Η παρούσα εργασία στοχεύει στην «χαρτογράφηση» της περιοχής 3’UTR του ανθρώπινου γονιδίου της β-σφαιρίνης, ως προς την παρουσία σ’ αυτήν δομών που έχουν σημασία στο μεταβολισμό του mRNA – την ωρίμανση του 3’ άκρου του μηνύματος, ή / και την σταθεροποίησή του. Η μελέτη έγινε με τον σχεδιασμό μεταλλάξεων στην 3’UTR οι οποίες επιφέρουν μεταβολές στην πρωτοταγή και τη δευτεροταγή αλληλουχία της περιοχής, και την δημιουργία τριών μεταλλαγμένων γονιδίων β-σφαιρίνης στην 3’ UTR τους. Στη συνέχεια μελετήθηκε η έκφραση των μεταλλαγμένων γονιδίων σε διαγονιδιακές κυτταροκαλλιέργειες ερυθρολευχαιμικών κυττάρων ποντικού (mouse erythroleukaemia cells, MEL), με λειτουργικά πειράματα ανάλυσης του RNA με τη μέθοδο της προστασίας από τη νουκλεάση S1. Η έκφραση των μεταλλαγμένων διαγονιδίων προσδιορίστηκε σε σχέση με την έκφραση του φυσιολογικού γονιδίου της β-σφαιρίνης, λαμβάνοντας υπόψη τον αριθμό των αντιγράφων των διαγονιδίων στα κύτταρα, και την έκφραση του ενδογενούς σφαιρινικού γονιδίου βmaj του ποντικού. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και τα τρία μεταλλαγμένα γονίδια παρουσιάζουν μειωμένα ποσοστά έκφρασης και μειωμένη επάρκεια ωρίμανσης του 3’ άκρου του mRNA, ενώ ο ρυθμός αποδόμησης του –μεταλλαγμένου– mRNA δεν διαφέρει από το φυσιολογικό για κανένα από τα τρία γονίδια. Συμπερασματικά, με την μελέτη αυτή επιβεβαιώνεται ο ρόλος της περιοχής 3’UTR του γονιδίου της β-σφαιρίνης στην διαδικασία ωρίμανσης του 3’ άκρου του mRNA, και η απουσία ειδικού σταθεροποιητικού μηχανισμού για το mRNA στην περιοχή του γονιδίου που μελετήθηκε με τις παρούσες μεταλλάξεις. / The present work aimed at mapping of the 3’UTR of the human β-globin gene as to the possible presence of structures that are involved in mRNA metabolism; in particular effective 3’ end formation or / and stability of the message. The study involved the design of 3’ UTR mutations that alter the primary and secondary structure of the sequence, and the subsequent formation of three mutant β-globin genes. The expression of the mutated genes was studied in transgenic mouse erythroleukaemia cell (MEL) lines, with functional analysis of mRNA expression using S1 nuclease protection assays. The expression of the mutated transgenes was compared to the relevant expression of the normal β-globin transgene, after correcting for transgene copy number and expression of the endogenous murine globin gene βmaj. Our results show that all three studied mutant transgenes have decreased expression levels, and decreased efficiency in 3’ end formation of the mRNA, whereas the stability of the –mutant– mRNA is not affected for any of the three transgenes. We conclude that the β-globin 3’ UTR plays an important role in the efficiency of message 3’ end formation, and that the mutations studied do not disrupt any stabilising mechanism.

Hemogen (Hemgn) is reported as a tissue specific transcriptional regulator in testis as well as hematopoietic tissues. It is known that Hemgn positively regulates erythroid differentiation; however,the underlying molecular mechanism is not well understood. In the current study, using proteomic approach in combination with other molecular biology tools,we have attempted to decipher the role of Hemgn in differentiating Murine erythroblast leukemia (MEL) cells as a model system. Our study reveals that Hemgn predominantly interacts with transcriptional regulators, chromatin modifiers and histones. Furthermore, using Chromatin Immunoprecipitation and knockdown approach, we have demonstrated that Hemgn is recruited to the b-globin locus, which is known to be activated during erythroid differentiation. Based on the results,we speculate that Hemgn acts as a tissue specific histone chaperone that regulates transcription during erythroid differentiation.

Hemogen (Hemgn) is reported as a tissue specific transcriptional regulator in testis as well as hematopoietic tissues. It is known that Hemgn positively regulates erythroid differentiation; however,the underlying molecular mechanism is not well understood. In the current study, using proteomic approach in combination with other molecular biology tools,we have attempted to decipher the role of Hemgn in differentiating Murine erythroblast leukemia (MEL) cells as a model system. Our study reveals that Hemgn predominantly interacts with transcriptional regulators, chromatin modifiers and histones. Furthermore, using Chromatin Immunoprecipitation and knockdown approach, we have demonstrated that Hemgn is recruited to the b-globin locus, which is known to be activated during erythroid differentiation. Based on the results,we speculate that Hemgn acts as a tissue specific histone chaperone that regulates transcription during erythroid differentiation.

Die b -Thalassämie gehört weltweit zu den häufigsten monogenen Erbkrankheiten. Die Thalassämien treten endemisch in der Bevölkerung des Mittelmeerraumes, in Westafrika und in weiten Teilen Asiens auf. In der einheimischen Bevölkerung der Bundesrepublik Deutschland gehört die homozygote Form der b -Thalassämie zu den seltenen Erkrankungen. Häufiger ist das Auftreten der heterozygoten Form, die als Differentialdiagnose der mikrozytären, hypochromen Anämie eine besondere Rolle spielt. Blutproben von 214 deutschen Personen mit einer heterozygoten b -Thalassämie wurden mittels Allel-spezifischer Oligonukleotid-Hybridisierung, Restriktionsanalyse und direkter Sequenzierung PCR-amplifizierter DNA analysiert. Insgesamt konnten 96,3 % (206/214) der Proben molekular charakterisiert werden. Die mediterranen Mutationen stellen einen Anteil von etwa 2/3 aller identifizierten Veränderungen, häufig sind insbesondere NS 39, IVS1-110 G ® A und IVS1-1 G ® A. Das übrige Mutationsspektrum setzt sich aus sehr seltenen Mutationen (IVS1-1 G ® T, IVS1-2 T ® G, IVS1-2 T ® C, NS 15 G ® A, NS 121 G ® T, FS 8/9 +G, FS 44 -C, FS 51 -C, FS 82/83 -G, Initiations-Kodon-Mutationen ATG ® ACG/ ® GTG/ ® ATA) und einer neuen Mutation (IVS1-129 A ® G) zusammen. In 6 Fällen konnte nach vollständiger molekularer Analyse kein Gendefekt als Ursache der b -Thalassämie gefunden werden. Diese Probanden könnten b -Thalassämiedeterminanten tragen, die nicht an den b -Globingen-Komplex gekoppelt sind oder regulative Sequenzen außerhalb des b -Globingens darstellen. Die erhobenen Daten zeigen, daß der Ursprung der b -Thalassämie in der deutschen Bevölkerung in den Mittelmeerländern liegt, ein Drittel der Fälle scheint sich jedoch lokal entwickelt zu haben. / The b -thalassemia belongs to the most common monogenic disorders worldwide. Endemically in the Mediterranean population, some parts of Asia and Western Africa, b -thalassemia is a rare disease in Germany. Nevertheless, heterozygous forms of b -thalassemia minor occur more frequently in the German population and should be considered in the differential diagnosis of hypochromic anemia. To investigate the molecular biological background of b -thalassemia in Germany, 214 non-immigrant German individuals suffering from heterozygous b -thalassemia were characterized by allele-specific oligonucleotid hybridization, restriction analysis and sequencing of the b -globin gene. By these techniques, 26 different mutations were identified. Most frequently, the Mediterranean mutations NS 39, IVS1-110 G ® A, and IVS1-1 G ® A were detected. Although otherwise rare, the frameshift mutation of codon 83 (FS 83 -G) was also relatively common (5 %) in the analyzed population. Other previously described mutations (IVS1-1 G ® T, IVS1-2 T ® G, IVS1-2 T ® C, NS 15 G ® A, NS 121 G ® T, FS 8/9 +G, FS 44 -C, FS 51 -C, initiation codon mutation ATG ® ACG/ ® GTG/ ® ATA) were demonstrated in < 10 individuals. Interestingly, sequence analysis identified a novel mutation affecting position -2 of the splice acceptor site (IVS1-129 A ® G). In 6 individuals diagnosed as heterozygous b -thalassemia, a mutation of the b -globin gene could not be demonstrated. The data indicate the b -thalassemia to be introduced from the Mediterranean population into Germans in two-thirds of the cases whereas the remaining third probably is of local origin.