, einen postulierten bakteriophagenkodierten toxinspezifischen Regulator zu identifizieren und zu charaktierisieren, der die Fähigkeit besaß, die Expression eines stx2-spezifischen Reportergens nach der Induktion des Phagen zu steigern. Eine Transposonmutagenese des Stx2-konvertierenden Phagen 933W ergab verschiedene Phagenmutanten mit veränderter Expression des Reportergens nach Induktion des Phagen. Die Expressionsveränderung korrelierte nur bedingt mit der Veränderung der Produktion von Toxin oder Phagenpartikeln. Das Transposon der am stärksten in ihrer Reportergenexpression reduzierten Mutante war im ORF L0065 inseriert, der unmittelbar "upstream" von den Phagengenen int/xis lokalisiert ist. Der klonierte wildtypische ORF war nicht in der Lage, die Transposonmutante in trans zu komplementieren. Daraus wurde geschlossen, daß der Phänotyp der Mutante durch einen polaren Effekt des Transposons auf int/xis bedingt sein könnte, da eine reduzierte Phagengenomexcision eine Verminderung der Phageninduktion verursachen würde, was sich entsprechend auf die Reportergenexpression auswirken könnte. Neely et al. (1998) identifizierten den Phagen-Antiterminator Q als einen möglichen Kandidaten für den postulierten phagenkodierten stx2-Regulator. Eine Deletion dieses zentralen Phagenregulators könnte durch die Störung der regulären Phagenfunktionen zur Attenuierung von EHEC beitragen. Als zweites wurde in einem Projekt von Dr. I. Mühldorfer anhand von recA-negativen Mutanten der EHEC-Stämme O157:H7 86-24 und EDL933 in verschiedenen Mäusemodellen demonstriert, daß die Deletion von recA einen massiven Virulenzverlust und damit eine Attenuierung der Stämme zur Folge hatte. Die dadurch bedingte drastische Reduktion der Toxinproduktion konnte indirekt auf das Fehlen von recA zurückgeführt werden. Im Gegensatz dazu veränderte die Deletion von recA im UPEC-Stamm O6:K15:H31 536 die Virulenz dieses Stammes nicht. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte die Auswertung der Ergebnisse der Virulenztests. Die Deletion von recA ist außerdem eine wichtige Sicherheitsmaßnahme für eine Prävention der Integration von Fremd-DNA in Lebendvakzine und damit für die Verhinderung der Reversion dieser Stämme zur Pathogenität. Als drittes wurden die Auswirkungen der Deletion des Gens leuX, das für die seltenere Leucin-spezifische tRNA5Leu kodiert, auf die Expression von EHEC-Virulenzfaktoren anhand einer leuX-Deletionsmutante des EHEC-Stammes O157:H7 86-24 untersucht. Die Deletion dieser tRNA im UPEC-Stamm 536 führt wegen der dadurch reduzierten Expression verschiedener Virulenzfaktoren zu einer Attenuierung des Stammes. Es wurde gezeigt, daß wie in UPEC auch in EHEC die Produktion von Flagellen und Enterobaktin beeinträchtigt war. Zusätzlich war die Häminverwertung reduziert. Außerdem verminderte die Deletion von leuX die Expression nicht-identifizierter Proteine der äußeren und inneren Membran sowie eines mit Typ 1-Fimbrien-spezifischem Serum kreuzreaktiven Antigens. Im Gegensatz dazu wurden die Stx2-Produktion sowie die in vivo-Virulenz des Stammes in Mäusen nicht beeinflußt. Die Enterohämolyse sowie die Expression von Intimin waren verstärkt. Die Expression der typischen EHEC-Virulenzfaktoren war demnach in der leuX-Mutante nicht reduziert. Der Einfluß von leuX auf die Expression dieser Faktoren war offensichtlich nicht auf eine Translationsreduktion durch die fehlende Bereitstellung der tRNA beschränkt, sondern scheint weitere Mechanismen zu involvieren. Eine wirkliche Attenuierung von EHEC kann durch die Deletion von leuX wahrscheinlich nicht erzielt werden. / Enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) are important emerging pathogens responsible for the development of diarrheal diseases, ranging from unbloody diarrhea to hemorrhagic colitis, and of life-threatening extraintestinal complications like the hemolytic-uremic syndrome. The most important virulence factors of this pathogen are the mostly phage-encoded Shiga toxins (Stx) and the factors involved in the development of so-called "attaching and effacing lesions" on gut epithelial cells. Children and the elderly are mainly affected by these infections, which often occur as outbreaks. The infections are predominantly transmitted by fecally contaminated food. The treatment of EHEC infections with some antibiotics may promote the development of extraintestinal complications. Therefore, the best way to combat this infectious agent would be the vaccination of the endangered people. Another way would be the eradication of the organism in its asymptomatic carrier animals involved in the transmission of EHEC into the human food chain. The objective of this thesis was to lay the basis for the development of a life vaccine strain for people or cattle against EHEC infections. Therefore, different strategies aiming at the attenuation of a Stx2-producing EHEC wildtype strain were followed. One strategy for the attenuation of EHEC is the direct knockout of virulence factor structural genes, like the toxin genes. Therefore, a stx2-negative mutant of the EHEC strain O157:H7 86-24 was constructed by deleting the central part of the stx2 gene cluster, leading to the fusion of the 154 N-terminal aminoacids of StxA2 with the 62 C-terminal aminoacids of StxB2. The characterisation of the mutant revealed that the toxin-converting bacteriophage was still intact, but that the fusion protein had completely lost its cytotoxic activity and that it could be detected using Stx2-specific pig antiserum. It has been concluded that the respective mutant protein had kept part of its antigenic structure and that it could potentially be used for vaccination against Stx2-specific damage. Another strategy aiming at the attenuation of EHEC-strains was the deletion of genes involved in the regulation of virulence factors in order to prevent the expression of the respective factors. Firstly, the identification and characterisation of a formerly postulated bacteriophage-encoded toxin-specific regulator which had the capability to induce the expression of a stx2-specific reporter gene after induction of the phage was attempted. A transposon-mutagenesis of the Stx2-converting phage 933W yielded a variety of phage mutants with altered expression of the reporter gene upon phage induction. Toxin production as well as the capability to produce phage particles did not correlate well with the reporter gene phenotypes. The transposon of the mutant with the lowest induction of the reporter gene was inserted into ORF L0065 located immediately upstream of the phage's int/xis genes. The cloned wildtype ORF was not able to trans-complement the transposon mutant. It was concluded that the mutant's phenotype was due to a reduced excision of the phage genome caused by a polar effect of the transposon on int/xis and therefore reduced phage induction leading to reduced reporter gene induction. Neely et al. (1998) identified the phage antiterminator Q as a possible candidate for the postulated phage-encoded stx2 regulator. The specific deletion of this general phage regulator might help to attenuate EHEC by disturbing regular phage functions. Secondly, recA-negative mutants of the EHEC-strains O157:H7 86-24 and EDL933 were examined in different mouse models as part of a project of Dr. I. Muehldorfer. It was demonstrated that the deletion of recA brought about a massive virulence loss due to a drastic reduction of toxin production, which was indirectly caused by the lack of recA. Thus, the deletion of recA attenuates pathogenic EHEC strains in the mouse model. In contrast, the deletion of recA in UPEC strain O6:K15:H31 536 did not alter the virulence of this strain. The analysis of the revealed virulence data was performed as part of this thesis. In addition, the deletion of recA is an important safety measurement for preventing the integration of foreign DNA into attenuated strains and thus, it helps preventing reversion of the vaccine to pathogenicity. Thirdly, the consequences of a deletion of the gene leuX coding for the minor Leucin specific tRNA5Leu on the expression of virulence factors in EHEC were examined by the construction and characterisation of an EHEC O157:H7 86-24 leuX-deletion mutant. In UPEC strain 536, the deletion of this tRNA lead to an attenuation of this strain due to reduced expression of diverse virulence factors. It was demonstrated that in EHEC, like in UPEC, the production of flagella and enterobactin was reduced. In addition, Hemin utilisation was impaired. The deletion of leuX also diminished the expression of various proteins of the outer and inner membrane as well as of an antigen cross-reacting with serum specific for type 1-fimbriae. In contrast, it did not influence the production of Stx2 as well as the in vivo pathogenicity of the strain in mice. Enterohaemolysis and the expression of Intimin were enhanced. Thus, it was demonstrated that the typical EHEC virulence factors were not reduced in the leuX mutant. In addition, it became obvious that the impact of leuX on the expression of the respective genes is not only based on a translational reduction due to a lack of tRNA availability but seems to involve further mechanisms. We concluded that apparently, an attenuation of EHEC is not possible by the deletion of leuX.

Virulenzattenuierte Stämme des Gram-positiven Pathogens Listeria monocytogenes (Lm) stellen optimale Kandidaten als Träger für heterologe Proteinantigene in die Maus dar. Lm repliziert nach Befreiung aus dem primären phagosomalen Kompartiment sehr effizient und schnell im Zytosol sehr vieler nicht-phagozytischer Wirtszellen als auch in professionellen antigenpräsentierenden Zellen (APC). Diese Fähigkeit in relevante immunologische APCs einzudringen und zu replizieren, erlaubt die zielgerichtete Übertragung heterologer Antigene in die MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Präsentationswege, um so eine effektive zelluläre Immunität zu etablieren. In der vorliegenden Arbeit wurden die in vivo Effizienzen der Aktivierung von antigen-spezifischen CD8+ and CD4+ T-Zellen miteinander verglichen, sobald das plasmidkodierte Proteinantigen Ovalbumin (OVA) in Form von bakteriell exprimierten und exportierten Proteinen, von cDNA oder mRNA durch die jeweiligen virulenzattenuierten Lm trpS Stämme in das Zytosol von antigenpräsentierenden Zellen freigesetzt wurde. Die Freisetzung wurde durch ein Listeria-spezifisches Phagenlysin, welches von den Bakterien vorwiegend im Zytosol der Wirtszelle exprimiert wird, unterstützt. Die Übertragung dieser unterschiedlichen biologisch-aktiven Moleküle durch die autolysierenden Listerien führte im Falle des Proteins und der mRNA erfolgreich zu einer MHC-Klasse-I-Präsentation eines Ovalbumin-Peptides (SIINFEKL), welche letztendlich eine adaptive zelluläre Immunität unter Beteiligung von T-Gedächtniszellen induzierte. Dabei stellte sich die Übertragung des Proteins durch Lm als die effizienteste Strategie im Induzieren einer zellulären adaptiven Immunantwort mit gegen Ovalbumin gerichteten CD8 und CD4 T-Gedächtniszellen heraus. Autolysierende Listerien, welche die plasmidkodierende OVA-DNA übertrugen, lösten dagegen keine OVA-spezifische T-Zellantwort aus. Da sich der Trägerstamm Lm trpS aufgrund der Autolysiskassette zwar als virulenzattenuiert herausgestellt hatte, jedoch bei höher Applikationsdosis dieses Stammes es nur zu einer unvollständigen Lysis kam, wurden die jeweiligen Effizienzen weiterer noch stärker attenuierter autolysierender Lm Stämme als Überträger des Ovalbumins (Lm Mutanten trpS hlyW491A und (trpS aroA aroB)) bestimmt. Beide ermöglichten die OVA-Präsentation über MHC-Klasse-I-Moleküle mit nachfolgender klonaler Expansion spezifischer CD8+ T-Zellen in vergleichbaren signifikanten Werten zum WT Stamm trpS. Ferner wurde zum ersten Mal eine signifikante Präsentation des OVAs über MHC-Klasse-I-Moleküle durch die autolysierende Mutante trpS hlyW491A, welche die plasmidkodierende DNA freisetzte, nachgewiesen. Die autolysierende Lm (trpS aroA aroB) Mutante in hoher CFU (5107) stellte sich dabei als ein sehr vielversprechender Träger des heterologen Proteinantigens heraus, da sie im Gegensatz zum autolysierenden Stamm Lm trpS eine sehr geringe Leberschädigung hervorrief. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, das durch Freisetzung von OVA Antigenen in das Zytosol oder ins Phagosom von APCs, welche von den jeweiligen Lm (trpS aroA aroB) Stämmen als exportiertes, zellwandverankertes oder intrazellulär verbleibendes Protein exprimiert wurden, vergleichbare Häufigkeiten an proliferierten OVA-spezifischen CD8+ T-Zellen induzierten werden konnten. Es zeigten sich jedoch deutliche Unterschiede in der Aktivierung antigen-spezifischer CD4+ T-Zellen durch diese Lm (trpS aroA aroB) OVA-Trägerstämme. Die Strategie der Übertragung exportierter Proteine ins Phagosom oder ins Zytosol antigenpräsentierender Zellen war die wirkungsvollste, um gleichzeitig effiziente MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-restringierte Antigenpräsentationen in vivo zu induzieren. Es wurden alternative plasmidkodierende Lysiskassetten für die Freisetzung von DNA-Vakzinen (Baktofektion) aus den Bakterien konstruiert, die alle aus Lyseproteinen eines Listeria-spezifischen Phagens und einem vorangestellten zytosolischen listeriellen Promotor bestehen. Diese wurden in ihrer Effizienz mit der ursprünglich eingesetzten Lysiskassette PactA-ply118 verglichen. Dabei wurde beobachtet, dass zwei von den vier neukonstruierten Lysiskassetten in einige Zellinien vergleichbare Baktofektionsraten erzielten. Jedoch ist die ursprüngliche Phagenlysin-Kassette PactA-ply118 für die Übertragung von Plasmid-DNA in das Zytosol von Wirtszellen die wirksamste, da diese in vivo zu einer besonders hohen Attenuation der Bakterien führte. / Virulence-attenuated strains of the Gram positive pathogen Listeria monocytogenes (Lm) are optimal candidates for the delivery of heterologous antigens into mammalian hosts. Lm escapes the phagosome, replicates efficiently within the cytosol of many host cells including appropriate cells of the immune system like macrophages and dendritic cells (antigen presenting cells, APCs). These natural biological properties of Lm to enter and replicate in relevant immunological APCs allow the targeted delivery of heterologous antigens into the antigen-processing pathway of MHC class I and MHC class II molecules leading to a strong cellular immunity. In this work, the in vivo efficiences of activation of antigen-specific CD8 and CD4 T cells were compared when the plasmid-encoded protein antigen ovalbumin was secreted by the bacteria as a protein or delivered as cDNA or as mRNA. Delivery was supported also by a specific endolysin produced by the bacteria. Listeriae harbouring this transcriptional unit undergo lysis when they reach the cytosol. In the case of OVA as protein or as mRNA, delivery of these different biological active molecules by autolysing Listeria resulted in significant OVA peptide (SIINFEKL) presentation in the context of MHC class I molecules, which also induced an adaptive cellular immunity with memory T cells. Secretion of OVA by the carrier bacteria yielded the strongest immune response involving OVA-specific memory CD8 and CD4 T cells. In contrast, infection with autolysing Listeria delivering OVA-encoded DNA failed to generate OVA-specific T cells. Due to its harbouring of the autolysing cassette, carrier strain Lm trpS was virulence-attenuated, but infection with 5107 bacteria of this strain resulted in a partial lysis. Therefore investigation of other attenuated and also autolysing strains (Lm mutants trpS hlyW491A and (trpS aroA aroB)) was necessary. Both these strains facilitated OVA presentation via MHC-class-I molecules resulting in clonal expansion of specific CD8+ T cells in comparable frequencies as the wild-type strain. Furthermore, autolysing Lm trpS hlyW491A delivering OVA-encoded DNA led to specific presentation of OVA in the context of MHC class I molecules. Additionally, autolysing Lm (trpS aroA aroB) strain with high infection dose (5107) is a promising carrier for heterologous protein antigens because this mutant exhibited only marginal liver toxicity in contrast to the strain Lm trpS. In this regard, comparable frequencies of proliferated OVA-specific CD8+ T cells were induced through the delivery of OVA antigens into phagosome or cytosol of APCs that were expressed as secreted proteins, as anchored-proteins or as intracellular proteins by the respective carrier Lm strains (trpS aroA aroB). Activation of antigen-specific CD4+ T cells by these OVA-carrier Lm (trpS aroA aroB) was different compared to activation of antigen-specific CD8+ T cells. Secretion of OVA by the carrier bacteria yielded the strongest activation of both MHC-class I and II restricted antigen presentation in vivo. Different lysis cassettes were tested consisting of Listeria-specific phage lysis proteins and an intracellular promoter of Listeria for the delivery of DNA vaccines (bactofection). The efficiency of these cassettes was compared to the original cassette (PactA-ply118). Two of the four new cassettes achieved comparable bactofection rates in some cell lines as the originally used cassette. However, the Lm strain containing the cassette PactA-ply118 was found to be the most effective due to high attenuation in mice.

Techn. Univ., Diss., 2010--München.

Das Gefühl die eigenen Handlungen selbst zu verursachen und deren Konsequenzen zu kontrollieren, ist ein wesentlicher Bestandteil unserer Selbstwahrnehmung und wird als Erleben von Urheberschaft oder Autorenschaft bezeichnet. Die zugrunde liegenden neurokognitiven Mechanismen sind bislang nur unzureichend verstanden. In zwei Experimenten zur Handlungswahrnehmung wurde bei gesunden Probanden mittels Elektroenzephalogramm (EEG) die Hirnaktivität auf visuelles Handlungsfeedback erfasst. Reduzierte neuronale Aktivität (sensorische Attenuierung) auf selbst versus extern generiertes Feedback wurde als implizites Maß für das Erleben von Urheberschaft verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass das Ausmaß der neuronalen Attenuierung stärker von der Präsenz einer Handlung sowie vorausgehenden Hinweisreizen abhing, als von präzisen Vorhersagen durch spezifische Kontingenzregeln. Die explizite Beurteilung der eigenen Urheberschaft dagegen beruhte primär auf hoher Kontingenz von Handlung und Feedback, während externe Hinweisreize nur in Kontexten herangezogen wurden, in denen Kontingenzinformationen nicht ausreichten. Eine dritte EEG Studie untersuchte Patienten mit Zwangsstörung, welche durch abweichendes Erleben der Vollendung und Urheberschaft für Handlungsergebnisse gekennzeichnet ist. Die Ergebnisse zeigten eine fehlende neuronale Attenuierung selbst generierter Handlungskonsequenzen bei Zwangspatienten. Verkörperte Signale wurden dabei weniger stark genutzt für Vorhersagen des Handlungsfeedbacks. Zusammenfassend trägt die vorliegende Arbeit zur Validierung der sensorischen Attenuierung als implizites Maß des Erlebens von Urheberschaft bei. Die Ergebnisse zeigen, dass das Erleben von Urheberschaft auf einer Integration multipler verkörperter und externer, kontextueller Hinweisreize beruht. Dieser Integrationsmechanismus scheint bei Zwangspatienten gestört zu sein und führt möglicherweise zu dem mangelnden Gefühl von Handlungsabschluss und Urheberschaft. / The experience of causing and controlling one s own actions and their consequences is a major aspect of our self-awareness, which has been termed sense of agency or experience of authorship. The underlying neural and cognitive mechanisms are still not well understood. In two consecutive experiments on action awareness, the electroencephalogram (EEG) of healthy participants was recorded to measure brain activity related to the perception of visual feedback. Reduced neuronal activity (sensory attenuation) in response to self- versus externally generated feedback was taken as an implicit measure for the sense of agency. The results showed that the amount of sensory attenuation was primarily determined by the mere presence of an action and external cues independent of highly precise predictions based on specific contingency rules. Explicit judgments of agency, in contrast, were mainly determined by high degrees of contingency between action and feedback, and external cues had an influence only in ambiguous contexts where contingency information was not reliable enough. A third EEG study investigated patients suffering from obsessive-compulsive disorder (OCD). OCD is characterized by lacking a sense of completion and agency for action outcomes. The results of this study revealed that OCD patients fail to suppress the consequences of their own action. Embodied signals were used less by patients for making specific predictions of the action feedback. In conclusion, the present work offers validation of sensory attenuation as an implicit measure of non-conceptual agency experience, and provides evidence that the sense of agency is based on an optimal integration of multiple embodied and external, contextual cues. Moreover, the present research reveals for the first time, to our knowledge - reduced gating of extracorporeal sensory action consequences in patients suffering from OCD, which may explain aberrant feelings of action completion and agency in these patients.