As doenças respiratórias são bastante comuns na avicultura industrial, entre as quais a bronquite infecciosa das galinhas (BIG) é uma doença de importância econômica. A doença é causada pelo vírus da bronquite infecciosa (VBI) e gera grandes perdas em todas as etapas do processo de produção de aves, seja em frangos de corte, reprodutores e/ou poedeiras. Além do quadro respiratório, o VBI pode se apresentar de outras formas clínicas. As diferentes cepas do vírus possuem tropismo diferenciado pelos sistemas digestório, reprodutivo e urinário. Diversos dados recentes de caracterização genética do vírus no país demonstram a ocorrência de um único genótipo variante no Brasil (BR-I), além do genótipo vacinal Massachusetts (Mass). No entanto, pouco se sabe sobre a frequência e distribuição tecidual destas variantes nos plantéis brasileiros. A presente dissertação é composta por dois artigos científicos sobre este tema. O objetivo do primeiro trabalho foi avaliar os genótipos de ocorrência em lotes de comercialização industrial no país. Para isso, foram obtidas amostras de lotes da Região Sul, Sudeste, Centro-Oeste e Nordeste do país. A caracterização foi realizada a partir do sequenciamento parcial do gene S de 49 amostras que foram comparadas com sequências de referência do GenBank e de isolados de campo do país. Onze amostras (22,4%) foram filogeneticamente similares ao genótipo vacinal Mass e 34 amostras (69,4%) agruparam com o genótipo brasileiro, previamente descrito, denominado BR-I. No entanto, quatro amostras (8,2%) formaram um novo grupo, denominado BR-II. Estes resultados demonstram a maior ocorrência do genótipo variante de campo tipicamente brasileiro. O segundo trabalho teve por objetivo determinar a frequência do VBI em diferentes regiões do país, além de determinar a frequência dos genótipos brasileiros em duas categorias de aves (frangos de corte e matrizes), de diferentes idades e nos diferentes sistemas fisiológicos infectados pelo VBI. Para isso, foram obtidos pools de órgãos de 198 lotes de frangos e 234 lotes de matrizes com sinais clínicos de BIG, das regiões Sul, Centro-Oeste e Nordeste do país. A detecção do VBI foi realizada por real time RT-PCR (qRT-PCR) da região 5’ UTR e a determinação dos genótipos por sequenciamento parcial do gene S1. Os resultados demonstraram frequência similar do VBI nas granjas das diferentes regiões do país, com índice maior em frangos de corte (média de 54%) do que em matrizes (média de 30,8%). O VBI foi detectado em aves de todas as idades, no entanto, o genótipo Mass foi mais frequentemente encontrado em frangos de até quatro semanas de idade, em frangos com idade próxima ao abate (> 4semanas) e matrizes houve o predomínio do genótipo BR. O sistema com maior frequência de detecção do VBI, em matrizes, foi o digestório (40%), com diferença significativa. Em frangos, a frequência de detecção nos sistemas digestório (43,5%) e respiratório (37,7%) não apresentou diferença significativa. Estes resultados demonstram a alta frequência dos genótipos brasileiros nos plantéis, sendo encontrados principalmente nos órgãos do sistema digestivo. / Infectious bronchitis (IB) is one of the most important respiratory diseases in the poultry industry. The agent, infectious bronchitis virus (IBV), generates losses in all stages of the poultry production (broilers, breeders and/or layers). Besides respiratory signs, IBV may present other different clinical forms: digestive, reproductive and urinary. IBV presents also a high genetic diversity among strains in different poultry-producing regions of the world. Recent studies demonstrate a large dissemination of local variant strains in Brazil (genotype BR-I), but the vaccine genotype Massachusetts (Mass) is also frequently found in poultry flocks. The present Masters Dissertation has two scientific articles on this topic. The aim of the first study was to evaluate the genotypes occurring in industrial poultry production flocks in Brazil. Samples of poultry flocks were obtained from different regions (South, Southeast, Midwest and Northeast). Molecular characterization was performed by partial sequencing of the S gene and comparison with reference (obtained in Genbank database) and field isolates sequences. Eleven samples (22.4%) were phylogenetically similar to Mass vaccine genotype and 34 samples (69.4%) grouped with the BR-I genotype. However, four samples (8.2%) originated a new group, denominated BR-II. These results demonstrate a high prevalence of the variant genotype BR-I in Brazil and the emergence of the novel BR-II genotype in the Midwest region. The second study aimed to determine the occurrence of IBV in different regions of the country and to evaluate the viral frequency in two poultry production types of birds (broilers and breeders), in different ages and in different physiological systems. Organs pools were collected from 198 broilers and 234 breeder flocks with IB clinical signs and from the three different Brazilian geographic regions: South, Midwest and Northeast. IBV detection was carried out by real time RT-PCR (qRT-PCR) of the 5' untranslated region and genotyping by partial sequencing of the S1 gene. The results showed similar IBV frequency on farms of different regions of the country with a higher rate in broilers (average 54%) than in breeders (mean 30.8%). IBV was detected in birds of all ages. Mass genotype was more often found in chickens up to four weeks of age, while BR genotypes were more frequent in broilers next to slaughter age and in all ages of breeders. The system with highest frequency of IBV was the digestive (40%) in breeders. In broilers, the frequency of detection in the digestive (43.5%) and respiratory (37.7%) systems showed no significant difference. These results demonstrate the high frequency of the Brazilian genotypes in the flocks, being found mainly in the organs of the digestive system.

As doenças respiratórias são bastante comuns na avicultura industrial, entre as quais a bronquite infecciosa das galinhas (BIG) é uma doença de importância econômica. A doença é causada pelo vírus da bronquite infecciosa (VBI) e gera grandes perdas em todas as etapas do processo de produção de aves, seja em frangos de corte, reprodutores e/ou poedeiras. Além do quadro respiratório, o VBI pode se apresentar de outras formas clínicas. As diferentes cepas do vírus possuem tropismo diferenciado pelos sistemas digestório, reprodutivo e urinário. Diversos dados recentes de caracterização genética do vírus no país demonstram a ocorrência de um único genótipo variante no Brasil (BR-I), além do genótipo vacinal Massachusetts (Mass). No entanto, pouco se sabe sobre a frequência e distribuição tecidual destas variantes nos plantéis brasileiros. A presente dissertação é composta por dois artigos científicos sobre este tema. O objetivo do primeiro trabalho foi avaliar os genótipos de ocorrência em lotes de comercialização industrial no país. Para isso, foram obtidas amostras de lotes da Região Sul, Sudeste, Centro-Oeste e Nordeste do país. A caracterização foi realizada a partir do sequenciamento parcial do gene S de 49 amostras que foram comparadas com sequências de referência do GenBank e de isolados de campo do país. Onze amostras (22,4%) foram filogeneticamente similares ao genótipo vacinal Mass e 34 amostras (69,4%) agruparam com o genótipo brasileiro, previamente descrito, denominado BR-I. No entanto, quatro amostras (8,2%) formaram um novo grupo, denominado BR-II. Estes resultados demonstram a maior ocorrência do genótipo variante de campo tipicamente brasileiro. O segundo trabalho teve por objetivo determinar a frequência do VBI em diferentes regiões do país, além de determinar a frequência dos genótipos brasileiros em duas categorias de aves (frangos de corte e matrizes), de diferentes idades e nos diferentes sistemas fisiológicos infectados pelo VBI. Para isso, foram obtidos pools de órgãos de 198 lotes de frangos e 234 lotes de matrizes com sinais clínicos de BIG, das regiões Sul, Centro-Oeste e Nordeste do país. A detecção do VBI foi realizada por real time RT-PCR (qRT-PCR) da região 5’ UTR e a determinação dos genótipos por sequenciamento parcial do gene S1. Os resultados demonstraram frequência similar do VBI nas granjas das diferentes regiões do país, com índice maior em frangos de corte (média de 54%) do que em matrizes (média de 30,8%). O VBI foi detectado em aves de todas as idades, no entanto, o genótipo Mass foi mais frequentemente encontrado em frangos de até quatro semanas de idade, em frangos com idade próxima ao abate (> 4semanas) e matrizes houve o predomínio do genótipo BR. O sistema com maior frequência de detecção do VBI, em matrizes, foi o digestório (40%), com diferença significativa. Em frangos, a frequência de detecção nos sistemas digestório (43,5%) e respiratório (37,7%) não apresentou diferença significativa. Estes resultados demonstram a alta frequência dos genótipos brasileiros nos plantéis, sendo encontrados principalmente nos órgãos do sistema digestivo. / Infectious bronchitis (IB) is one of the most important respiratory diseases in the poultry industry. The agent, infectious bronchitis virus (IBV), generates losses in all stages of the poultry production (broilers, breeders and/or layers). Besides respiratory signs, IBV may present other different clinical forms: digestive, reproductive and urinary. IBV presents also a high genetic diversity among strains in different poultry-producing regions of the world. Recent studies demonstrate a large dissemination of local variant strains in Brazil (genotype BR-I), but the vaccine genotype Massachusetts (Mass) is also frequently found in poultry flocks. The present Masters Dissertation has two scientific articles on this topic. The aim of the first study was to evaluate the genotypes occurring in industrial poultry production flocks in Brazil. Samples of poultry flocks were obtained from different regions (South, Southeast, Midwest and Northeast). Molecular characterization was performed by partial sequencing of the S gene and comparison with reference (obtained in Genbank database) and field isolates sequences. Eleven samples (22.4%) were phylogenetically similar to Mass vaccine genotype and 34 samples (69.4%) grouped with the BR-I genotype. However, four samples (8.2%) originated a new group, denominated BR-II. These results demonstrate a high prevalence of the variant genotype BR-I in Brazil and the emergence of the novel BR-II genotype in the Midwest region. The second study aimed to determine the occurrence of IBV in different regions of the country and to evaluate the viral frequency in two poultry production types of birds (broilers and breeders), in different ages and in different physiological systems. Organs pools were collected from 198 broilers and 234 breeder flocks with IB clinical signs and from the three different Brazilian geographic regions: South, Midwest and Northeast. IBV detection was carried out by real time RT-PCR (qRT-PCR) of the 5' untranslated region and genotyping by partial sequencing of the S1 gene. The results showed similar IBV frequency on farms of different regions of the country with a higher rate in broilers (average 54%) than in breeders (mean 30.8%). IBV was detected in birds of all ages. Mass genotype was more often found in chickens up to four weeks of age, while BR genotypes were more frequent in broilers next to slaughter age and in all ages of breeders. The system with highest frequency of IBV was the digestive (40%) in breeders. In broilers, the frequency of detection in the digestive (43.5%) and respiratory (37.7%) systems showed no significant difference. These results demonstrate the high frequency of the Brazilian genotypes in the flocks, being found mainly in the organs of the digestive system.

As doenças respiratórias são bastante comuns na avicultura industrial, entre as quais a bronquite infecciosa das galinhas (BIG) é uma doença de importância econômica. A doença é causada pelo vírus da bronquite infecciosa (VBI) e gera grandes perdas em todas as etapas do processo de produção de aves, seja em frangos de corte, reprodutores e/ou poedeiras. Além do quadro respiratório, o VBI pode se apresentar de outras formas clínicas. As diferentes cepas do vírus possuem tropismo diferenciado pelos sistemas digestório, reprodutivo e urinário. Diversos dados recentes de caracterização genética do vírus no país demonstram a ocorrência de um único genótipo variante no Brasil (BR-I), além do genótipo vacinal Massachusetts (Mass). No entanto, pouco se sabe sobre a frequência e distribuição tecidual destas variantes nos plantéis brasileiros. A presente dissertação é composta por dois artigos científicos sobre este tema. O objetivo do primeiro trabalho foi avaliar os genótipos de ocorrência em lotes de comercialização industrial no país. Para isso, foram obtidas amostras de lotes da Região Sul, Sudeste, Centro-Oeste e Nordeste do país. A caracterização foi realizada a partir do sequenciamento parcial do gene S de 49 amostras que foram comparadas com sequências de referência do GenBank e de isolados de campo do país. Onze amostras (22,4%) foram filogeneticamente similares ao genótipo vacinal Mass e 34 amostras (69,4%) agruparam com o genótipo brasileiro, previamente descrito, denominado BR-I. No entanto, quatro amostras (8,2%) formaram um novo grupo, denominado BR-II. Estes resultados demonstram a maior ocorrência do genótipo variante de campo tipicamente brasileiro. O segundo trabalho teve por objetivo determinar a frequência do VBI em diferentes regiões do país, além de determinar a frequência dos genótipos brasileiros em duas categorias de aves (frangos de corte e matrizes), de diferentes idades e nos diferentes sistemas fisiológicos infectados pelo VBI. Para isso, foram obtidos pools de órgãos de 198 lotes de frangos e 234 lotes de matrizes com sinais clínicos de BIG, das regiões Sul, Centro-Oeste e Nordeste do país. A detecção do VBI foi realizada por real time RT-PCR (qRT-PCR) da região 5’ UTR e a determinação dos genótipos por sequenciamento parcial do gene S1. Os resultados demonstraram frequência similar do VBI nas granjas das diferentes regiões do país, com índice maior em frangos de corte (média de 54%) do que em matrizes (média de 30,8%). O VBI foi detectado em aves de todas as idades, no entanto, o genótipo Mass foi mais frequentemente encontrado em frangos de até quatro semanas de idade, em frangos com idade próxima ao abate (> 4semanas) e matrizes houve o predomínio do genótipo BR. O sistema com maior frequência de detecção do VBI, em matrizes, foi o digestório (40%), com diferença significativa. Em frangos, a frequência de detecção nos sistemas digestório (43,5%) e respiratório (37,7%) não apresentou diferença significativa. Estes resultados demonstram a alta frequência dos genótipos brasileiros nos plantéis, sendo encontrados principalmente nos órgãos do sistema digestivo. / Infectious bronchitis (IB) is one of the most important respiratory diseases in the poultry industry. The agent, infectious bronchitis virus (IBV), generates losses in all stages of the poultry production (broilers, breeders and/or layers). Besides respiratory signs, IBV may present other different clinical forms: digestive, reproductive and urinary. IBV presents also a high genetic diversity among strains in different poultry-producing regions of the world. Recent studies demonstrate a large dissemination of local variant strains in Brazil (genotype BR-I), but the vaccine genotype Massachusetts (Mass) is also frequently found in poultry flocks. The present Masters Dissertation has two scientific articles on this topic. The aim of the first study was to evaluate the genotypes occurring in industrial poultry production flocks in Brazil. Samples of poultry flocks were obtained from different regions (South, Southeast, Midwest and Northeast). Molecular characterization was performed by partial sequencing of the S gene and comparison with reference (obtained in Genbank database) and field isolates sequences. Eleven samples (22.4%) were phylogenetically similar to Mass vaccine genotype and 34 samples (69.4%) grouped with the BR-I genotype. However, four samples (8.2%) originated a new group, denominated BR-II. These results demonstrate a high prevalence of the variant genotype BR-I in Brazil and the emergence of the novel BR-II genotype in the Midwest region. The second study aimed to determine the occurrence of IBV in different regions of the country and to evaluate the viral frequency in two poultry production types of birds (broilers and breeders), in different ages and in different physiological systems. Organs pools were collected from 198 broilers and 234 breeder flocks with IB clinical signs and from the three different Brazilian geographic regions: South, Midwest and Northeast. IBV detection was carried out by real time RT-PCR (qRT-PCR) of the 5' untranslated region and genotyping by partial sequencing of the S1 gene. The results showed similar IBV frequency on farms of different regions of the country with a higher rate in broilers (average 54%) than in breeders (mean 30.8%). IBV was detected in birds of all ages. Mass genotype was more often found in chickens up to four weeks of age, while BR genotypes were more frequent in broilers next to slaughter age and in all ages of breeders. The system with highest frequency of IBV was the digestive (40%) in breeders. In broilers, the frequency of detection in the digestive (43.5%) and respiratory (37.7%) systems showed no significant difference. These results demonstrate the high frequency of the Brazilian genotypes in the flocks, being found mainly in the organs of the digestive system.

O vírus da anemia das galinhas (CAV) pode causar imunodepressão em galinhas de todas as idades e doença nos frangos jovens, a qual é caracterizada por severa anemia, atrofia da medula óssea e hemorragias. A doença clínica é rara hoje, porém a forma subclínica é freqüentemente encontrada em criações comerciais e resulta num considerável decréscimo do desempenho. O CAV apresenta variabilidade genética, entretanto, em relação às amostras brasileiras do CAV, pouco ou quase nada desta variabilidade é conhecida. O presente trabalho descreve um protocolo de Nested-PCR para a detecção do CAV diretamente de amostras clínicas e analisa filogeneticamente as seqüências nucleotídicas das amostras positivas buscando verificar se a patologia apresentada por estas está relacionada com a variabilidade genética. Para a extração de DNA, o método baseado em tiocianato de guanidina mostrou-se mais eficiente e prático de executar que os demais testados. Foi selecionado um par de primers que amplifica uma região de 664 pb do gene vp1 e outro par que amplifica uma região interna de 539 pb para a realização da Nested-PCR. A especificidade dos primers foi avaliada utilizando amostras de lotes controlados para CAV e 30 diferentes isolados de vírus e bactérias causadoras de doenças em galinhas, as quais não geraram produto de amplificação. A sensibilidade foi determinada a partir de diluições seriadas da vacina comercial para o CAV. A Nested-PCR mostrou ser mais sensível do que a PCR e foi capaz de detectar 0,16 DICC50% da cepa vacinal. Além disso, a Nested-PCR detectou DNA viral em tecidos, soro e cama aviária de lotes com e sem sintomas clínicos.O produto de amplificação de 539 pb do gene vp1 de 44 amostras, provenientes de diferentes Estados produtores de frangos do Brasil, foi seqüenciado e foram encontradas 10 novas seqüências nucleotídicas do CAV. Estas 10 seqüências nucleotídicas foram analisadas filogeneticamente pelo método de distância neighbour joining com 1000 replicações o qual, mostrou que não houve correlação entre a patogenia apresentada nos animais e os grupos genéticos. Estas seqüências nucleotídicas também foram comparadas com 30 cepas de CAV isoladas em outros países e não foi observada correlação entre a distribuição geográfica e a variabilidade genética. Substituições de amino ácidos foram observadas em 9 posições sendo que, 65R substituindo o resíduo Q e 98F substituindo o resíduo Y ainda não haviam sido observadas. Conclui-se que, como técnica de detecção do CAV, o protocolo de Nested-PCR aqui descrito é mais sensível e menos trabalhoso do que o isolamento viral. As amostras Brasileiras de CAV possuem características filogenéticas similares às isoladas em outros países.

O vírus da anemia das galinhas (CAV) pode causar imunodepressão em galinhas de todas as idades e doença nos frangos jovens, a qual é caracterizada por severa anemia, atrofia da medula óssea e hemorragias. A doença clínica é rara hoje, porém a forma subclínica é freqüentemente encontrada em criações comerciais e resulta num considerável decréscimo do desempenho. O CAV apresenta variabilidade genética, entretanto, em relação às amostras brasileiras do CAV, pouco ou quase nada desta variabilidade é conhecida. O presente trabalho descreve um protocolo de Nested-PCR para a detecção do CAV diretamente de amostras clínicas e analisa filogeneticamente as seqüências nucleotídicas das amostras positivas buscando verificar se a patologia apresentada por estas está relacionada com a variabilidade genética. Para a extração de DNA, o método baseado em tiocianato de guanidina mostrou-se mais eficiente e prático de executar que os demais testados. Foi selecionado um par de primers que amplifica uma região de 664 pb do gene vp1 e outro par que amplifica uma região interna de 539 pb para a realização da Nested-PCR. A especificidade dos primers foi avaliada utilizando amostras de lotes controlados para CAV e 30 diferentes isolados de vírus e bactérias causadoras de doenças em galinhas, as quais não geraram produto de amplificação. A sensibilidade foi determinada a partir de diluições seriadas da vacina comercial para o CAV. A Nested-PCR mostrou ser mais sensível do que a PCR e foi capaz de detectar 0,16 DICC50% da cepa vacinal. Além disso, a Nested-PCR detectou DNA viral em tecidos, soro e cama aviária de lotes com e sem sintomas clínicos.O produto de amplificação de 539 pb do gene vp1 de 44 amostras, provenientes de diferentes Estados produtores de frangos do Brasil, foi seqüenciado e foram encontradas 10 novas seqüências nucleotídicas do CAV. Estas 10 seqüências nucleotídicas foram analisadas filogeneticamente pelo método de distância neighbour joining com 1000 replicações o qual, mostrou que não houve correlação entre a patogenia apresentada nos animais e os grupos genéticos. Estas seqüências nucleotídicas também foram comparadas com 30 cepas de CAV isoladas em outros países e não foi observada correlação entre a distribuição geográfica e a variabilidade genética. Substituições de amino ácidos foram observadas em 9 posições sendo que, 65R substituindo o resíduo Q e 98F substituindo o resíduo Y ainda não haviam sido observadas. Conclui-se que, como técnica de detecção do CAV, o protocolo de Nested-PCR aqui descrito é mais sensível e menos trabalhoso do que o isolamento viral. As amostras Brasileiras de CAV possuem características filogenéticas similares às isoladas em outros países.

O vírus da anemia das galinhas (CAV) pode causar imunodepressão em galinhas de todas as idades e doença nos frangos jovens, a qual é caracterizada por severa anemia, atrofia da medula óssea e hemorragias. A doença clínica é rara hoje, porém a forma subclínica é freqüentemente encontrada em criações comerciais e resulta num considerável decréscimo do desempenho. O CAV apresenta variabilidade genética, entretanto, em relação às amostras brasileiras do CAV, pouco ou quase nada desta variabilidade é conhecida. O presente trabalho descreve um protocolo de Nested-PCR para a detecção do CAV diretamente de amostras clínicas e analisa filogeneticamente as seqüências nucleotídicas das amostras positivas buscando verificar se a patologia apresentada por estas está relacionada com a variabilidade genética. Para a extração de DNA, o método baseado em tiocianato de guanidina mostrou-se mais eficiente e prático de executar que os demais testados. Foi selecionado um par de primers que amplifica uma região de 664 pb do gene vp1 e outro par que amplifica uma região interna de 539 pb para a realização da Nested-PCR. A especificidade dos primers foi avaliada utilizando amostras de lotes controlados para CAV e 30 diferentes isolados de vírus e bactérias causadoras de doenças em galinhas, as quais não geraram produto de amplificação. A sensibilidade foi determinada a partir de diluições seriadas da vacina comercial para o CAV. A Nested-PCR mostrou ser mais sensível do que a PCR e foi capaz de detectar 0,16 DICC50% da cepa vacinal. Além disso, a Nested-PCR detectou DNA viral em tecidos, soro e cama aviária de lotes com e sem sintomas clínicos.O produto de amplificação de 539 pb do gene vp1 de 44 amostras, provenientes de diferentes Estados produtores de frangos do Brasil, foi seqüenciado e foram encontradas 10 novas seqüências nucleotídicas do CAV. Estas 10 seqüências nucleotídicas foram analisadas filogeneticamente pelo método de distância neighbour joining com 1000 replicações o qual, mostrou que não houve correlação entre a patogenia apresentada nos animais e os grupos genéticos. Estas seqüências nucleotídicas também foram comparadas com 30 cepas de CAV isoladas em outros países e não foi observada correlação entre a distribuição geográfica e a variabilidade genética. Substituições de amino ácidos foram observadas em 9 posições sendo que, 65R substituindo o resíduo Q e 98F substituindo o resíduo Y ainda não haviam sido observadas. Conclui-se que, como técnica de detecção do CAV, o protocolo de Nested-PCR aqui descrito é mais sensível e menos trabalhoso do que o isolamento viral. As amostras Brasileiras de CAV possuem características filogenéticas similares às isoladas em outros países.

A presente tese versa sobre estudos realizados visando a identificação de novos agentes virais em frangos comerciais. No primeiro capítulo, a identificação do girovírus aviário tipo 2 (AGV2) é reportada. Um genoma viral de 2383 nt foi amplificado a partir soros de frangos comerciais por amplificação randômica de DNA. A análise da sequência do produto amplificado, revelou que cerca de 40% das sequencias de nucleotídeos apresentavam similaridade com o genoma do vírus da anemia infecciosa das galinhas (CAV). Dado o baixo grau de identidade com o CAV, o genoma identificado justificou a proposição de um novo tipo de vírus, dentro do gênero gyrovírus foi denominado “girovírus aviário tipo 2” (AGV2). O genoma do AGV2 tem organização semelhante a do CAV, com percentagens de similitude de aminoácidos nas regiões codificantes, correspondentes às proteínas virais VP1, VP2 e VP3 do CAV de 38,8%, 40,3% e 32,2%, respectivamente. A fim de analisar a amplitude da disseminação deste agente, foi realizado um estudo para identificar a ocorrência do AGV2 em granjas de frangos de outras regiões. Para atingir esse objetivo, uma PCR específica ao AGV2 foi desenvolvida para amplificar o DNA viral extraído de bulbos de penas da asa e órgãos de frangos. Essa técnica permitiu a detecção do AGV2 em aves de outros locais na Região Sul do Brasil. O DNA viral foi detectado em 90,7% (98/108) das amostras coletadas no estado do Rio Grande do Sul e 60,4% (29/48) das amostras do estado de Santa Catarina. Os mesmo primers da PCR foram adaptados para examinar tecidos de cérebro de galinhas da Holanda. Nessas amostras o DNA do AGV2 foi detectado em nove das 21 (42,9%) amostras de tecidos cerebrais em aves com lesões hemorrágicas. Essas descobertas fornecem evidências de que infecções de AGV2 são generalizadas e não se restringem a Região Sul do Brasil. Além disso, esses estudos permitiram a identificação de variantes do DNA genômico do AGV2. Análises filogenéticas demostraram que os genomas examinados poderiam ser divididos em três grupos, com base em diferenças nos genes das ORFs das proteínas VP2 e VP3. Em conclusão, a presente tese abrange estudos da identificação de um vírus aviário, até então desconhecido, denominado girovírus aviário tipo 2, que encontra-se amplamente distribuído. A associação deste agente com enfermidades em aves será tema de estudos que estão sendo realizados. / This thesis concerns studies carried out in search for new viral agents in commercial poultry flocks. In the first chapter, the identification of the genome of avian gyrovirus type 2 (AGV2), a new Gyrovirus, is reported. The viral genome the 2383-nucleotide sequence was amplified from sera of commercial broilers by random DNA amplification. Sequence analysis of the amplified product showed that the putative viral sequence had about 40% nucleotide similarity with the genome of its closest relative, chicken anemia virus (CAV). Such low degree of nucleotide similarity justified its classification as a new virus type within the genus, to which the name avian gyrovirus type 2. The amino acid similarity between the predicted viral proteins VP1, VP2 and VP3 of AGV2 and those of CAV was 38.8%, 40.3%, and 32.2%, respectively. In order to examine the amplitude of dissemination of this agent, it became necessary to carry out a search for AGV2 genomes in poultry flocks from other regions. To achieve such objective, an AGV2-specific PCR was designed to amplify viral DNA from nuclei acid extracted from poultry feather shafts. This allowed detection of AGV2 genomes in flocks from other locations in Southern Brazil. Viral DNA was detected in 98/108 (90.7%) of samples collected in the state of Rio Grande do Sul and 29/48 (60.4%) of the samples collected in the state of Santa Catarina. The same PCR primers were adapted to examine brain tissues of chickens from the Netherlands. In such samples, AGV2 DNA was detected in nine out of 21 (42.9%) brain tissue samples from birds with haemorragic lesions. These findings provided evidence that AGV2 infections are widespread and are not restricted to Southern Brazil. In addition, these studies allowed the identification of genomic variants of AGV2. Phylogenetic analyses demonstrated that such genomes could be divided into three clusters. In conclusion, this thesis encompasses studies on the identification of a previously unreported virus, named avian gyrovirus 2, which was later shown to be widely distributed. The relationship between this agent and disease in poultry will be subject of further studies which are being performed in continuation to this work.

A presente tese versa sobre estudos realizados visando a identificação de novos agentes virais em frangos comerciais. No primeiro capítulo, a identificação do girovírus aviário tipo 2 (AGV2) é reportada. Um genoma viral de 2383 nt foi amplificado a partir soros de frangos comerciais por amplificação randômica de DNA. A análise da sequência do produto amplificado, revelou que cerca de 40% das sequencias de nucleotídeos apresentavam similaridade com o genoma do vírus da anemia infecciosa das galinhas (CAV). Dado o baixo grau de identidade com o CAV, o genoma identificado justificou a proposição de um novo tipo de vírus, dentro do gênero gyrovírus foi denominado “girovírus aviário tipo 2” (AGV2). O genoma do AGV2 tem organização semelhante a do CAV, com percentagens de similitude de aminoácidos nas regiões codificantes, correspondentes às proteínas virais VP1, VP2 e VP3 do CAV de 38,8%, 40,3% e 32,2%, respectivamente. A fim de analisar a amplitude da disseminação deste agente, foi realizado um estudo para identificar a ocorrência do AGV2 em granjas de frangos de outras regiões. Para atingir esse objetivo, uma PCR específica ao AGV2 foi desenvolvida para amplificar o DNA viral extraído de bulbos de penas da asa e órgãos de frangos. Essa técnica permitiu a detecção do AGV2 em aves de outros locais na Região Sul do Brasil. O DNA viral foi detectado em 90,7% (98/108) das amostras coletadas no estado do Rio Grande do Sul e 60,4% (29/48) das amostras do estado de Santa Catarina. Os mesmo primers da PCR foram adaptados para examinar tecidos de cérebro de galinhas da Holanda. Nessas amostras o DNA do AGV2 foi detectado em nove das 21 (42,9%) amostras de tecidos cerebrais em aves com lesões hemorrágicas. Essas descobertas fornecem evidências de que infecções de AGV2 são generalizadas e não se restringem a Região Sul do Brasil. Além disso, esses estudos permitiram a identificação de variantes do DNA genômico do AGV2. Análises filogenéticas demostraram que os genomas examinados poderiam ser divididos em três grupos, com base em diferenças nos genes das ORFs das proteínas VP2 e VP3. Em conclusão, a presente tese abrange estudos da identificação de um vírus aviário, até então desconhecido, denominado girovírus aviário tipo 2, que encontra-se amplamente distribuído. A associação deste agente com enfermidades em aves será tema de estudos que estão sendo realizados. / This thesis concerns studies carried out in search for new viral agents in commercial poultry flocks. In the first chapter, the identification of the genome of avian gyrovirus type 2 (AGV2), a new Gyrovirus, is reported. The viral genome the 2383-nucleotide sequence was amplified from sera of commercial broilers by random DNA amplification. Sequence analysis of the amplified product showed that the putative viral sequence had about 40% nucleotide similarity with the genome of its closest relative, chicken anemia virus (CAV). Such low degree of nucleotide similarity justified its classification as a new virus type within the genus, to which the name avian gyrovirus type 2. The amino acid similarity between the predicted viral proteins VP1, VP2 and VP3 of AGV2 and those of CAV was 38.8%, 40.3%, and 32.2%, respectively. In order to examine the amplitude of dissemination of this agent, it became necessary to carry out a search for AGV2 genomes in poultry flocks from other regions. To achieve such objective, an AGV2-specific PCR was designed to amplify viral DNA from nuclei acid extracted from poultry feather shafts. This allowed detection of AGV2 genomes in flocks from other locations in Southern Brazil. Viral DNA was detected in 98/108 (90.7%) of samples collected in the state of Rio Grande do Sul and 29/48 (60.4%) of the samples collected in the state of Santa Catarina. The same PCR primers were adapted to examine brain tissues of chickens from the Netherlands. In such samples, AGV2 DNA was detected in nine out of 21 (42.9%) brain tissue samples from birds with haemorragic lesions. These findings provided evidence that AGV2 infections are widespread and are not restricted to Southern Brazil. In addition, these studies allowed the identification of genomic variants of AGV2. Phylogenetic analyses demonstrated that such genomes could be divided into three clusters. In conclusion, this thesis encompasses studies on the identification of a previously unreported virus, named avian gyrovirus 2, which was later shown to be widely distributed. The relationship between this agent and disease in poultry will be subject of further studies which are being performed in continuation to this work.

A presente tese versa sobre estudos realizados visando a identificação de novos agentes virais em frangos comerciais. No primeiro capítulo, a identificação do girovírus aviário tipo 2 (AGV2) é reportada. Um genoma viral de 2383 nt foi amplificado a partir soros de frangos comerciais por amplificação randômica de DNA. A análise da sequência do produto amplificado, revelou que cerca de 40% das sequencias de nucleotídeos apresentavam similaridade com o genoma do vírus da anemia infecciosa das galinhas (CAV). Dado o baixo grau de identidade com o CAV, o genoma identificado justificou a proposição de um novo tipo de vírus, dentro do gênero gyrovírus foi denominado “girovírus aviário tipo 2” (AGV2). O genoma do AGV2 tem organização semelhante a do CAV, com percentagens de similitude de aminoácidos nas regiões codificantes, correspondentes às proteínas virais VP1, VP2 e VP3 do CAV de 38,8%, 40,3% e 32,2%, respectivamente. A fim de analisar a amplitude da disseminação deste agente, foi realizado um estudo para identificar a ocorrência do AGV2 em granjas de frangos de outras regiões. Para atingir esse objetivo, uma PCR específica ao AGV2 foi desenvolvida para amplificar o DNA viral extraído de bulbos de penas da asa e órgãos de frangos. Essa técnica permitiu a detecção do AGV2 em aves de outros locais na Região Sul do Brasil. O DNA viral foi detectado em 90,7% (98/108) das amostras coletadas no estado do Rio Grande do Sul e 60,4% (29/48) das amostras do estado de Santa Catarina. Os mesmo primers da PCR foram adaptados para examinar tecidos de cérebro de galinhas da Holanda. Nessas amostras o DNA do AGV2 foi detectado em nove das 21 (42,9%) amostras de tecidos cerebrais em aves com lesões hemorrágicas. Essas descobertas fornecem evidências de que infecções de AGV2 são generalizadas e não se restringem a Região Sul do Brasil. Além disso, esses estudos permitiram a identificação de variantes do DNA genômico do AGV2. Análises filogenéticas demostraram que os genomas examinados poderiam ser divididos em três grupos, com base em diferenças nos genes das ORFs das proteínas VP2 e VP3. Em conclusão, a presente tese abrange estudos da identificação de um vírus aviário, até então desconhecido, denominado girovírus aviário tipo 2, que encontra-se amplamente distribuído. A associação deste agente com enfermidades em aves será tema de estudos que estão sendo realizados. / This thesis concerns studies carried out in search for new viral agents in commercial poultry flocks. In the first chapter, the identification of the genome of avian gyrovirus type 2 (AGV2), a new Gyrovirus, is reported. The viral genome the 2383-nucleotide sequence was amplified from sera of commercial broilers by random DNA amplification. Sequence analysis of the amplified product showed that the putative viral sequence had about 40% nucleotide similarity with the genome of its closest relative, chicken anemia virus (CAV). Such low degree of nucleotide similarity justified its classification as a new virus type within the genus, to which the name avian gyrovirus type 2. The amino acid similarity between the predicted viral proteins VP1, VP2 and VP3 of AGV2 and those of CAV was 38.8%, 40.3%, and 32.2%, respectively. In order to examine the amplitude of dissemination of this agent, it became necessary to carry out a search for AGV2 genomes in poultry flocks from other regions. To achieve such objective, an AGV2-specific PCR was designed to amplify viral DNA from nuclei acid extracted from poultry feather shafts. This allowed detection of AGV2 genomes in flocks from other locations in Southern Brazil. Viral DNA was detected in 98/108 (90.7%) of samples collected in the state of Rio Grande do Sul and 29/48 (60.4%) of the samples collected in the state of Santa Catarina. The same PCR primers were adapted to examine brain tissues of chickens from the Netherlands. In such samples, AGV2 DNA was detected in nine out of 21 (42.9%) brain tissue samples from birds with haemorragic lesions. These findings provided evidence that AGV2 infections are widespread and are not restricted to Southern Brazil. In addition, these studies allowed the identification of genomic variants of AGV2. Phylogenetic analyses demonstrated that such genomes could be divided into three clusters. In conclusion, this thesis encompasses studies on the identification of a previously unreported virus, named avian gyrovirus 2, which was later shown to be widely distributed. The relationship between this agent and disease in poultry will be subject of further studies which are being performed in continuation to this work.

A demanda por carne de frango vem crescendo globalmente, assim como as exigências com relação à qualidade microbiológica do produto final. Associa-se a frequência de Campylobacter spp. em aves às enterites em humanos. O principal reservatório do agente é o trato digestivo de animais de diversas espécies, como aves de corte. Campylobacter spp. possui ampla diversidade genotípica e fenotípica, e apresentam diversos mecanismos de virulência para se aderir e colonizar o epitélio intestinal no hospedeiro. Apesar de o controle sanitário e biossegurança implementados nas granjas refletirem na redução de contaminação das carcaças no matadouro-frigorífico, esses procedimentos não eliminam o Campylobacter completamente das aves, podendo comprometer a qualidade microbiológica do produto final e propiciar casos de toxinfecção de origem alimentar aos consumidores. Esse trabalho tem como objetivo verificar a ocorrência de seis genes de virulência de Campylobacter jejuni em amostras de carcaças de frango e em casos de campilobacteriose em humanos. Foram avaliadas 50 amostras de C. jejuni, das quais 25 eram de origem aviária, provenientes da coleção do Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Patologia Aviária (CDPA - UFRGS), e 25 eram de origem humana, cedidas pela Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ). A técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) foi utilizada para detecção dos genes iam, flaA, cdtA, cdtB, cdtC e wlaN. Das amostras analisadas, 92% (23/25) de origem humana e 88% (22/25) de origem aviária foram positivas para o gene cdtB, 44% (11/25) de origem humana e 84% (21/25) de origem aviária para o gene cdtA; 20% (5/25) de origem humana e 80% (20/25) de origem aviária para o gene flaA; 48% (12/25) de origem humana e 76% (19/25) de origem aviária para o gene cdtC; 16% (4/25) de origem aviária para o gene wlaN e 12% (3/25) de origem humana e 4% (1/25) de origem aviária foram positivas para o gene iam. Em nenhuma das amostras pesquisadas de origem humana (0/25) foi observado o gene wlaN. Com este trabalho concluiu-se que os genes pesquisados podem estar presentes em cepas de C. jejuni provenientes de carne de frango e nas cepas isoladas de casos de infecção alimentar em humanos. Ainda assim, conforme os resultados apresentados, o gene cdtB teve maior frequência nas amostras provenientes de origem humana e aviária. / The demand for poultry meat has increased globally, as well as the microbiologic requirements of the final product. The frequency of Campylobacter spp. in poultry meat has been related to enteritis in humans. The digestive tract of several animals’ species, as poultries, is the main reservatory of the agent. Campylobacter spp. has a wide genotypic and phenotypic diversity, and, in addition to that, it presents several virulence factors which allow to adhere and colonize the intestinal epithelium of the host. Although good hygienic and biosecurity practices employed at poultry farms help to reduce the carcass contamination, these procedures do not completely eliminate Campylobacter spp. at the slaughterhouses and it may affect the microbiologic quality of the final product, which may cause alimentary toxinfection cases. This study aims to verify the occurrence of six virulence genes of Campylobacter jejuni from poultry carcasses samples and campylobacteriosis cases in humans. 50 samples of C. jejuni were evaluated, of which 25 were originated from poultry collected at the Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Patologia Aviária (CDPA - UFRGS), and 25 were originated from human samples of the Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ). Polymerase chain reaction (PCR) technique was employed to detect the following genes: iam, flaA, cdtA, cdtB, cdtC and wlaN. In the samples analyzed, 92% (23/25) from human origin and 88% (22/25) from poultry for cdtB gene; 44% (11/25) from human origin and 84% (21/25) from poultry for cdtA gene; 20% (5/25) from human origin and 80% (20/25) from poultry for flaA gene; 48% (12/25) from human origin and 76% (19/25) from poultry for cdtC gene; 16% (4/25) from poultry for wlaN and gene 12% (3/25) from human origin and 4% (1/25) from poultry were positive for iam gene. This study concludes that the researched genes may be present in Campylobacter from poultry meat origin and from isolates of human cases of alimentary toxinfection. However, according to the results found, the cdtB gene had a higher frequency in samples of human and avian origin.