O circovírus suíno tipo 2 (PCV2) é o principal agente envolvido na Síndrome Multissistêmica do Definhamento dos Suínos (SMDS). Na maioria dos países onde a suinocultura tem expressiva importância econômica, a SMDS vem causando sérios prejuízos. Com o objetivo de contribuir para a caracterização genética de isolados brasileiros de PCV2, duas amostras autóctones foram clonadas e seqüenciadas na íntegra. Para tanto, o genoma viral foi extraído de tecidos de animais com SMDS e amplificado pelo método denominado “amplificação em círculo rolante com múltiplos primers” (ACRMP). Ambas seqüências apresentaram 1.767 nucleotídeos e diferiram entre si em apenas um nucleotídeo. A análise filogenética destas duas seqüências mostrou maior identidade com o grupo (1A) formado por isolados holandeses, franceses e chineses. Um isolado brasileiro previamente sequenciado, de Minas Gerais, foi classificado em outro grupo e a seqüência diferiu em até 16 nucleotídeos em relação aos isolados do Rio Grande do Sul. Na etapa seguinte desses estudos, visando o futuro desenvolvimento de vacinas, um dos genomas aqui seqüenciados foi transfectado em células de testículo de suíno (ST). Antígenos virais nas células transfectadas foram detectados por imunoperoxidase, demonstrando assim a infecciosidade do clone produzido. Entretanto, o clone infeccioso obtido não foi capaz de multiplicar-se a ponto de fornecer massa antigênica que viabilizasse a produção de uma vacina. Em vista disso, realizou-se uma tentativa de criar uma linhagem celular persistentemente infectada. Para isso, o DNA de PCV2 foi novamente transfectado em células ST com um plasmídeo contendo o gene de resistência a geneticin, visando a seleção de colônias celulares resistentes. Após a transfecção, porém, observou-se um efeito negativo na formação de colônias resistentes a esta droga. Este efeito foi dose-dependente em relação à quantidade de DNA de PCV2, o que impossibilitou o estabelecimento de uma linhagem celular persistentemente infectada. Isto pode estar relacionado com a expressão da proteína da ORF3 que induz apoptose ou à indução de citocinas, como interferons, embora outros mecanismos não possam ser excluídos, como efeito tóxico do alto número de cópias de genomas de PCV2. Analisando os resultados obtidos durante a realização destes estudos, conclui-se que as amostras de PCV2 circulantes no Brasil apresentam de identidade alta (99,09 %). / Porcine circovirus type 2 is the main etiological agent implicated in the postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in pigs. In countries with considerable swine production, PMWS is a major cause of economic losses. In order to perfom a genetic analysis on Brazilian PCV2 isolates, two PCV2 isolates inform the state of Rio Grande do Sul - Brazil, were cloned and fully sequenced. Viral genomes were extracted from tissues of animals with PMWS and amplified using multiply-primed rolling circle amplification (MPRCA). Both PCV2 sequences were 1,767 nucleotides long and differed in only one nucleotide from each other. Phylogenetic analysis of both sequences showed the highest sequence identity with a group of viruses (group 1A) that also harbors many Dutch, French and Chinese isolates. This suggests that the Brazilian PCV2 isolates examineed here might have been imported from one of such countries. Interestingly, a Brazilian isolate from Minas Gerais previously sequenced by others, was observed to belong to another group of PCV2 isolates and differs at 16 different sites from the isolates from Rio Grande do Sul. In order to develop a vaccine, one of the isolates here sequenced was transfected into swine testis (ST) cells. Viral antigens were detected in the transfected ST cells by immunoperoxidase, indicating that such PCV2 clone could give rise to infectious virus. However, the cloned virus was not able to multiply to high titers, what would be a major drawback in vaccine development. In attempting to solve this problem, the development of a PCV2- persistently infected cell line was targeted. PCV2 DNA was cotransfected with a plasmid carrying the geneticin resistance gene in order to allow clone selection by identification of geneticin resistant cells. However, the PCV2 DNA had a negative effect on the number of geneticin resistant colonies. Interestingly, this negative effect of PCV2 DNA was dose dependent and for this reason, it was not possible to establishing a persistently infected cell line. This might be linked to ORF3 protein expression, which induces apoptosis or production of interferon. Analyzing the results obtained in this study, the Brazilian PCV2 isolates had high identity (99.05 %).

O circovírus suíno tipo 2 (PCV2) é o principal agente envolvido na Síndrome Multissistêmica do Definhamento dos Suínos (SMDS). Na maioria dos países onde a suinocultura tem expressiva importância econômica, a SMDS vem causando sérios prejuízos. Com o objetivo de contribuir para a caracterização genética de isolados brasileiros de PCV2, duas amostras autóctones foram clonadas e seqüenciadas na íntegra. Para tanto, o genoma viral foi extraído de tecidos de animais com SMDS e amplificado pelo método denominado “amplificação em círculo rolante com múltiplos primers” (ACRMP). Ambas seqüências apresentaram 1.767 nucleotídeos e diferiram entre si em apenas um nucleotídeo. A análise filogenética destas duas seqüências mostrou maior identidade com o grupo (1A) formado por isolados holandeses, franceses e chineses. Um isolado brasileiro previamente sequenciado, de Minas Gerais, foi classificado em outro grupo e a seqüência diferiu em até 16 nucleotídeos em relação aos isolados do Rio Grande do Sul. Na etapa seguinte desses estudos, visando o futuro desenvolvimento de vacinas, um dos genomas aqui seqüenciados foi transfectado em células de testículo de suíno (ST). Antígenos virais nas células transfectadas foram detectados por imunoperoxidase, demonstrando assim a infecciosidade do clone produzido. Entretanto, o clone infeccioso obtido não foi capaz de multiplicar-se a ponto de fornecer massa antigênica que viabilizasse a produção de uma vacina. Em vista disso, realizou-se uma tentativa de criar uma linhagem celular persistentemente infectada. Para isso, o DNA de PCV2 foi novamente transfectado em células ST com um plasmídeo contendo o gene de resistência a geneticin, visando a seleção de colônias celulares resistentes. Após a transfecção, porém, observou-se um efeito negativo na formação de colônias resistentes a esta droga. Este efeito foi dose-dependente em relação à quantidade de DNA de PCV2, o que impossibilitou o estabelecimento de uma linhagem celular persistentemente infectada. Isto pode estar relacionado com a expressão da proteína da ORF3 que induz apoptose ou à indução de citocinas, como interferons, embora outros mecanismos não possam ser excluídos, como efeito tóxico do alto número de cópias de genomas de PCV2. Analisando os resultados obtidos durante a realização destes estudos, conclui-se que as amostras de PCV2 circulantes no Brasil apresentam de identidade alta (99,09 %). / Porcine circovirus type 2 is the main etiological agent implicated in the postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in pigs. In countries with considerable swine production, PMWS is a major cause of economic losses. In order to perfom a genetic analysis on Brazilian PCV2 isolates, two PCV2 isolates inform the state of Rio Grande do Sul - Brazil, were cloned and fully sequenced. Viral genomes were extracted from tissues of animals with PMWS and amplified using multiply-primed rolling circle amplification (MPRCA). Both PCV2 sequences were 1,767 nucleotides long and differed in only one nucleotide from each other. Phylogenetic analysis of both sequences showed the highest sequence identity with a group of viruses (group 1A) that also harbors many Dutch, French and Chinese isolates. This suggests that the Brazilian PCV2 isolates examineed here might have been imported from one of such countries. Interestingly, a Brazilian isolate from Minas Gerais previously sequenced by others, was observed to belong to another group of PCV2 isolates and differs at 16 different sites from the isolates from Rio Grande do Sul. In order to develop a vaccine, one of the isolates here sequenced was transfected into swine testis (ST) cells. Viral antigens were detected in the transfected ST cells by immunoperoxidase, indicating that such PCV2 clone could give rise to infectious virus. However, the cloned virus was not able to multiply to high titers, what would be a major drawback in vaccine development. In attempting to solve this problem, the development of a PCV2- persistently infected cell line was targeted. PCV2 DNA was cotransfected with a plasmid carrying the geneticin resistance gene in order to allow clone selection by identification of geneticin resistant cells. However, the PCV2 DNA had a negative effect on the number of geneticin resistant colonies. Interestingly, this negative effect of PCV2 DNA was dose dependent and for this reason, it was not possible to establishing a persistently infected cell line. This might be linked to ORF3 protein expression, which induces apoptosis or production of interferon. Analyzing the results obtained in this study, the Brazilian PCV2 isolates had high identity (99.05 %).

O circovírus suíno tipo 2 (PCV2) é o principal agente envolvido na Síndrome Multissistêmica do Definhamento dos Suínos (SMDS). Na maioria dos países onde a suinocultura tem expressiva importância econômica, a SMDS vem causando sérios prejuízos. Com o objetivo de contribuir para a caracterização genética de isolados brasileiros de PCV2, duas amostras autóctones foram clonadas e seqüenciadas na íntegra. Para tanto, o genoma viral foi extraído de tecidos de animais com SMDS e amplificado pelo método denominado “amplificação em círculo rolante com múltiplos primers” (ACRMP). Ambas seqüências apresentaram 1.767 nucleotídeos e diferiram entre si em apenas um nucleotídeo. A análise filogenética destas duas seqüências mostrou maior identidade com o grupo (1A) formado por isolados holandeses, franceses e chineses. Um isolado brasileiro previamente sequenciado, de Minas Gerais, foi classificado em outro grupo e a seqüência diferiu em até 16 nucleotídeos em relação aos isolados do Rio Grande do Sul. Na etapa seguinte desses estudos, visando o futuro desenvolvimento de vacinas, um dos genomas aqui seqüenciados foi transfectado em células de testículo de suíno (ST). Antígenos virais nas células transfectadas foram detectados por imunoperoxidase, demonstrando assim a infecciosidade do clone produzido. Entretanto, o clone infeccioso obtido não foi capaz de multiplicar-se a ponto de fornecer massa antigênica que viabilizasse a produção de uma vacina. Em vista disso, realizou-se uma tentativa de criar uma linhagem celular persistentemente infectada. Para isso, o DNA de PCV2 foi novamente transfectado em células ST com um plasmídeo contendo o gene de resistência a geneticin, visando a seleção de colônias celulares resistentes. Após a transfecção, porém, observou-se um efeito negativo na formação de colônias resistentes a esta droga. Este efeito foi dose-dependente em relação à quantidade de DNA de PCV2, o que impossibilitou o estabelecimento de uma linhagem celular persistentemente infectada. Isto pode estar relacionado com a expressão da proteína da ORF3 que induz apoptose ou à indução de citocinas, como interferons, embora outros mecanismos não possam ser excluídos, como efeito tóxico do alto número de cópias de genomas de PCV2. Analisando os resultados obtidos durante a realização destes estudos, conclui-se que as amostras de PCV2 circulantes no Brasil apresentam de identidade alta (99,09 %). / Porcine circovirus type 2 is the main etiological agent implicated in the postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in pigs. In countries with considerable swine production, PMWS is a major cause of economic losses. In order to perfom a genetic analysis on Brazilian PCV2 isolates, two PCV2 isolates inform the state of Rio Grande do Sul - Brazil, were cloned and fully sequenced. Viral genomes were extracted from tissues of animals with PMWS and amplified using multiply-primed rolling circle amplification (MPRCA). Both PCV2 sequences were 1,767 nucleotides long and differed in only one nucleotide from each other. Phylogenetic analysis of both sequences showed the highest sequence identity with a group of viruses (group 1A) that also harbors many Dutch, French and Chinese isolates. This suggests that the Brazilian PCV2 isolates examineed here might have been imported from one of such countries. Interestingly, a Brazilian isolate from Minas Gerais previously sequenced by others, was observed to belong to another group of PCV2 isolates and differs at 16 different sites from the isolates from Rio Grande do Sul. In order to develop a vaccine, one of the isolates here sequenced was transfected into swine testis (ST) cells. Viral antigens were detected in the transfected ST cells by immunoperoxidase, indicating that such PCV2 clone could give rise to infectious virus. However, the cloned virus was not able to multiply to high titers, what would be a major drawback in vaccine development. In attempting to solve this problem, the development of a PCV2- persistently infected cell line was targeted. PCV2 DNA was cotransfected with a plasmid carrying the geneticin resistance gene in order to allow clone selection by identification of geneticin resistant cells. However, the PCV2 DNA had a negative effect on the number of geneticin resistant colonies. Interestingly, this negative effect of PCV2 DNA was dose dependent and for this reason, it was not possible to establishing a persistently infected cell line. This might be linked to ORF3 protein expression, which induces apoptosis or production of interferon. Analyzing the results obtained in this study, the Brazilian PCV2 isolates had high identity (99.05 %).

A presente tese versa sobre estudos realizados visando a identificação de novos agentes virais em frangos comerciais. No primeiro capítulo, a identificação do girovírus aviário tipo 2 (AGV2) é reportada. Um genoma viral de 2383 nt foi amplificado a partir soros de frangos comerciais por amplificação randômica de DNA. A análise da sequência do produto amplificado, revelou que cerca de 40% das sequencias de nucleotídeos apresentavam similaridade com o genoma do vírus da anemia infecciosa das galinhas (CAV). Dado o baixo grau de identidade com o CAV, o genoma identificado justificou a proposição de um novo tipo de vírus, dentro do gênero gyrovírus foi denominado “girovírus aviário tipo 2” (AGV2). O genoma do AGV2 tem organização semelhante a do CAV, com percentagens de similitude de aminoácidos nas regiões codificantes, correspondentes às proteínas virais VP1, VP2 e VP3 do CAV de 38,8%, 40,3% e 32,2%, respectivamente. A fim de analisar a amplitude da disseminação deste agente, foi realizado um estudo para identificar a ocorrência do AGV2 em granjas de frangos de outras regiões. Para atingir esse objetivo, uma PCR específica ao AGV2 foi desenvolvida para amplificar o DNA viral extraído de bulbos de penas da asa e órgãos de frangos. Essa técnica permitiu a detecção do AGV2 em aves de outros locais na Região Sul do Brasil. O DNA viral foi detectado em 90,7% (98/108) das amostras coletadas no estado do Rio Grande do Sul e 60,4% (29/48) das amostras do estado de Santa Catarina. Os mesmo primers da PCR foram adaptados para examinar tecidos de cérebro de galinhas da Holanda. Nessas amostras o DNA do AGV2 foi detectado em nove das 21 (42,9%) amostras de tecidos cerebrais em aves com lesões hemorrágicas. Essas descobertas fornecem evidências de que infecções de AGV2 são generalizadas e não se restringem a Região Sul do Brasil. Além disso, esses estudos permitiram a identificação de variantes do DNA genômico do AGV2. Análises filogenéticas demostraram que os genomas examinados poderiam ser divididos em três grupos, com base em diferenças nos genes das ORFs das proteínas VP2 e VP3. Em conclusão, a presente tese abrange estudos da identificação de um vírus aviário, até então desconhecido, denominado girovírus aviário tipo 2, que encontra-se amplamente distribuído. A associação deste agente com enfermidades em aves será tema de estudos que estão sendo realizados. / This thesis concerns studies carried out in search for new viral agents in commercial poultry flocks. In the first chapter, the identification of the genome of avian gyrovirus type 2 (AGV2), a new Gyrovirus, is reported. The viral genome the 2383-nucleotide sequence was amplified from sera of commercial broilers by random DNA amplification. Sequence analysis of the amplified product showed that the putative viral sequence had about 40% nucleotide similarity with the genome of its closest relative, chicken anemia virus (CAV). Such low degree of nucleotide similarity justified its classification as a new virus type within the genus, to which the name avian gyrovirus type 2. The amino acid similarity between the predicted viral proteins VP1, VP2 and VP3 of AGV2 and those of CAV was 38.8%, 40.3%, and 32.2%, respectively. In order to examine the amplitude of dissemination of this agent, it became necessary to carry out a search for AGV2 genomes in poultry flocks from other regions. To achieve such objective, an AGV2-specific PCR was designed to amplify viral DNA from nuclei acid extracted from poultry feather shafts. This allowed detection of AGV2 genomes in flocks from other locations in Southern Brazil. Viral DNA was detected in 98/108 (90.7%) of samples collected in the state of Rio Grande do Sul and 29/48 (60.4%) of the samples collected in the state of Santa Catarina. The same PCR primers were adapted to examine brain tissues of chickens from the Netherlands. In such samples, AGV2 DNA was detected in nine out of 21 (42.9%) brain tissue samples from birds with haemorragic lesions. These findings provided evidence that AGV2 infections are widespread and are not restricted to Southern Brazil. In addition, these studies allowed the identification of genomic variants of AGV2. Phylogenetic analyses demonstrated that such genomes could be divided into three clusters. In conclusion, this thesis encompasses studies on the identification of a previously unreported virus, named avian gyrovirus 2, which was later shown to be widely distributed. The relationship between this agent and disease in poultry will be subject of further studies which are being performed in continuation to this work.

O presente estudo foi realizado com o objetivo de identificar genomas de vírus em fezes de lobos marinhos sul-americanos (Arctocephalus australis) e lobos marinhos subantárticos (Arctocephalus tropicalis), duas espécies de pinípedes encontradas no litoral do Rio Grande do Sul. Embora já existam estudos sobre esse tema em outras espécies de pinípedes, nas espécies aqui trabalhadas o tema permanece inexplorado. Amostras de fezes foram obtidas de vinte e um lobos marinhos sul-americanos e dois lobos marinhos subantárticos encontrados no litoral rio-grandense com indícios de morte recente, durante os meses de Junho e Julho de 2012. Através de técnicas de PCR e sequenciamento buscou-se identificar genomas de circovírus, adenovírus, morbilivírus, calicivírus e coronavírus. A amplificação de um fragmento do gene rep permitiu a identificação de prováveis circovírus em amostras de seis lobos marinhos sul-americanos. Análises filogenéticas revelaram que três dos seis segmentos são sugestivos de prováveis membros do gênero Cyclovirus. Os genes amplificados de outras duas amostras provavelmente correspondem a membros do gênero Circovirus. Uma das amostras deu origem a um segmento gênico que não apresenta similaridade com nenhum gênero já proposto da família Circoviridae. Além disso, foi possível detectar também fragmentos de genomas de adenovírus em duas amostras; estes apresentam alto grau de similaridade de nucleotídeos com amostras de adenovírus humano tipo C. Nenhum fragmento genômico indicativo da presença de morbilivírus, calicivírus ou coronavírus foi encontrado. Os resultados aqui obtidos sugerem a presença de circovírus, ciclovírus e adenovírus em populações de lobos marinhos encontrados na costa do Rio Grande do Sul. Estes achados reforçam a necessidade da ampliação do conhecimento a respeito da ocorrência de infecções virais nestas espécies. / This study was conducted with the objective of identifying genomes of viruses in feces of south american fur seals (Arctocephalus australis) and subantarctic fur seals (Arctocephalus tropicalis), two species of pinnipeds found on the coast of Rio Grande do Sul. Although there are studies about this topic in other species of pinnipeds, it remains unexplored in these two species. Stool samples were obtained from twenty-one south american fur seals and two subantarctic fur seals found in Rio Grande do Sul coastline with evidences of recent death, during the months of June and July 2012. PCR and sequencing techniques were utilized to identify circovirus, adenovirus, morbillivirus, calicivirus and coronavirus genomes. The amplification of a rep gene fragment allowed the identification of supposed circoviruses in samples of six south american fur seals. Phylogenetic analysis revealed that three of the six segments are suggestive of probable members of the genus Cyclovirus. The amplified genes from two other samples probably correspond to members of the genus Circovirus. One of the samples gave rise to a gene segment that has no similarity with any genera already proposed of the Circoviridae family. Furthermore, it was also possible to detect fragments of adenovirus genomes in two samples: these have a high degree of nucleotide similarity with a human adenovirus type C genomic fragment. No indication of the presence of morbillivirus, calicivirus and coronavirus genomes was found. The work reported here provide evidence for the occurrence of circoviruses, cicloviruses and adenoviruses in fur seal populations found in Rio Grande do Sul. These findings reinforce the need to expand the knowledge about the occurrence of viral infections in these species.

A presente tese versa sobre estudos realizados visando a identificação de novos agentes virais em frangos comerciais. No primeiro capítulo, a identificação do girovírus aviário tipo 2 (AGV2) é reportada. Um genoma viral de 2383 nt foi amplificado a partir soros de frangos comerciais por amplificação randômica de DNA. A análise da sequência do produto amplificado, revelou que cerca de 40% das sequencias de nucleotídeos apresentavam similaridade com o genoma do vírus da anemia infecciosa das galinhas (CAV). Dado o baixo grau de identidade com o CAV, o genoma identificado justificou a proposição de um novo tipo de vírus, dentro do gênero gyrovírus foi denominado “girovírus aviário tipo 2” (AGV2). O genoma do AGV2 tem organização semelhante a do CAV, com percentagens de similitude de aminoácidos nas regiões codificantes, correspondentes às proteínas virais VP1, VP2 e VP3 do CAV de 38,8%, 40,3% e 32,2%, respectivamente. A fim de analisar a amplitude da disseminação deste agente, foi realizado um estudo para identificar a ocorrência do AGV2 em granjas de frangos de outras regiões. Para atingir esse objetivo, uma PCR específica ao AGV2 foi desenvolvida para amplificar o DNA viral extraído de bulbos de penas da asa e órgãos de frangos. Essa técnica permitiu a detecção do AGV2 em aves de outros locais na Região Sul do Brasil. O DNA viral foi detectado em 90,7% (98/108) das amostras coletadas no estado do Rio Grande do Sul e 60,4% (29/48) das amostras do estado de Santa Catarina. Os mesmo primers da PCR foram adaptados para examinar tecidos de cérebro de galinhas da Holanda. Nessas amostras o DNA do AGV2 foi detectado em nove das 21 (42,9%) amostras de tecidos cerebrais em aves com lesões hemorrágicas. Essas descobertas fornecem evidências de que infecções de AGV2 são generalizadas e não se restringem a Região Sul do Brasil. Além disso, esses estudos permitiram a identificação de variantes do DNA genômico do AGV2. Análises filogenéticas demostraram que os genomas examinados poderiam ser divididos em três grupos, com base em diferenças nos genes das ORFs das proteínas VP2 e VP3. Em conclusão, a presente tese abrange estudos da identificação de um vírus aviário, até então desconhecido, denominado girovírus aviário tipo 2, que encontra-se amplamente distribuído. A associação deste agente com enfermidades em aves será tema de estudos que estão sendo realizados. / This thesis concerns studies carried out in search for new viral agents in commercial poultry flocks. In the first chapter, the identification of the genome of avian gyrovirus type 2 (AGV2), a new Gyrovirus, is reported. The viral genome the 2383-nucleotide sequence was amplified from sera of commercial broilers by random DNA amplification. Sequence analysis of the amplified product showed that the putative viral sequence had about 40% nucleotide similarity with the genome of its closest relative, chicken anemia virus (CAV). Such low degree of nucleotide similarity justified its classification as a new virus type within the genus, to which the name avian gyrovirus type 2. The amino acid similarity between the predicted viral proteins VP1, VP2 and VP3 of AGV2 and those of CAV was 38.8%, 40.3%, and 32.2%, respectively. In order to examine the amplitude of dissemination of this agent, it became necessary to carry out a search for AGV2 genomes in poultry flocks from other regions. To achieve such objective, an AGV2-specific PCR was designed to amplify viral DNA from nuclei acid extracted from poultry feather shafts. This allowed detection of AGV2 genomes in flocks from other locations in Southern Brazil. Viral DNA was detected in 98/108 (90.7%) of samples collected in the state of Rio Grande do Sul and 29/48 (60.4%) of the samples collected in the state of Santa Catarina. The same PCR primers were adapted to examine brain tissues of chickens from the Netherlands. In such samples, AGV2 DNA was detected in nine out of 21 (42.9%) brain tissue samples from birds with haemorragic lesions. These findings provided evidence that AGV2 infections are widespread and are not restricted to Southern Brazil. In addition, these studies allowed the identification of genomic variants of AGV2. Phylogenetic analyses demonstrated that such genomes could be divided into three clusters. In conclusion, this thesis encompasses studies on the identification of a previously unreported virus, named avian gyrovirus 2, which was later shown to be widely distributed. The relationship between this agent and disease in poultry will be subject of further studies which are being performed in continuation to this work.

O presente estudo foi realizado com o objetivo de identificar genomas de vírus em fezes de lobos marinhos sul-americanos (Arctocephalus australis) e lobos marinhos subantárticos (Arctocephalus tropicalis), duas espécies de pinípedes encontradas no litoral do Rio Grande do Sul. Embora já existam estudos sobre esse tema em outras espécies de pinípedes, nas espécies aqui trabalhadas o tema permanece inexplorado. Amostras de fezes foram obtidas de vinte e um lobos marinhos sul-americanos e dois lobos marinhos subantárticos encontrados no litoral rio-grandense com indícios de morte recente, durante os meses de Junho e Julho de 2012. Através de técnicas de PCR e sequenciamento buscou-se identificar genomas de circovírus, adenovírus, morbilivírus, calicivírus e coronavírus. A amplificação de um fragmento do gene rep permitiu a identificação de prováveis circovírus em amostras de seis lobos marinhos sul-americanos. Análises filogenéticas revelaram que três dos seis segmentos são sugestivos de prováveis membros do gênero Cyclovirus. Os genes amplificados de outras duas amostras provavelmente correspondem a membros do gênero Circovirus. Uma das amostras deu origem a um segmento gênico que não apresenta similaridade com nenhum gênero já proposto da família Circoviridae. Além disso, foi possível detectar também fragmentos de genomas de adenovírus em duas amostras; estes apresentam alto grau de similaridade de nucleotídeos com amostras de adenovírus humano tipo C. Nenhum fragmento genômico indicativo da presença de morbilivírus, calicivírus ou coronavírus foi encontrado. Os resultados aqui obtidos sugerem a presença de circovírus, ciclovírus e adenovírus em populações de lobos marinhos encontrados na costa do Rio Grande do Sul. Estes achados reforçam a necessidade da ampliação do conhecimento a respeito da ocorrência de infecções virais nestas espécies. / This study was conducted with the objective of identifying genomes of viruses in feces of south american fur seals (Arctocephalus australis) and subantarctic fur seals (Arctocephalus tropicalis), two species of pinnipeds found on the coast of Rio Grande do Sul. Although there are studies about this topic in other species of pinnipeds, it remains unexplored in these two species. Stool samples were obtained from twenty-one south american fur seals and two subantarctic fur seals found in Rio Grande do Sul coastline with evidences of recent death, during the months of June and July 2012. PCR and sequencing techniques were utilized to identify circovirus, adenovirus, morbillivirus, calicivirus and coronavirus genomes. The amplification of a rep gene fragment allowed the identification of supposed circoviruses in samples of six south american fur seals. Phylogenetic analysis revealed that three of the six segments are suggestive of probable members of the genus Cyclovirus. The amplified genes from two other samples probably correspond to members of the genus Circovirus. One of the samples gave rise to a gene segment that has no similarity with any genera already proposed of the Circoviridae family. Furthermore, it was also possible to detect fragments of adenovirus genomes in two samples: these have a high degree of nucleotide similarity with a human adenovirus type C genomic fragment. No indication of the presence of morbillivirus, calicivirus and coronavirus genomes was found. The work reported here provide evidence for the occurrence of circoviruses, cicloviruses and adenoviruses in fur seal populations found in Rio Grande do Sul. These findings reinforce the need to expand the knowledge about the occurrence of viral infections in these species.

A presente tese versa sobre estudos realizados visando a identificação de novos agentes virais em frangos comerciais. No primeiro capítulo, a identificação do girovírus aviário tipo 2 (AGV2) é reportada. Um genoma viral de 2383 nt foi amplificado a partir soros de frangos comerciais por amplificação randômica de DNA. A análise da sequência do produto amplificado, revelou que cerca de 40% das sequencias de nucleotídeos apresentavam similaridade com o genoma do vírus da anemia infecciosa das galinhas (CAV). Dado o baixo grau de identidade com o CAV, o genoma identificado justificou a proposição de um novo tipo de vírus, dentro do gênero gyrovírus foi denominado “girovírus aviário tipo 2” (AGV2). O genoma do AGV2 tem organização semelhante a do CAV, com percentagens de similitude de aminoácidos nas regiões codificantes, correspondentes às proteínas virais VP1, VP2 e VP3 do CAV de 38,8%, 40,3% e 32,2%, respectivamente. A fim de analisar a amplitude da disseminação deste agente, foi realizado um estudo para identificar a ocorrência do AGV2 em granjas de frangos de outras regiões. Para atingir esse objetivo, uma PCR específica ao AGV2 foi desenvolvida para amplificar o DNA viral extraído de bulbos de penas da asa e órgãos de frangos. Essa técnica permitiu a detecção do AGV2 em aves de outros locais na Região Sul do Brasil. O DNA viral foi detectado em 90,7% (98/108) das amostras coletadas no estado do Rio Grande do Sul e 60,4% (29/48) das amostras do estado de Santa Catarina. Os mesmo primers da PCR foram adaptados para examinar tecidos de cérebro de galinhas da Holanda. Nessas amostras o DNA do AGV2 foi detectado em nove das 21 (42,9%) amostras de tecidos cerebrais em aves com lesões hemorrágicas. Essas descobertas fornecem evidências de que infecções de AGV2 são generalizadas e não se restringem a Região Sul do Brasil. Além disso, esses estudos permitiram a identificação de variantes do DNA genômico do AGV2. Análises filogenéticas demostraram que os genomas examinados poderiam ser divididos em três grupos, com base em diferenças nos genes das ORFs das proteínas VP2 e VP3. Em conclusão, a presente tese abrange estudos da identificação de um vírus aviário, até então desconhecido, denominado girovírus aviário tipo 2, que encontra-se amplamente distribuído. A associação deste agente com enfermidades em aves será tema de estudos que estão sendo realizados. / This thesis concerns studies carried out in search for new viral agents in commercial poultry flocks. In the first chapter, the identification of the genome of avian gyrovirus type 2 (AGV2), a new Gyrovirus, is reported. The viral genome the 2383-nucleotide sequence was amplified from sera of commercial broilers by random DNA amplification. Sequence analysis of the amplified product showed that the putative viral sequence had about 40% nucleotide similarity with the genome of its closest relative, chicken anemia virus (CAV). Such low degree of nucleotide similarity justified its classification as a new virus type within the genus, to which the name avian gyrovirus type 2. The amino acid similarity between the predicted viral proteins VP1, VP2 and VP3 of AGV2 and those of CAV was 38.8%, 40.3%, and 32.2%, respectively. In order to examine the amplitude of dissemination of this agent, it became necessary to carry out a search for AGV2 genomes in poultry flocks from other regions. To achieve such objective, an AGV2-specific PCR was designed to amplify viral DNA from nuclei acid extracted from poultry feather shafts. This allowed detection of AGV2 genomes in flocks from other locations in Southern Brazil. Viral DNA was detected in 98/108 (90.7%) of samples collected in the state of Rio Grande do Sul and 29/48 (60.4%) of the samples collected in the state of Santa Catarina. The same PCR primers were adapted to examine brain tissues of chickens from the Netherlands. In such samples, AGV2 DNA was detected in nine out of 21 (42.9%) brain tissue samples from birds with haemorragic lesions. These findings provided evidence that AGV2 infections are widespread and are not restricted to Southern Brazil. In addition, these studies allowed the identification of genomic variants of AGV2. Phylogenetic analyses demonstrated that such genomes could be divided into three clusters. In conclusion, this thesis encompasses studies on the identification of a previously unreported virus, named avian gyrovirus 2, which was later shown to be widely distributed. The relationship between this agent and disease in poultry will be subject of further studies which are being performed in continuation to this work.

O presente estudo foi realizado com o objetivo de identificar genomas de vírus em fezes de lobos marinhos sul-americanos (Arctocephalus australis) e lobos marinhos subantárticos (Arctocephalus tropicalis), duas espécies de pinípedes encontradas no litoral do Rio Grande do Sul. Embora já existam estudos sobre esse tema em outras espécies de pinípedes, nas espécies aqui trabalhadas o tema permanece inexplorado. Amostras de fezes foram obtidas de vinte e um lobos marinhos sul-americanos e dois lobos marinhos subantárticos encontrados no litoral rio-grandense com indícios de morte recente, durante os meses de Junho e Julho de 2012. Através de técnicas de PCR e sequenciamento buscou-se identificar genomas de circovírus, adenovírus, morbilivírus, calicivírus e coronavírus. A amplificação de um fragmento do gene rep permitiu a identificação de prováveis circovírus em amostras de seis lobos marinhos sul-americanos. Análises filogenéticas revelaram que três dos seis segmentos são sugestivos de prováveis membros do gênero Cyclovirus. Os genes amplificados de outras duas amostras provavelmente correspondem a membros do gênero Circovirus. Uma das amostras deu origem a um segmento gênico que não apresenta similaridade com nenhum gênero já proposto da família Circoviridae. Além disso, foi possível detectar também fragmentos de genomas de adenovírus em duas amostras; estes apresentam alto grau de similaridade de nucleotídeos com amostras de adenovírus humano tipo C. Nenhum fragmento genômico indicativo da presença de morbilivírus, calicivírus ou coronavírus foi encontrado. Os resultados aqui obtidos sugerem a presença de circovírus, ciclovírus e adenovírus em populações de lobos marinhos encontrados na costa do Rio Grande do Sul. Estes achados reforçam a necessidade da ampliação do conhecimento a respeito da ocorrência de infecções virais nestas espécies. / This study was conducted with the objective of identifying genomes of viruses in feces of south american fur seals (Arctocephalus australis) and subantarctic fur seals (Arctocephalus tropicalis), two species of pinnipeds found on the coast of Rio Grande do Sul. Although there are studies about this topic in other species of pinnipeds, it remains unexplored in these two species. Stool samples were obtained from twenty-one south american fur seals and two subantarctic fur seals found in Rio Grande do Sul coastline with evidences of recent death, during the months of June and July 2012. PCR and sequencing techniques were utilized to identify circovirus, adenovirus, morbillivirus, calicivirus and coronavirus genomes. The amplification of a rep gene fragment allowed the identification of supposed circoviruses in samples of six south american fur seals. Phylogenetic analysis revealed that three of the six segments are suggestive of probable members of the genus Cyclovirus. The amplified genes from two other samples probably correspond to members of the genus Circovirus. One of the samples gave rise to a gene segment that has no similarity with any genera already proposed of the Circoviridae family. Furthermore, it was also possible to detect fragments of adenovirus genomes in two samples: these have a high degree of nucleotide similarity with a human adenovirus type C genomic fragment. No indication of the presence of morbillivirus, calicivirus and coronavirus genomes was found. The work reported here provide evidence for the occurrence of circoviruses, cicloviruses and adenoviruses in fur seal populations found in Rio Grande do Sul. These findings reinforce the need to expand the knowledge about the occurrence of viral infections in these species.