Universiẗat, Diss., 2004--Marburg.

Universiẗat, Diss., 2005--Bonn.

University, Diss., 2003--Bremen.

Universiẗat, Diss., 2004--Bremen.

Universiẗat, Diss., 2004--Bremen.

Freie Universiẗat, Diss., 2005--Berlin. / Dateiformat: zip, Dateien im PDF-Format. Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2005.

Ameisen der Gattung Camponotus beherbergen bakterielle Symbionten der Gattung Blochmannia in spezialisierten Zellen des Mitteldarms (Blochmann, 1882; Buchner, 1965; Sauer, 2000; Schröder et al., 1996). Die Genomsequenzierung dieser Symbionten zeigte, dass Blochmannia, ähnlich den Symbionten von Blattläusen, hauptsächlich Gene der Aminosäurebiosynthese beibehalten hat (Degnan et al., 2005; Gil et al., 2003). Die Relevanz dieser nahrungsaufwertenden Funktion konnte experimentell bestätigt werden (Feldhaar et al., 2007). Ein Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Aufklärung der dynamischen Interaktion der beiden Partner während des komplexen Lebenszyklus des holometabolen Wirtes. Frühere Studien deuteten darauf hin, dass die Symbiose vor allem während der Larven- und Puppenphasen von Bedeutung sein könnte (Feldhaar et al., 2007; Wolschin et al., 2004; Zientz et al., 2006). Mit fluoreszenter in situ Hybridisierung (FISH) und konfokaler Laserscanning Mikroskopie konnte in der vorliegenden Arbeit die Lokalisierung von B. floridanus während der wichtigsten Entwicklungsstadien aufgeklärt werden. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Symbionten schon im ersten Larvenstadium in spezialisierten Zellen um den Darm angeordnet sind, aber in späteren Stadien nicht, wie bisher angenommen, auf diese Bakteriozyten beschränkt sind, sondern bis zum Schlupf der jungen Arbeiterinnen massiv andere Darmzellen infizieren. Übereinstimmend mit Bestimmungen der Zellzahl in den verschiedenen Wirtsstadien ist die Anzahl der Symbionten gegen Ende der Metamorphose am höchsten. Die Symbiose degeneriert in sehr alten Arbeiterinnen, gut gefüllte Bakteriozyten werden jedoch noch monatelang beibehalten. Mit Macroarray- und qRT- PCR- basierten Transkriptomanalysen wurde die Expression der bakteriellen Gene in charakteristischen Entwicklungsstadien des Wirtes untersucht. Allgemein zeigen vor allem Gene für molekulare Chaperons und bestimmte bakterielle Grundfunktionen eine hohe Expression. Aber auch viele Gene, die möglicherweise wichtige Funktionen in der Symbiose besitzen, wie die Biosynthese essentieller Aminosäuren und das Recycling von Stickstoffverbindungen, zeigen ein hohes absolutes Transkriptlevel. Zudem besteht eine positive Korrelation zwischen dem Expressionsniveau und dem GC- Gehalt der Gene, die in dem höheren Selektionsdruck und damit einer geringeren Mutationsrate der essentiellen Gene begründet liegt (Schaber et al., 2005). Durch Proteinanalysen konnte bestätigt werden, dass die Faktoren mit der höchsten absoluten Transkription die dominanten Proteine der Symbionten darstellen. In den unterschiedlichen Entwicklungsstadien zeigen viele Gene eine deutliche Dynamik, deren Ausmaß aber, verglichen mit freilebenden Bakterien, gering ist. Aus den Expressionsprofilen aufeinanderfolgender Gene lassen sich mögliche Transkriptionseinheiten ableiten, die teilweise auch experimentell bestätigt wurden. Oftmals zeigen auch Gene, die nicht in Transkriptionseinheiten angeordnet sind, aber verwandten Stoffwechselwegen angehören, ähnliche Muster. Dies deutet auf das Vorhandensein grundlegender Genregulations-mechanismen hin, obwohl im Genom von B. floridanus nur noch sehr wenige Transkriptionsfaktoren codiert sind (Gil et al., 2003). Auf übergeordneter Ebene zeigt sich, dass bei Symbionten aus späten Puppenstadien viele symbioserelevante Gene im Vergleich zu Genen des Grundmetabolismus eine erhöhte Expression zeigen. Dies betrifft besonders die Biosynthese aromatischer und verzweigter Aminosäuren, die in diesen Stadien vom Wirt in hoher Menge benötigt werden, während die internen Reserven gleichzeitig zur Neige gehen. Dies äußert sich auch im deutlichen Abfallen der Speicherproteinmenge des Wirts gegen Ende der Puppenphase. Die festgestellte Veränderung der Symbiontenzahl übertrifft das geringe Ausmaß der Genregulation um ein Vielfaches. Die Bakterien liegen in jedem Stadium polyploid mit bis zu 100 Genomkopien vor, dieser Polyploidiegrad bleibt jedoch während der gesamten Wirtsentwicklung weitestgehend konstant. Somit scheint die Kontrolle des Wirts über die bakterielle Vermehrung der entscheidende Faktor dieser Symbiose zu sein. Die verbleibenden regulatorischen Fähigkeiten der Bakterien stellen möglicherweise eine Feinjustierung von optimierten Produktionseinheiten dar, deren Anzahl nach den Bedürfnissen des Wirtes verändert wird. Insgesamt konnten in der vorliegenden Arbeit neue Einblicke in das komplexe Zusammenleben von Blochmannia und Camponotus gewonnen werden, die zu einem besseren Verständnis der biologischen Funktion und der grundlegenden Mechanismen dieser Symbiose führen. Eine der wichtigsten Fragestellungen nach dem Sinn einer nahrungsaufwertenden Symbiose für einen Nahrungsgeneralisten konnte mit starken Hinweisen auf eine stadienabhängige Relevanz der Symbiose beantwortet werden, die den enormen evolutionären Erfolg dieser Ameisengattung erklären könnte.  / Ants of the genus Camponotus harbor bacterial endosymbionts of the genus Blochmannia in specialized cells of their midgut (Blochmann, 1882; Buchner, 1965; Sauer, 2000; Schröder et al., 1996). The complete sequencing of the symbiont’s genome revealed, that Blochmannia, comparable to the symbionts of aphids, mainly retained genes involved in the biosynthesis of essential amino acids (Degnan et al., 2005; Gil et al., 2003). The biological relevance of a nutritional upgrading by Blochmannia could be confirmed experimentally (Feldhaar et al., 2007). One focus of this thesis was the elucidation of the dynamic interactions between the two partners during the complex life cycle of the holometabolic host animal. Previous studies pointed towards a temporal relevance of this symbiosis especially during larval and pupal development (Feldhaar et al., 2007; Wolschin et al., 2004; Zientz et al., 2006). In this thesis the localization of B. floridanus could be documented throughout all life stages of the host by fluorescent in situ hybridization (FISH) and confocal laser scanning microscopy. A layer of densely filled bacteriocytes surrounding the gut could already be identified in first instar larvae. In contrast to previous assumptions, the bacteria are not restricted to these cells in later stages, as until the eclosion of the young adult workers bacteria massively infect other midgut cells. Concordant with previous findings, bacterial load is highest at the end of metamorphosis and symbiont numbers decrease in older workers, yet densely filled bacteriocytes are still visible after several months. The expression of the bacterial genes during characteristic life stages of the C. floridanus was assessed by macroarray and qRT- PCR- based experiments. In general, especially molecular chaperones, central basic metabolism and may putative symbiosis related factors like pathways leading to essential amino acids or nitrogen recycling show highest absolute expression levels. A positive correlation between expression level and GC- content of the genes can be observed, which is caused by a higher selection pressure and lower mutation rate of these essential factors (Schaber et al., 2005). Protein analyses confirmed the correlation between gene expression and translation of the most abundant factors. Many B. floridanus genes exhibit a dynamic expression during the different host stages but the extent of this gene regulation is modest as compared to free living bacteria. Expression profiles of genes located next to each other on the genome allow proposal of local transcription units, which were confirmed experimentally in several cases. Often genes that are not clustered locally but belong to related metabolic functions also exhibit similar expression patterns. This indicates the existence of basic mechanisms of gene regulation despite the low number of transcription factors annotated in the B. floridanus genome (Gil et al., 2003). In late pupal stages symbiosis related genes often show a higher expression compared to basic metabolic functions. This especially includes biosynthetic pathways for aromatic and branched amino acids, which are needed by the host at this stage in increased amounts, while internal storages are depleted. This could be demonstrated by the significant decrease in storage proteins of the host at the end of the pupal phase. The observed change in bacterial numbers per host exceeds the extent of bacterial gene regulation by far. The symbionts are polyploid in each host stage with up to 100 genome copies per cell. The degree of polyploidy is largely constant during host development. Thus the control over bacterial reproduction seems to be the decisive factor in this symbiosis. The residual regulatory capacities of the symbionts might represent a mechanism of fine tuning of a production unit that has been streamlined by evolution and whose numbers are adjusted according to the host’s needs. In conclusion, this thesis delivers new insights into the complex symbiosis of Blochmannia and Camponotus leading to a better understanding of its biological function and the underlying mechanisms. One of the central mysteries concerning the need of a symbiont for nutritional upgrading for an omnivorous host could be explained by a temporal, stage- dependent relevance of this symbiosis, possibly being the reason for the enormous evolutionary success of this ant genus.

Streptococcus pneumoniae (Pneumococcus) is one of the leading causes of childhood meningitis,pneumonia and sepsis. Despite the availability of childhood vaccination programs and antimicrobial agents, childhood pneumococcal meningitis is still a devastating illness with mortality rates among the highest of any cause of bacterial meningitis. Especially in low-income countries, where medical care is less accessible, mortality rates up to 50 % have been reported. In surviving patients, neurological sequelae, including hearing loss, focal neurological deficits and cognitive impairment, is reported in 30 to 50 %. Growing resistance of pneumococci towards conventional antibiotics emphasize the need for effective therapies and development of effective vaccines against Streptococcus pneumoniae. One major virulence factor of Streptococcus pneumoniae is the protein toxin Pneumolysin (PLY). PLY belongs to a family of structurally related toxins, the so-called cholesterol-dependent cytolysins (CDCs). Pneumolysin is produced by almost all clinical isolates of the bacterium. It is expressed during the late log phase of bacterial growth and gets released mainly through spontaneous autolysis of the bacterial cell. After binding to cholesterol in the host cell membranes, oligomerization of up to 50 toxin monomers and rearrangement of the protein structure, PLY forms large pores, leading to cell lysis in higher toxin concentrations. At sub-lytic concentrations, however, PLY mediates several other effects, such as activation of the classic complement pathway and the induction of apoptosis. First experiments with pneumococcal strains, deficient in pneumolysin, showed a reduced virulence of the organism, which emphasizes the contribution of this toxin to the course of bacterial meningitis and the urgent need for the understanding of the multiple mechanisms leading to invasive pneumococcal disease. The aim of this thesis was to shed light on the contribution of pneumolysin to the course of the disease as well as to the mental illness patients are suffering from after recovery from pneumococcal meningitis. Therefore, we firstly investigated the effects of sub-lytic pneumolysin concentrations onto primary mouse neurons, transfected with a GFP construct and imaged with the help of laser scanning confocal microscopy. We discovered two major morphological changes in the dendrites of primary mouse neurons: The formation of focal swellings along the dendrites (so-called varicosities) and the reduction of dendritic spines. To study these effects in a more complex system, closer to the in vivo situation, we established a reproducible method for acute brain slice culturing. With the help of this culturing method, we were able to discover the same morphological changes in dendrites upon challenge with sub-lytic concentrations of pneumolysin. We were able to reverse the seen alterations in dendritic structure with the help of two antagonists of the NMDA receptor, connecting the toxin´s mode of action to a non-physiological stimulation of this subtype of glutamate receptors. The loss of dendritic spines (representing the postsynapse) in our brain slice model could be verified with the help of brain slices from adult mice, suffering from pneumococcal meningitis. By immunohistochemical staining with an antibody against synapsin I, serving as a presynaptic marker, we were able to identify a reduction of synapsin I in the cortex of mice, infected with a pneumococcal strain which is capable of producing pneumolysin. The reduction of synapsin I was higher in these brain slices compared to mice infected with a pneumococcal strain which is not capable of producing pneumolysin, illustrating a clear role for the toxin in the reduction of dendritic spines. The fact that the seen effects weren´t abolished under calcium free conditions clarifies that not only the influx of calcium through the pneumolysin-pore is responsible for the alterations. These findings were further supported by calcium imaging experiments, where an inhibitor of the NMDA receptor was capable of delaying the time point, when the maximum of calcium influx upon PLY challenge was reached. Additionally, we were able to observe the dendritic beadings with the help of immunohistochemistry with an antibody against MAP2, a neuron-specific cytoskeletal protein. These observations also connect pneumolysin´s mode of action to excitotoxicity, as several studies mention the aggregation of MAP2 in dendritic beadings in response to excitotoxic stimuli. All in all, this is the first study connecting pneumolysin to excitotoxic events, which might be a novel chance to tie in other options of treatment for patients suffering from pneumococcal meningitis. / Streptococcus pneumoniae ist einer der Hauptauslöser für bakterielle Meningitis, Lungenentzündung und Sepsis. Ungeachtet der Tatsache, dass es heutzutage viele Impfprogramme zur Prävention, sowie Antibiotika zur Behandlung gibt, ist die bakterielle Meningitis im Kindesalter, ausgelöst durch S. pneumoniae, immer noch eine ernstzunehmende Krankheit mit Sterberaten von bis zu 50 %. Bei 30 bis 50 % der Patienten, die die Krankheit überstehen, bleiben teilweise schwere neurologische Störungen zurück. Die steigende Resistenz des Erregers gegenüber herkömmlichen Antibiotika macht zudem die Dringlichkeit zur Entwicklung effektiver Therapieansätze deutlich. Ein Hauptpathogenitätsfaktor von Streptococcus pneumoniae ist das Proteintoxin Pneumolysin (PLY). PLY gehört zu einer Familie strukturell verwandter Toxine; die sogenannten cholesterinabhängigen Cytolysine (CDCs). Das Toxin wird hauptsächlich nach spontaner Autolyse des Bakteriums freigesetzt. Nach Bindung des Proteins an das Cholesterin in den Zellmembranen des Wirtsorganismus, Oligomerisierung von bis zu 50 Toxinmonomeren und Umordnung der Proteinstruktur, bildet das Toxin Poren in der Zellmembran, die in höheren Konzentrationen von PLY zur Zelllyse führen. In niedrigeren Konzentrationen löst das Toxin jedoch verschiedene andere Prozesse, darunter Apoptose und Aktivierung des Komplementsystems, aus. Erste Experimente, die mit einem mutierten Pneumokokkenstamm (unfähig, Pneumolysin zu exprimieren) durchgeführt wurden, konnten eine reduzierte Virulez des Erregers zeigen, was die Beteiligung des Toxins am Verlauf der Krankheit verdeutlicht. Ziel vorliegender Arbeit war, die Beteiligung von Pneumolysin sowohl am Verlauf der bakteriellen Meningitis, hervorgerufen durch Pneumolysin, zu erforschen, als auch dessen Beteiligung an der Entstehung von neurologischen Störungen, wie sie auch nach Rehabilitation von einer Meningitis noch bestehen können. Dafür wurden zuerst die Effekte von sublytischen Konzentrationen des Toxins auf primäre Mausneuronen (transfiziert mit GFP und mit Hilfe eines Konfokalmikroskopes aufgenommen) erfasst. Dabei zeigten sich hauptsächlich zwei morphologische Veränderungen in den Dendriten der mikroskopierten Neurone: Die Entstehung von fokalen Schwellungen der Dendriten (sogenannte „varicosities“) sowie eine Verminderung der Anzahl von dendritischen Dornfortsätzen (sogenannte „dendritic spines“). Um diese Effekte in einem komplexeren System näher untersuchen zu können, entwickelten wir eine reproduzierbare Methode um akute Gehirnschnitte über längere Zeit kultivieren zu können. Mithilfe dieser Methode konnten wir die Veränderungen, die wir schon in der Primärkultur beobachteten, ebenso nachweisen. Die Entwicklung der fokalen Schwellungen der Dendriten konnten mithilfe zweier Antagonisten des NMDA Rezeptors rückgängig gemacht werden, wodurch erstmals eine Verbindung der Effekte mit einer Aktivierung von Glutamatrezeptoren aufgezeigt wurde. Die Verminderung der Anzahl dendritischer Dornfortsätze im Gehirnschnittmodell wurde untermauert von den Ergebnissen, die wir durch Gehirnschnitte von Mäusen, die tatsächlich an pneumokokkaler Meningitis erkrankt waren, erlangen konnten. Durch immunohistologische Färbungen mit einem Antikörper gegen Synapsin I (ein präsynaptisches Protein) konnten wir eine Reduktion dieses Proteins im Cortex erkrankter Mäuse nachweisen. Die Tatsache, dass die morphologischen Veränderungen der Dendriten ebenfalls in calciumfreiem Puffer beobachtet werden konnten, macht deutlich, dass nicht nur der Calciuminflux durch die Pneumolysinpore verantwortlich ist für dessen Neurotoxizität. Diese These wird untermauert durch die Ergebnisse, die wir mithilfe der Calciummikroskopie erhielten: Die Applikation eines Antagonisten des NMDA Rezeptors konnte den Zeitpunkt des maximalen Calciuminfluxes in die Zelle nach Behandlung mit Pneumolysin hinauszögern. Zudem konnten wir die Schwellungen in den Dendriten auch durch einen Antikörper gegen MAP2 (ein neuronenspezifisches Protein des Zytoskeletts) darstellen, was ebenfalls eine Verbindung von Pneumolysin zu „excitotoxicity“ (Toxizität aufgrund einer Übererregung von Glutamatrezeptoren) darstellt, da verschiedene Studien die Aggregation von MAP2 in fokalen dendritischen Schwellungen als Reaktion auf die Einwirkung von „excitotoxischen“ Stimuli nachweisen konnten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dies die erste Studie ist, die Pneumolysin in Zusammenhang mit einer Überaktivierung von Glutamatrezeptoren bringt, was eine komplett neue Sichtweise darstellt und eventuell neue Möglichkeiten der Therapie für Patienten, die an dieser Form der bakteriellen Hirnhautentzündung leiden, eröffnet.

Techn. University, Diss., 2007--Darmstadt.

Freie Universiẗat, Diss., 2006--Berlin. / Dateiformat: zip, Dateien im PDF-Format.