Os atuais sistemas de criação na avicultura, baseados na alta densidade populacional, aumentam os riscos de disseminação de enfermidades, especialmente das doenças respiratórias e daquelas cujos agentes etiológicos possuem mais de um hospedeiro. A Cólera Aviária (CA) possui estas características e geralmente apresenta-se de forma aguda e com altos índices de morbidade e de mortalidade. Apesar de representar uma das patologias aviárias que deve ser considerada para o diagnóstico diferencial de enfermidades com notificação obrigatória que cursam com morte súbita, a patogenia e os fatores de virulência envolvidos na CA ainda estão pouco elucidados. O objetivo deste trabalho foi pesquisar quinze genes associados à virulência em 25 amostras de Pasteurella multocida isoladas de casos de CA na região sul do Brasil através do desenvolvimento de protocolos de multiplex-PCR. Além disto, o presente estudo visou comparar a capacidade de tipificação capsular do método molecular com testes fenotípicos. Os protocolos de multiplex-PCR desenvolvidos foram capazes de detectar todos os genes propostos. Os genes ompH, oma87, sodC, hgbA, hgbB, exBD-tonB, nanB, hyaD-hyaC estiveram presentes em 100% das amostras (25/25). Os genes sodA e nanH em 96% (24/25), o gene ptfA em 92% (23/25) e o gene pfhA em 60% (15/25). Os genes toxA, bcbD, dcbF não foram identificados em nenhuma das amostras pesquisadas (0/25). A tipificação capsular através do teste molecular apresentou maior capacidade de detecção quando comparada aos testes fenotípicos, pois enquanto 36% (9/25) das amostras não foram identificadas pelo teste convencional, somente 8% (1/25) não foi tipificada através do multiplex-PCR. Foram obtidos seis diferentes perfis genéticos, sendo P1 (negativo para os genes toxA, dcbF e bcbD) o mais comum. Com este trabalho, concluiu-se que os protocolos de multiplex-PCR desenvolvidos tornam-se uma ferramenta bastante útil e rápida para a detecção simultânea dos genes de virulência. Apesar da alta frequência dos genes estudados e de todas as amostras pertencerem à mesma subespécie de P. multocida, foram observados seis perfis genéticos, os quais devem ser confirmados em um estudo com um maior número de amostras. / The current breeding systems in poultry, based on high population density, increases the risk of spread of pathologies, especially respiratory diseases and those whose etiologic agents have more than one host. Fowl Cholera (FC) has these features and generally is presented in an acute form and with high rates of morbidity and mortality. Even though it represents one of the several avian diseases that should be considered in the differential diagnosis of notifiable diseases that course with sudden death, pathogenesis and virulence factors involved in the FC are still poorly understood. The objective of this study was to investigate fifteen genes related with virulence in 25 samples of Pasteurella multocida isolated from FC cases in the southern region of Brazil through the development of multiplex PCR protocols. In addition, this study evaluated the ability of capsular typing comparing the method molecular with phenotypic tests. The multiplex-PCR protocols developed were capable to detect all the proposed genes. The genes ompH, oma87, sodC, hgbA, hgbB, exBD-tonB, nanB, hyaD-hyaC, bcbD and dcbF were present in 100% of the samples (25/25). Gene sodA and nanH in 96% (24/25), ptfA in 92% (23/25) and pfhA in 60% (15/25). Gene toxA, bcbD and dcbF were not identified in any of the samples studied (0/25). The capsular typing by molecular test presented a higher detection capability when compared to phenotypic tests, because while 36% (9/25) of 25 of samples were not identified by conventional testing, only 8% (1/25) was not typified by multiplex–PCR. Six different genetic profiles were obtained and P1 (negative to genes toxA, dcbF and bcbD) was the most common. With this work, it was concluded that the multiplex-PCR protocols developed can be a useful tool for rapid and simultaneous detection of virulence genes. Despite the high frequency of the analyzed genes and that all samples belong to the same subspecies of P. multocida, six genetic profiles were observed, which should be confirmed in a study with a larger number of samples.

O vírus da anemia das galinhas (CAV) pode causar imunodepressão em galinhas de todas as idades e doença nos frangos jovens, a qual é caracterizada por severa anemia, atrofia da medula óssea e hemorragias. A doença clínica é rara hoje, porém a forma subclínica é freqüentemente encontrada em criações comerciais e resulta num considerável decréscimo do desempenho. O CAV apresenta variabilidade genética, entretanto, em relação às amostras brasileiras do CAV, pouco ou quase nada desta variabilidade é conhecida. O presente trabalho descreve um protocolo de Nested-PCR para a detecção do CAV diretamente de amostras clínicas e analisa filogeneticamente as seqüências nucleotídicas das amostras positivas buscando verificar se a patologia apresentada por estas está relacionada com a variabilidade genética. Para a extração de DNA, o método baseado em tiocianato de guanidina mostrou-se mais eficiente e prático de executar que os demais testados. Foi selecionado um par de primers que amplifica uma região de 664 pb do gene vp1 e outro par que amplifica uma região interna de 539 pb para a realização da Nested-PCR. A especificidade dos primers foi avaliada utilizando amostras de lotes controlados para CAV e 30 diferentes isolados de vírus e bactérias causadoras de doenças em galinhas, as quais não geraram produto de amplificação. A sensibilidade foi determinada a partir de diluições seriadas da vacina comercial para o CAV. A Nested-PCR mostrou ser mais sensível do que a PCR e foi capaz de detectar 0,16 DICC50% da cepa vacinal. Além disso, a Nested-PCR detectou DNA viral em tecidos, soro e cama aviária de lotes com e sem sintomas clínicos.O produto de amplificação de 539 pb do gene vp1 de 44 amostras, provenientes de diferentes Estados produtores de frangos do Brasil, foi seqüenciado e foram encontradas 10 novas seqüências nucleotídicas do CAV. Estas 10 seqüências nucleotídicas foram analisadas filogeneticamente pelo método de distância neighbour joining com 1000 replicações o qual, mostrou que não houve correlação entre a patogenia apresentada nos animais e os grupos genéticos. Estas seqüências nucleotídicas também foram comparadas com 30 cepas de CAV isoladas em outros países e não foi observada correlação entre a distribuição geográfica e a variabilidade genética. Substituições de amino ácidos foram observadas em 9 posições sendo que, 65R substituindo o resíduo Q e 98F substituindo o resíduo Y ainda não haviam sido observadas. Conclui-se que, como técnica de detecção do CAV, o protocolo de Nested-PCR aqui descrito é mais sensível e menos trabalhoso do que o isolamento viral. As amostras Brasileiras de CAV possuem características filogenéticas similares às isoladas em outros países.

As aves foram separadas em quatro grupos, dois vacinados e dois não vacinados no 1º dia de vida. As aves foram desafiadas no 1º,4º,7º,10º,13º,16º,19º e 22º dias de vida. A cada dia de desafio eram coletados e medidos, antes e depois, os seguintes itens do grupo: peso relativo da bolsa de Fabrício, diâmetro da bolsa, bolsa de Fabrício para exame histológico e soro para medir os anticorpos contra a DIB, através de Elisa e avaliação clínica da DIB. Os resultados mostraram uma queda de anticorpos sem diferença significativa entre aves vacinadas e não vacinadas. Analisando os diferentes resultados, foi estabelecido que um título de Elisa (log10) de 3,4, foi o ponto de corte entre aves saudáveis e aves doentes. Foram construídas equações de regressão, para o estabelecimento do melhor dia para a vacinação ou do título de Elisa (log10), que as aves podem ter numa determinada idade. Assim sendo, os pintos da Empresa A deveriam receber vacina contra a DIB a partir do 6º - 7º dia, e os da Empresa B deveriam receber a vacina entre o 11º-12º dia de idade. Com os resultados obtidos neste experimento fica claro que as aves não devem ser vacinadas no 1º dia de vida, que o esquema de vacinação das reprodutoras ocasiona diferenças na proteção da progênie e que não se deve aplicar o mesmo esquema de vacinação indiscriminadamente para todos os lotes de frangos.

Os atuais sistemas de criação na avicultura, baseados na alta densidade populacional, aumentam os riscos de disseminação de enfermidades, especialmente das doenças respiratórias e daquelas cujos agentes etiológicos possuem mais de um hospedeiro. A Cólera Aviária (CA) possui estas características e geralmente apresenta-se de forma aguda e com altos índices de morbidade e de mortalidade. Apesar de representar uma das patologias aviárias que deve ser considerada para o diagnóstico diferencial de enfermidades com notificação obrigatória que cursam com morte súbita, a patogenia e os fatores de virulência envolvidos na CA ainda estão pouco elucidados. O objetivo deste trabalho foi pesquisar quinze genes associados à virulência em 25 amostras de Pasteurella multocida isoladas de casos de CA na região sul do Brasil através do desenvolvimento de protocolos de multiplex-PCR. Além disto, o presente estudo visou comparar a capacidade de tipificação capsular do método molecular com testes fenotípicos. Os protocolos de multiplex-PCR desenvolvidos foram capazes de detectar todos os genes propostos. Os genes ompH, oma87, sodC, hgbA, hgbB, exBD-tonB, nanB, hyaD-hyaC estiveram presentes em 100% das amostras (25/25). Os genes sodA e nanH em 96% (24/25), o gene ptfA em 92% (23/25) e o gene pfhA em 60% (15/25). Os genes toxA, bcbD, dcbF não foram identificados em nenhuma das amostras pesquisadas (0/25). A tipificação capsular através do teste molecular apresentou maior capacidade de detecção quando comparada aos testes fenotípicos, pois enquanto 36% (9/25) das amostras não foram identificadas pelo teste convencional, somente 8% (1/25) não foi tipificada através do multiplex-PCR. Foram obtidos seis diferentes perfis genéticos, sendo P1 (negativo para os genes toxA, dcbF e bcbD) o mais comum. Com este trabalho, concluiu-se que os protocolos de multiplex-PCR desenvolvidos tornam-se uma ferramenta bastante útil e rápida para a detecção simultânea dos genes de virulência. Apesar da alta frequência dos genes estudados e de todas as amostras pertencerem à mesma subespécie de P. multocida, foram observados seis perfis genéticos, os quais devem ser confirmados em um estudo com um maior número de amostras. / The current breeding systems in poultry, based on high population density, increases the risk of spread of pathologies, especially respiratory diseases and those whose etiologic agents have more than one host. Fowl Cholera (FC) has these features and generally is presented in an acute form and with high rates of morbidity and mortality. Even though it represents one of the several avian diseases that should be considered in the differential diagnosis of notifiable diseases that course with sudden death, pathogenesis and virulence factors involved in the FC are still poorly understood. The objective of this study was to investigate fifteen genes related with virulence in 25 samples of Pasteurella multocida isolated from FC cases in the southern region of Brazil through the development of multiplex PCR protocols. In addition, this study evaluated the ability of capsular typing comparing the method molecular with phenotypic tests. The multiplex-PCR protocols developed were capable to detect all the proposed genes. The genes ompH, oma87, sodC, hgbA, hgbB, exBD-tonB, nanB, hyaD-hyaC, bcbD and dcbF were present in 100% of the samples (25/25). Gene sodA and nanH in 96% (24/25), ptfA in 92% (23/25) and pfhA in 60% (15/25). Gene toxA, bcbD and dcbF were not identified in any of the samples studied (0/25). The capsular typing by molecular test presented a higher detection capability when compared to phenotypic tests, because while 36% (9/25) of 25 of samples were not identified by conventional testing, only 8% (1/25) was not typified by multiplex–PCR. Six different genetic profiles were obtained and P1 (negative to genes toxA, dcbF and bcbD) was the most common. With this work, it was concluded that the multiplex-PCR protocols developed can be a useful tool for rapid and simultaneous detection of virulence genes. Despite the high frequency of the analyzed genes and that all samples belong to the same subspecies of P. multocida, six genetic profiles were observed, which should be confirmed in a study with a larger number of samples.

O vírus da anemia das galinhas (CAV) pode causar imunodepressão em galinhas de todas as idades e doença nos frangos jovens, a qual é caracterizada por severa anemia, atrofia da medula óssea e hemorragias. A doença clínica é rara hoje, porém a forma subclínica é freqüentemente encontrada em criações comerciais e resulta num considerável decréscimo do desempenho. O CAV apresenta variabilidade genética, entretanto, em relação às amostras brasileiras do CAV, pouco ou quase nada desta variabilidade é conhecida. O presente trabalho descreve um protocolo de Nested-PCR para a detecção do CAV diretamente de amostras clínicas e analisa filogeneticamente as seqüências nucleotídicas das amostras positivas buscando verificar se a patologia apresentada por estas está relacionada com a variabilidade genética. Para a extração de DNA, o método baseado em tiocianato de guanidina mostrou-se mais eficiente e prático de executar que os demais testados. Foi selecionado um par de primers que amplifica uma região de 664 pb do gene vp1 e outro par que amplifica uma região interna de 539 pb para a realização da Nested-PCR. A especificidade dos primers foi avaliada utilizando amostras de lotes controlados para CAV e 30 diferentes isolados de vírus e bactérias causadoras de doenças em galinhas, as quais não geraram produto de amplificação. A sensibilidade foi determinada a partir de diluições seriadas da vacina comercial para o CAV. A Nested-PCR mostrou ser mais sensível do que a PCR e foi capaz de detectar 0,16 DICC50% da cepa vacinal. Além disso, a Nested-PCR detectou DNA viral em tecidos, soro e cama aviária de lotes com e sem sintomas clínicos.O produto de amplificação de 539 pb do gene vp1 de 44 amostras, provenientes de diferentes Estados produtores de frangos do Brasil, foi seqüenciado e foram encontradas 10 novas seqüências nucleotídicas do CAV. Estas 10 seqüências nucleotídicas foram analisadas filogeneticamente pelo método de distância neighbour joining com 1000 replicações o qual, mostrou que não houve correlação entre a patogenia apresentada nos animais e os grupos genéticos. Estas seqüências nucleotídicas também foram comparadas com 30 cepas de CAV isoladas em outros países e não foi observada correlação entre a distribuição geográfica e a variabilidade genética. Substituições de amino ácidos foram observadas em 9 posições sendo que, 65R substituindo o resíduo Q e 98F substituindo o resíduo Y ainda não haviam sido observadas. Conclui-se que, como técnica de detecção do CAV, o protocolo de Nested-PCR aqui descrito é mais sensível e menos trabalhoso do que o isolamento viral. As amostras Brasileiras de CAV possuem características filogenéticas similares às isoladas em outros países.

As aves foram separadas em quatro grupos, dois vacinados e dois não vacinados no 1º dia de vida. As aves foram desafiadas no 1º,4º,7º,10º,13º,16º,19º e 22º dias de vida. A cada dia de desafio eram coletados e medidos, antes e depois, os seguintes itens do grupo: peso relativo da bolsa de Fabrício, diâmetro da bolsa, bolsa de Fabrício para exame histológico e soro para medir os anticorpos contra a DIB, através de Elisa e avaliação clínica da DIB. Os resultados mostraram uma queda de anticorpos sem diferença significativa entre aves vacinadas e não vacinadas. Analisando os diferentes resultados, foi estabelecido que um título de Elisa (log10) de 3,4, foi o ponto de corte entre aves saudáveis e aves doentes. Foram construídas equações de regressão, para o estabelecimento do melhor dia para a vacinação ou do título de Elisa (log10), que as aves podem ter numa determinada idade. Assim sendo, os pintos da Empresa A deveriam receber vacina contra a DIB a partir do 6º - 7º dia, e os da Empresa B deveriam receber a vacina entre o 11º-12º dia de idade. Com os resultados obtidos neste experimento fica claro que as aves não devem ser vacinadas no 1º dia de vida, que o esquema de vacinação das reprodutoras ocasiona diferenças na proteção da progênie e que não se deve aplicar o mesmo esquema de vacinação indiscriminadamente para todos os lotes de frangos.

Os atuais sistemas de criação na avicultura, baseados na alta densidade populacional, aumentam os riscos de disseminação de enfermidades, especialmente das doenças respiratórias e daquelas cujos agentes etiológicos possuem mais de um hospedeiro. A Cólera Aviária (CA) possui estas características e geralmente apresenta-se de forma aguda e com altos índices de morbidade e de mortalidade. Apesar de representar uma das patologias aviárias que deve ser considerada para o diagnóstico diferencial de enfermidades com notificação obrigatória que cursam com morte súbita, a patogenia e os fatores de virulência envolvidos na CA ainda estão pouco elucidados. O objetivo deste trabalho foi pesquisar quinze genes associados à virulência em 25 amostras de Pasteurella multocida isoladas de casos de CA na região sul do Brasil através do desenvolvimento de protocolos de multiplex-PCR. Além disto, o presente estudo visou comparar a capacidade de tipificação capsular do método molecular com testes fenotípicos. Os protocolos de multiplex-PCR desenvolvidos foram capazes de detectar todos os genes propostos. Os genes ompH, oma87, sodC, hgbA, hgbB, exBD-tonB, nanB, hyaD-hyaC estiveram presentes em 100% das amostras (25/25). Os genes sodA e nanH em 96% (24/25), o gene ptfA em 92% (23/25) e o gene pfhA em 60% (15/25). Os genes toxA, bcbD, dcbF não foram identificados em nenhuma das amostras pesquisadas (0/25). A tipificação capsular através do teste molecular apresentou maior capacidade de detecção quando comparada aos testes fenotípicos, pois enquanto 36% (9/25) das amostras não foram identificadas pelo teste convencional, somente 8% (1/25) não foi tipificada através do multiplex-PCR. Foram obtidos seis diferentes perfis genéticos, sendo P1 (negativo para os genes toxA, dcbF e bcbD) o mais comum. Com este trabalho, concluiu-se que os protocolos de multiplex-PCR desenvolvidos tornam-se uma ferramenta bastante útil e rápida para a detecção simultânea dos genes de virulência. Apesar da alta frequência dos genes estudados e de todas as amostras pertencerem à mesma subespécie de P. multocida, foram observados seis perfis genéticos, os quais devem ser confirmados em um estudo com um maior número de amostras. / The current breeding systems in poultry, based on high population density, increases the risk of spread of pathologies, especially respiratory diseases and those whose etiologic agents have more than one host. Fowl Cholera (FC) has these features and generally is presented in an acute form and with high rates of morbidity and mortality. Even though it represents one of the several avian diseases that should be considered in the differential diagnosis of notifiable diseases that course with sudden death, pathogenesis and virulence factors involved in the FC are still poorly understood. The objective of this study was to investigate fifteen genes related with virulence in 25 samples of Pasteurella multocida isolated from FC cases in the southern region of Brazil through the development of multiplex PCR protocols. In addition, this study evaluated the ability of capsular typing comparing the method molecular with phenotypic tests. The multiplex-PCR protocols developed were capable to detect all the proposed genes. The genes ompH, oma87, sodC, hgbA, hgbB, exBD-tonB, nanB, hyaD-hyaC, bcbD and dcbF were present in 100% of the samples (25/25). Gene sodA and nanH in 96% (24/25), ptfA in 92% (23/25) and pfhA in 60% (15/25). Gene toxA, bcbD and dcbF were not identified in any of the samples studied (0/25). The capsular typing by molecular test presented a higher detection capability when compared to phenotypic tests, because while 36% (9/25) of 25 of samples were not identified by conventional testing, only 8% (1/25) was not typified by multiplex–PCR. Six different genetic profiles were obtained and P1 (negative to genes toxA, dcbF and bcbD) was the most common. With this work, it was concluded that the multiplex-PCR protocols developed can be a useful tool for rapid and simultaneous detection of virulence genes. Despite the high frequency of the analyzed genes and that all samples belong to the same subspecies of P. multocida, six genetic profiles were observed, which should be confirmed in a study with a larger number of samples.

As aves foram separadas em quatro grupos, dois vacinados e dois não vacinados no 1º dia de vida. As aves foram desafiadas no 1º,4º,7º,10º,13º,16º,19º e 22º dias de vida. A cada dia de desafio eram coletados e medidos, antes e depois, os seguintes itens do grupo: peso relativo da bolsa de Fabrício, diâmetro da bolsa, bolsa de Fabrício para exame histológico e soro para medir os anticorpos contra a DIB, através de Elisa e avaliação clínica da DIB. Os resultados mostraram uma queda de anticorpos sem diferença significativa entre aves vacinadas e não vacinadas. Analisando os diferentes resultados, foi estabelecido que um título de Elisa (log10) de 3,4, foi o ponto de corte entre aves saudáveis e aves doentes. Foram construídas equações de regressão, para o estabelecimento do melhor dia para a vacinação ou do título de Elisa (log10), que as aves podem ter numa determinada idade. Assim sendo, os pintos da Empresa A deveriam receber vacina contra a DIB a partir do 6º - 7º dia, e os da Empresa B deveriam receber a vacina entre o 11º-12º dia de idade. Com os resultados obtidos neste experimento fica claro que as aves não devem ser vacinadas no 1º dia de vida, que o esquema de vacinação das reprodutoras ocasiona diferenças na proteção da progênie e que não se deve aplicar o mesmo esquema de vacinação indiscriminadamente para todos os lotes de frangos.

O vírus da anemia das galinhas (CAV) pode causar imunodepressão em galinhas de todas as idades e doença nos frangos jovens, a qual é caracterizada por severa anemia, atrofia da medula óssea e hemorragias. A doença clínica é rara hoje, porém a forma subclínica é freqüentemente encontrada em criações comerciais e resulta num considerável decréscimo do desempenho. O CAV apresenta variabilidade genética, entretanto, em relação às amostras brasileiras do CAV, pouco ou quase nada desta variabilidade é conhecida. O presente trabalho descreve um protocolo de Nested-PCR para a detecção do CAV diretamente de amostras clínicas e analisa filogeneticamente as seqüências nucleotídicas das amostras positivas buscando verificar se a patologia apresentada por estas está relacionada com a variabilidade genética. Para a extração de DNA, o método baseado em tiocianato de guanidina mostrou-se mais eficiente e prático de executar que os demais testados. Foi selecionado um par de primers que amplifica uma região de 664 pb do gene vp1 e outro par que amplifica uma região interna de 539 pb para a realização da Nested-PCR. A especificidade dos primers foi avaliada utilizando amostras de lotes controlados para CAV e 30 diferentes isolados de vírus e bactérias causadoras de doenças em galinhas, as quais não geraram produto de amplificação. A sensibilidade foi determinada a partir de diluições seriadas da vacina comercial para o CAV. A Nested-PCR mostrou ser mais sensível do que a PCR e foi capaz de detectar 0,16 DICC50% da cepa vacinal. Além disso, a Nested-PCR detectou DNA viral em tecidos, soro e cama aviária de lotes com e sem sintomas clínicos.O produto de amplificação de 539 pb do gene vp1 de 44 amostras, provenientes de diferentes Estados produtores de frangos do Brasil, foi seqüenciado e foram encontradas 10 novas seqüências nucleotídicas do CAV. Estas 10 seqüências nucleotídicas foram analisadas filogeneticamente pelo método de distância neighbour joining com 1000 replicações o qual, mostrou que não houve correlação entre a patogenia apresentada nos animais e os grupos genéticos. Estas seqüências nucleotídicas também foram comparadas com 30 cepas de CAV isoladas em outros países e não foi observada correlação entre a distribuição geográfica e a variabilidade genética. Substituições de amino ácidos foram observadas em 9 posições sendo que, 65R substituindo o resíduo Q e 98F substituindo o resíduo Y ainda não haviam sido observadas. Conclui-se que, como técnica de detecção do CAV, o protocolo de Nested-PCR aqui descrito é mais sensível e menos trabalhoso do que o isolamento viral. As amostras Brasileiras de CAV possuem características filogenéticas similares às isoladas em outros países.

Orientador: Wanderley Dias da Silveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T07:50:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silveira_Flavio_M.pdf: 7271586 bytes, checksum: 61c4ca3b97e4b7443d820cd714394fa8 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The abstract is available with the full electronic document / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular