Die hier vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Eignung bakterieller Hüllproteine als Bindungsmatrix für die Kopplung funktionaler Moleküle mit dem Ziel, sensorische Schichten zu erzeugen. Bakterielle Hüllproteine sind biologische SAMs, anderen Oberfläche sich modifizierbare COOH-, NH2- und OH-Gruppen befinden. Die Ausbildung polymerer Strukturen erfolgt dabei in wässrigen Systemen und auf Oberflächen. Im Zuge der boomenden Entwicklung von Biosensoren werden insbesondere Biotemplate gesucht, die zwischen biologischer Komponente und Sensoroberfläche vermitteln. Bakterielle Hüllproteine stellen eine solche Zwischenschicht dar. Als Anwendungsbeispiel wurden die Proteine daher mit einem FRET-Paar und Thrombin und Kanamycin-Aptameren modifiziert. Hierbei wurden das FRET-Paar H488 und H555 an die bakteriellen Hüllproteine der beiden Haldenisolate A12 und B53 mittels EDC mit einer Modifizierungsrate von 0,54 molFarbstoff/molProtein kovalent gebunden. Bei der vorhandenen p4-Symmetrie bedeutet dies, dass ein FRET-Paar pro Einheitszelle vorhanden war. Der Nachweis eines Energietransfers zwischen den beiden am Protein gebundenen Fluoreszenzfarbstoffen H488 und H555 erfolgte mittels statischer und zeitaufgelöster Fluoreszenzmessung. Die Ergebnisse zeigten, dass ein Energietransfer nur möglich war, wenn die Proteine in polymerer Form vorlagen, unabhängig davon, ob sich die Proteine immobilisiert an einer Oberfläche oder in wässriger Lösung befanden. Mittels Variieren des Donor-Akzeptor-Verhältnisses konnte ein maximaler Energietransfer von 40 % generiert werden, wenn das Verhältnis der Fluoreszenzfarbstoffe von Donor und Akzeptor 4 betrug. Die Fluoreszenzintensität der Fluorophore wurde durch die Bindung an die Proteine nicht verringert oder gelöscht. Dies legt nahe, dass die Farbstoffe in den hydrophoben Poren immobilisiert wurden und die Poren die Fluoreszenzfarbstoffe schützen. Um weitere Aussagen über die Lage der gebundenen Fluoreszenzfarbstoffe zu erhalten, wurden die bakteriellen Hüllproteine der Stämme A12 und B53 enzymatisch verdaut und die Fragmente mittels SEC und SDS-PAGE untersucht. Dabei zeigten sich je nach Enzym und Protein unterschiedliche Bandenmuster bezüglich modifizierter und nativer Hüllproteine. Dies belegt, dass die Fluoreszenzfarbstoffe an NH2-und COOH-Gruppen der Proteine gebunden wurden und so teilweise den enzymatischen Verdau hinderten. Die SEC deutet an, dass die Fluoreszenzfarbstoffe an verschiedenen Stellen am Protein gebunden wurden. In einem zweiten Beispiel wurde das bakterielle Hüllprotein von A12 mit einem Aptamer modifiziert. Aptamere sind kurze einzelsträngige Oligonukleotide, die u.a. mittels ihrer ausgebildeten 3D-Struktur spezifisch Zielstrukturen reversibel binden können. Die hier verwendeten Aptamere binden spezifisch Thrombin und Kanamycin. Die Aptamere wurden mit Hilfe einer der beiden Vernetzer PMPI oder Sulfo-SMCC an die bakteriellen Hüllproteine kovalent gebunden. Nach dem Modifizieren der Proteine wurden diese auf entsprechenden Sensorchips immobilisiert und die Aktivität des gekoppelten Aptamers mittels Affinitätsmessungen, SPR-Spektroskopie und QCM-D-Messungen analysiert. Die Funktion des gebundenen Thrombinaptamers konnte mittels Affinitätsmessungen und QCM-D nachgewiesen werden und entspricht in beiden Fällen einer Bindung von 2 nmol Thrombin pro Quadratzentimeter. Die Funktionalität des Kanamycinaptamers sollte mittels SPR bestimmt werden, jedoch konnte keine Funktionalität des gekoppelten Kanamycinaptamers nachgewiesen werden. Alle Messungen bestätigten jedoch, dass die Bindungsmatrix aus bakteriellen Hüllproteinen keinerlei oder nur ein sehr geringes Hintergrundsignal liefert. Werden nun beide Komponenten, FRET-Paar und Aptamere, an das Protein gebunden, ist es möglich, eine sensorische Schicht zu erzeugen. Die Zielstruktur, welche detektiert werden soll, wird an das Aptamer gebunden und so in räumliche Nähe zur Sensorfläche gebracht. Stell die Zielstruktur einen Fluoreszenzlöscher dar, so wird der Energietransfer durch die räumliche Nähe des Fluoreszenzlöscher gestört. Die Detektion des Zielmoleküls erfolgt nun über die Änderung von Fluoreszenzintensitäten. Die hier vorgelegte Arbeit soll einen Grundstein legen für die Entwicklung eines solchen Sensors und insbesondere die Detektion eines Energietransfers optimieren und Schwachstellen in der Detektion nachweisen. Die systematische Untersuchung der Fluoreszenzfarbstoffe auf dem Protein ermöglichen es, in zukünftigen Arbeiten einen FRET zweifelsfrei zu detektieren. Die Modifizierung von bakteriellen Hüllproteinen von A12 mit Aptameren und die Detektion der Funktionalität der Aptamere mittels verschiedener Methoden zeigte auf, dass die bakteriellen Hüllproteine als universelle Bindungsmatrix für sensorische Moleküle dienen können, bei denen Affinitätsmessungen, SPR- oder QCM-D-Messungen genutzt werden. Besonders hervorzuheben ist, dass bakterielle Hüllproteine nahezu kein Hintergrundsignal liefern und aufgrund ihrer dünnen Monolage von etwa 6 - 9 nm die Sensitivität der Messungen nur gering beeinträchtigen.

Als "surface-layer" (S-Layer, SL) bezeichnet man die regelmäßig strukturierten Hüllproteinlagen auf der Oberfläche von etwa 80 % aller bisher bekannten Bakterienspezies. Sie entstehen durch Selbstassemblierung von identischen Proteinuntereinheiten, die wiederum zumeist durch nichtkovalente Wechselwirkungen mit der darunterliegenden Zellwandkomponente verknüpft sind. Trotz ihrer Diversität auf der Ebene der Primärstruktur weisen S-Layer verschiedener Bakterienarten einheitliche physikochemische Merkmale auf. Dazu zählt u.a. die Wiedereinnahme einer hochgradig strukturierten, porösen Proteinschicht nach reversibler Denaturierung. Infolge der Reassemblierung entstehen sowohl in Lösung als auch an Phasengrenzen Proteinassemblate, deren Porenanordnungen die gleiche regelmäßige Symmetrie aufweisen, wie die nativen Hüllproteine auf der Bakterienzelle. Das in seiner Domänenstruktur aufgeklärte Hüllprotein SbsC des mesophilen Bakterienstammes Geobacillus (G.) stearothermophilus ATCC 12980 zeichnet sich durch eine ausgezeichnete Synthetisierbarkeit in E. coli aus. C-terminale Fusionen, die im Falle des verstärkt grün fluoreszierenden Proteins (EGFP) bis zu 240 Aminosäuren umfassen, führten nicht zu einem Verlust der Selbstassemblierung. Darüber hinaus zeigen in vitro gebildete SbsC-Assemblate eine außergewöhnliche Stabilität gegenüber hohen Ethanolkonzentrationen. Die durch gerichtete Mutagenese erzeugten SbsC-Fusionsproteine SbsC(aa 31-1099)-HspA und SbsC(aa 31-1099)-12His besitzen in assemblierter Form im Vergleich mit dem unmodifizierten Protein eine bis zu zweimal höhere Bindungsaffinität gegenüber Platinionen. In denaturierter Form waren beide Fusionsproteine in der Lage, Nickelionen zu komplexieren. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals ein SL-Protein in einem eukaryontischen Mikroorganismus produziert. Das in der Hefe S. cerevisiae gebildete Fusionsprotein SbsC(aa 31-1099)-EGFP assembliert dabei im Cytosol der Wirtszellen zu röhrenförmigen Assemblaten mit regelmäßiger Symmetrie. Das bisher unbekannte SL-Protein des Stammes G. stearothermophilus DSM 13240 wurde erfolgreich heterolog in E. coli exprimiert. Die Vorläuferform besitzt im Vergleich zum maturen Protein ein 31 aa umfassendes Sekretionssignal am extremen N-Terminus. Sowohl das authentische Protein als auch das heterolog in E. coli exprimierte Vorläuferprotein zeigen eine dem SbsC-Protein vergleichbare Reassemblierungscharakteristik. Im Gegensatz dazu führte die Verkürzung der N-terminalen 30 Aminosäuren des als S13240 bezeichneten Hüllproteins im heterologen System zu einem irreversiblen Verlust der Fähigkeit zur Selbstassemblierung.

Als "surface-layer" (S-Layer, SL) bezeichnet man die regelmäßig strukturierten Hüllproteinlagen auf der Oberfläche von etwa 80 % aller bisher bekannten Bakterienspezies. Sie entstehen durch Selbstassemblierung von identischen Proteinuntereinheiten, die wiederum zumeist durch nichtkovalente Wechselwirkungen mit der darunterliegenden Zellwandkomponente verknüpft sind. Trotz ihrer Diversität auf der Ebene der Primärstruktur weisen S-Layer verschiedener Bakterienarten einheitliche physikochemische Merkmale auf. Dazu zählt u.a. die Wiedereinnahme einer hochgradig strukturierten, porösen Proteinschicht nach reversibler Denaturierung. Infolge der Reassemblierung entstehen sowohl in Lösung als auch an Phasengrenzen Proteinassemblate, deren Porenanordnungen die gleiche regelmäßige Symmetrie aufweisen, wie die nativen Hüllproteine auf der Bakterienzelle. Das in seiner Domänenstruktur aufgeklärte Hüllprotein SbsC des mesophilen Bakterienstammes Geobacillus (G.) stearothermophilus ATCC 12980 zeichnet sich durch eine ausgezeichnete Synthetisierbarkeit in E. coli aus. C-terminale Fusionen, die im Falle des verstärkt grün fluoreszierenden Proteins (EGFP) bis zu 240 Aminosäuren umfassen, führten nicht zu einem Verlust der Selbstassemblierung. Darüber hinaus zeigen in vitro gebildete SbsC-Assemblate eine außergewöhnliche Stabilität gegenüber hohen Ethanolkonzentrationen. Die durch gerichtete Mutagenese erzeugten SbsC-Fusionsproteine SbsC(aa 31-1099)-HspA und SbsC(aa 31-1099)-12His besitzen in assemblierter Form im Vergleich mit dem unmodifizierten Protein eine bis zu zweimal höhere Bindungsaffinität gegenüber Platinionen. In denaturierter Form waren beide Fusionsproteine in der Lage, Nickelionen zu komplexieren. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals ein SL-Protein in einem eukaryontischen Mikroorganismus produziert. Das in der Hefe S. cerevisiae gebildete Fusionsprotein SbsC(aa 31-1099)-EGFP assembliert dabei im Cytosol der Wirtszellen zu röhrenförmigen Assemblaten mit regelmäßiger Symmetrie. Das bisher unbekannte SL-Protein des Stammes G. stearothermophilus DSM 13240 wurde erfolgreich heterolog in E. coli exprimiert. Die Vorläuferform besitzt im Vergleich zum maturen Protein ein 31 aa umfassendes Sekretionssignal am extremen N-Terminus. Sowohl das authentische Protein als auch das heterolog in E. coli exprimierte Vorläuferprotein zeigen eine dem SbsC-Protein vergleichbare Reassemblierungscharakteristik. Im Gegensatz dazu führte die Verkürzung der N-terminalen 30 Aminosäuren des als S13240 bezeichneten Hüllproteins im heterologen System zu einem irreversiblen Verlust der Fähigkeit zur Selbstassemblierung.

Die hier vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Eignung bakterieller Hüllproteine als Bindungsmatrix für die Kopplung funktionaler Moleküle mit dem Ziel, sensorische Schichten zu erzeugen. Bakterielle Hüllproteine sind biologische SAMs, anderen Oberfläche sich modifizierbare COOH-, NH2- und OH-Gruppen befinden. Die Ausbildung polymerer Strukturen erfolgt dabei in wässrigen Systemen und auf Oberflächen. Im Zuge der boomenden Entwicklung von Biosensoren werden insbesondere Biotemplate gesucht, die zwischen biologischer Komponente und Sensoroberfläche vermitteln. Bakterielle Hüllproteine stellen eine solche Zwischenschicht dar. Als Anwendungsbeispiel wurden die Proteine daher mit einem FRET-Paar und Thrombin und Kanamycin-Aptameren modifiziert. Hierbei wurden das FRET-Paar H488 und H555 an die bakteriellen Hüllproteine der beiden Haldenisolate A12 und B53 mittels EDC mit einer Modifizierungsrate von 0,54 molFarbstoff/molProtein kovalent gebunden. Bei der vorhandenen p4-Symmetrie bedeutet dies, dass ein FRET-Paar pro Einheitszelle vorhanden war. Der Nachweis eines Energietransfers zwischen den beiden am Protein gebundenen Fluoreszenzfarbstoffen H488 und H555 erfolgte mittels statischer und zeitaufgelöster Fluoreszenzmessung. Die Ergebnisse zeigten, dass ein Energietransfer nur möglich war, wenn die Proteine in polymerer Form vorlagen, unabhängig davon, ob sich die Proteine immobilisiert an einer Oberfläche oder in wässriger Lösung befanden. Mittels Variieren des Donor-Akzeptor-Verhältnisses konnte ein maximaler Energietransfer von 40 % generiert werden, wenn das Verhältnis der Fluoreszenzfarbstoffe von Donor und Akzeptor 4 betrug. Die Fluoreszenzintensität der Fluorophore wurde durch die Bindung an die Proteine nicht verringert oder gelöscht. Dies legt nahe, dass die Farbstoffe in den hydrophoben Poren immobilisiert wurden und die Poren die Fluoreszenzfarbstoffe schützen. Um weitere Aussagen über die Lage der gebundenen Fluoreszenzfarbstoffe zu erhalten, wurden die bakteriellen Hüllproteine der Stämme A12 und B53 enzymatisch verdaut und die Fragmente mittels SEC und SDS-PAGE untersucht. Dabei zeigten sich je nach Enzym und Protein unterschiedliche Bandenmuster bezüglich modifizierter und nativer Hüllproteine. Dies belegt, dass die Fluoreszenzfarbstoffe an NH2-und COOH-Gruppen der Proteine gebunden wurden und so teilweise den enzymatischen Verdau hinderten. Die SEC deutet an, dass die Fluoreszenzfarbstoffe an verschiedenen Stellen am Protein gebunden wurden. In einem zweiten Beispiel wurde das bakterielle Hüllprotein von A12 mit einem Aptamer modifiziert. Aptamere sind kurze einzelsträngige Oligonukleotide, die u.a. mittels ihrer ausgebildeten 3D-Struktur spezifisch Zielstrukturen reversibel binden können. Die hier verwendeten Aptamere binden spezifisch Thrombin und Kanamycin. Die Aptamere wurden mit Hilfe einer der beiden Vernetzer PMPI oder Sulfo-SMCC an die bakteriellen Hüllproteine kovalent gebunden. Nach dem Modifizieren der Proteine wurden diese auf entsprechenden Sensorchips immobilisiert und die Aktivität des gekoppelten Aptamers mittels Affinitätsmessungen, SPR-Spektroskopie und QCM-D-Messungen analysiert. Die Funktion des gebundenen Thrombinaptamers konnte mittels Affinitätsmessungen und QCM-D nachgewiesen werden und entspricht in beiden Fällen einer Bindung von 2 nmol Thrombin pro Quadratzentimeter. Die Funktionalität des Kanamycinaptamers sollte mittels SPR bestimmt werden, jedoch konnte keine Funktionalität des gekoppelten Kanamycinaptamers nachgewiesen werden. Alle Messungen bestätigten jedoch, dass die Bindungsmatrix aus bakteriellen Hüllproteinen keinerlei oder nur ein sehr geringes Hintergrundsignal liefert. Werden nun beide Komponenten, FRET-Paar und Aptamere, an das Protein gebunden, ist es möglich, eine sensorische Schicht zu erzeugen. Die Zielstruktur, welche detektiert werden soll, wird an das Aptamer gebunden und so in räumliche Nähe zur Sensorfläche gebracht. Stell die Zielstruktur einen Fluoreszenzlöscher dar, so wird der Energietransfer durch die räumliche Nähe des Fluoreszenzlöscher gestört. Die Detektion des Zielmoleküls erfolgt nun über die Änderung von Fluoreszenzintensitäten. Die hier vorgelegte Arbeit soll einen Grundstein legen für die Entwicklung eines solchen Sensors und insbesondere die Detektion eines Energietransfers optimieren und Schwachstellen in der Detektion nachweisen. Die systematische Untersuchung der Fluoreszenzfarbstoffe auf dem Protein ermöglichen es, in zukünftigen Arbeiten einen FRET zweifelsfrei zu detektieren. Die Modifizierung von bakteriellen Hüllproteinen von A12 mit Aptameren und die Detektion der Funktionalität der Aptamere mittels verschiedener Methoden zeigte auf, dass die bakteriellen Hüllproteine als universelle Bindungsmatrix für sensorische Moleküle dienen können, bei denen Affinitätsmessungen, SPR- oder QCM-D-Messungen genutzt werden. Besonders hervorzuheben ist, dass bakterielle Hüllproteine nahezu kein Hintergrundsignal liefern und aufgrund ihrer dünnen Monolage von etwa 6 - 9 nm die Sensitivität der Messungen nur gering beeinträchtigen.