Einleitung: Fibroblasten bilden essentielle Komponenten des Bindegewebes und reagieren auf Bestrahlung mit langwelligem Licht. In der Zellkultur lässt sich durch Lichtsignale eine gerichtete Migration (= Phototaxis) induzieren. Da die Migration von Fibroblasten eine zentrale Rolle für die Wundheilung und Regeneration des Bindegewebes spielt, hat die Phototherapie mit langwelligem, nicht-thermischem Licht besondere klinische Bedeutung erlangt. Eindeutige Vorgaben für phototherapeutische Anwendungsparameter existieren bisher jedoch nicht. Fragestellung: Frühere Versuchsanordnungen zur vitalmikroskopischen Untersuchung der Phototaxis von 3T3-Fibroblasten arbeiteten in geschlossenen Kulturflaschen mit Latex- Kügelchen als Lichtquellen, die von externen Strahlungsquellen aktiviert wurden. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung einer faseroptischen Anordnung mit freier Positionierbarkeit in der offenen Kulturschale. Die primäre Fragestellung war die Eignung der Methode zur Erstellung eines Aktionsspektrums für Phototaxis photoresponsiver, adhärent wachsender Zellen. Material und Methoden: Die Versuche wurden mit NIH-3T3-Zellen der Schweizer Maus durchgeführt. Um die Ergebnisse nicht durch Fremd-Chromophore zu verfälschen, wurden native Zellen ohne Färbemethoden vitalmikroskopisch untersucht. Eine speziell entwickelte Faseroptik und LED-Lichtquellen mit verschiedenen Wellenlängen ermöglichten die direkte Einbringung und Positionierung der Lichtsignale auf dem Boden der Kulturschale. Ein wissenschaftliches Bildbearbeitungsprogramm wurde durch ein Plug-In so modifiziert, dass die Bewegungs- und Zeitparameter halbautomatisch erfasst werden konnten. Ergebnisse: Bei 18 von 44 Langzeitversuchen konnte eindeutiges phototaktisches Verhalten mit Zellkontakt zur Lichtquelle induziert werden. In 16 Fällen kam es zur migratorischen Annäherung und in 10 Fällen zu keiner Reaktion bzw. einer diskret negativen Phototaxis. Das positive phototaktische Verhalten der beiden reagierenden Gruppen war hochsignifikant, der zweiseitige p-Wert des Binomialtests beträgt 0,000388. Bei 77,3 % der Versuche konnte positive Phototaxis demonstriert werden. Schlussfolgerungen: Das neu entwickelte Verfahren eignet sich zur Untersuchung einer Phototaxis und kann damit prinzipiell zur Erstellung von phototaktischen Aktionsspektren eingesetzt werden. Im Vergleich zu bisherigen Methoden können die Bestrahlungsstärken direkt am Lichtwellenleiter gemessen und unerwünschte Fremdkörper-induzierte Wechselwirkungen eliminiert werden. Durch die freie Positionierbarkeit der Lichtquelle in der Kulturschale können die zu beobachtenden Zellen beliebig ausgewählt werden. / Background: Fibroblasts are essential constituents of connective tissue and react upon irradiation with long-wavelength light. In cell culture, directed migration (= phototaxis) can be induced by light stimuli. Fibroblast migration and activity play a central role for wound healing and connective tissue regeneration. In consequence, phototherapy with non-thermal, long wavelength light obtained increasing clinical importance. However, accepted guidelines for phototherapeutical treatment parameters are still lacking. Objective: Existing assays for microscopic observation of phototactic reaction of 3T3- fibroblasts in a live cell chamber use closed cell culture flasks with small light-scattering latex particles attached to the surface of the flask bottom prior to cell seeding, which can be illuminated by an external light source. The present work describes the development of a fiberoptic assembly providing free positioning of the light source in an open culture dish. The primary objective is the eligibility of this method for determination of a phototactic action spectrum for photoresponsive adherent cell species. Materials and Methods: Experiments were conducted using Swiss mouse NIH-3T3-cells. Native cells without staining were used for elimination of potential dye-induced cell-light interferences. A light microscope with field illumination shutter simulation and live cell chamber was used in combination with a specially devised LED-light-fed fiberoptic assembly providing different wavelengths, which could be directly positioned on the inner bottom of the culture dish. A scientific image processing application was modified by a special plug-in for semi-automatic acquisition of cellular locomotion parameters and temporal data token. Results: A total of 44 experiments were conducted. 18 essays resulted in full phototactic reaction characterized by pseudopodium contact with the fiberoptic aperture, another 16 essays showed migratory approximation without direct contact with the light source. 10 essays displayed no reaction or discrete negative phototaxis. The positive phototaxis of the two responding groups was highly significant in the two-sided binomial test (p = 0.000388). For 77.3 % of the experiments positive phototaxis could be demonstrated. Conclusions: The newly developed assay is appropriate for the induction of phototactic behaviour and can be utilized for the determination of phototactic action spectra. In contrast to existing methods the irradiances can be measured directly at the aperture of the optical fiber and biasing foreign object-induced effects can be eliminated. Due to arbitrary positioning of the light source the cells can be chosen freely for examination.

Einleitung: Fibroblasten bilden essentielle Komponenten des Bindegewebes und reagieren auf Bestrahlung mit langwelligem Licht. In der Zellkultur lässt sich durch Lichtsignale eine gerichtete Migration (= Phototaxis) induzieren. Da die Migration von Fibroblasten eine zentrale Rolle für die Wundheilung und Regeneration des Bindegewebes spielt, hat die Phototherapie mit langwelligem, nicht-thermischem Licht besondere klinische Bedeutung erlangt. Eindeutige Vorgaben für phototherapeutische Anwendungsparameter existieren bisher jedoch nicht. Fragestellung: Frühere Versuchsanordnungen zur vitalmikroskopischen Untersuchung der Phototaxis von 3T3-Fibroblasten arbeiteten in geschlossenen Kulturflaschen mit Latex- Kügelchen als Lichtquellen, die von externen Strahlungsquellen aktiviert wurden. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung einer faseroptischen Anordnung mit freier Positionierbarkeit in der offenen Kulturschale. Die primäre Fragestellung war die Eignung der Methode zur Erstellung eines Aktionsspektrums für Phototaxis photoresponsiver, adhärent wachsender Zellen. Material und Methoden: Die Versuche wurden mit NIH-3T3-Zellen der Schweizer Maus durchgeführt. Um die Ergebnisse nicht durch Fremd-Chromophore zu verfälschen, wurden native Zellen ohne Färbemethoden vitalmikroskopisch untersucht. Eine speziell entwickelte Faseroptik und LED-Lichtquellen mit verschiedenen Wellenlängen ermöglichten die direkte Einbringung und Positionierung der Lichtsignale auf dem Boden der Kulturschale. Ein wissenschaftliches Bildbearbeitungsprogramm wurde durch ein Plug-In so modifiziert, dass die Bewegungs- und Zeitparameter halbautomatisch erfasst werden konnten. Ergebnisse: Bei 18 von 44 Langzeitversuchen konnte eindeutiges phototaktisches Verhalten mit Zellkontakt zur Lichtquelle induziert werden. In 16 Fällen kam es zur migratorischen Annäherung und in 10 Fällen zu keiner Reaktion bzw. einer diskret negativen Phototaxis. Das positive phototaktische Verhalten der beiden reagierenden Gruppen war hochsignifikant, der zweiseitige p-Wert des Binomialtests beträgt 0,000388. Bei 77,3 % der Versuche konnte positive Phototaxis demonstriert werden. Schlussfolgerungen: Das neu entwickelte Verfahren eignet sich zur Untersuchung einer Phototaxis und kann damit prinzipiell zur Erstellung von phototaktischen Aktionsspektren eingesetzt werden. Im Vergleich zu bisherigen Methoden können die Bestrahlungsstärken direkt am Lichtwellenleiter gemessen und unerwünschte Fremdkörper-induzierte Wechselwirkungen eliminiert werden. Durch die freie Positionierbarkeit der Lichtquelle in der Kulturschale können die zu beobachtenden Zellen beliebig ausgewählt werden.:INHALTSVERZEICHNIS IV ABBILDUNGSVERZEICHNIS VII TABELLENVERZEICHNIS IX ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS X 1. EINLEITUNG 1 2. DEFINITIONEN UND STAND DER FORSCHUNG 5 2.1 LICHT 5 2.1.1 Sonnenlicht 5 2.1.2 Licht in der Physik 5 2.1.3 Licht in der Biologie 6 2.1.3.1 Taxis 7 2.1.4 Licht in der Medizin 8 2.1.4.1 Historischer Überblick 8 2.2 PHOTOBIOLOGIE VON ROT UND NAHINFRAROT 10 2.2.1 Photochemische Grundlagen 10 2.2.2 Haut 11 2.2.2.1 Aufbau und Funktion 11 2.2.2.2 Optische Eigenschaften 12 2.2.3 Fibroblasten 13 2.2.4 Zellmigration 15 2.2.5 Mitochondrien 16 2.3 PHOTOTAXIS BEI 3T3-FIBROBLASTEN 17 3. FRAGESTELLUNG 23 4. MATERIAL UND METHODEN 25 4.1 GERÄTE, LABORMATERIALIEN UND SOFTWARE 25 4.2 ZELLMATERIAL UND KULTURBEDINGUNGEN 25 4.3 ZELLPRÄPARATION 27 4.4 VERSUCHSAUFBAU 27 4.5 SHUTTER-SIMULATION DER OBJEKTBELEUCHTUNG 32 4.6 ZUFUHR VON DESTILLIERTEM WASSER 33 4.7 VERSUCHSABLAUF 33 4.8 VERMESSUNG DES BEWEGUNGSVERHALTENS 35 4.9 STATISTISCHE BERECHNUNG 36 5. ERGEBNISSE 37 5.1 AUSWAHLKRITERIEN FÜR GÜLTIGE VERSUCHE 37 5.2 GRUPPENEINTEILUNG DER GÜLTIGEN VERSUCHE 38 5.2.1 Die Gruppe "Touchdown" (TD) 38 5.2.2 Die Gruppe "Annäherung/Closer" (CL) 39 5.2.3 Die Gruppe "still/entf./no reaction" (NO) 39 5.2.4 Zusammenfassung des Gruppenverhaltens 40 5.3 GRAFISCHE DARSTELLUNGEN DER AUSGEWERTETEN VERSUCHE 41 5.4 PRIMÄRE FRAGESTELLUNG: PHOTOTAKTISCHE REAKTION 49 5.5 FRAGESTELLUNG 2: EINFLUSS DER MIGRATIONSMODALITÄT 49 5.6 EINFLUSS VON WELLENLÄNGE UND LICHTMODULATION 51 5.6.1 Fragestellung 3: Einfluss der Wellenlänge 51 5.6.2 Fragestellung 4: Einfluss der Pulsationsfrequenz 52 5.7 FRAGESTELLUNG 5: ROLLE DER AUSGANGSPOSITION 53 5.8 LOKOMOTORISCHE PARAMETER 54 5.8.1 Fragestellung 6: Zurückgelegte Wegstrecke 54 5.8.2 Fragestellung 7: Migrationsgeschwindigkeit 56 5.9 FRAGESTELLUNG 8: EINFLUSS DER VITALITÄT 57 5.9.1 Definition der mittleren Vitalität vitmean 57 5.9.2 Definition der relativen Vitalität vitrel 57 5.9.3 Die relative Vitalität vitrel der Zellen FBc, FB1 und FB2 58 5.9.4 Die mittlere Vitalität vitmean in den Versuchsgruppen 59 5.9.5 Die relative Vitalität vitrel des zentralen Fibroblasten 60 5.10 ATYPISCHES ZELLVERHALTEN 61 5.10.1 Atypisches Verhalten in Versuchen mit normalen 3T3-Zellen 61 5.10.1.1 Hohe Geschwindigkeit und große Wegstrecke 61 5.10.1.3 "Überfall" eines Fibroblasten 63 5.10.1.2 Zentraler Fibroblast migriert unter den Lichtwellenleiter 64 5.10.2 Atypisches Verhalten bei frischen humanen Monozyten 66 6. DISKUSSION 68 6.1 ERGEBNISSE 68 6.1.1 Primäre Fragestellung: Phototaktische Reaktion 68 6.1.2 Fragestellung 2: Einfluss der Migrationsmodalität 70 6.1.3 Fragestellung 3: Einfluss der Wellenlänge 71 6.1.4 Fragestellung 4: Einfluss der Pulsationsfrequenz 74 6.1.5 Fragestellung 5: Rolle der Ausgangsposition 78 6.1.6 Fragestellung 6: Zurückgelegte Wegstrecke 79 6.1.6.1 Differenz Startposition - Minimalposition zum LWL 79 6.1.6.2 Insgesamt zurückgelegte Wegstrecke 80 6.1.7 Fragestellung 7: Migrationsgeschwindigkeit 80 6.1.8 Fragestellung 8: Einfluss der Vitalität 81 6.1.9 Atypisches Zellverhalten 83 6.1.9.1 Versuche mit 3T3-Zellen 83 6.1.9.1.1 Hohe Geschwindigkeit und große Wegstrecke 83 6.1.9.1.2 "Überfall" eines Fibroblasten 84 6.1.9.1.3 Phototaxis bei hyperosmotischem Stress 85 6.1.9.2 Atypisches Verhalten bei frischen humanen Monozyten 86 6.1.10 Zusätzliche Fragestellungen 87 6.1.10.1 Wie lange ist die maximale Versuchsdauer im offenen System 88 6.1.10.2 Spielt der Aspekt der potentiellen Verkeimung eine relevante Rolle? 88 6.1.10.3 Spielt die Dimension der Lichtquelle eine objektivierbare Rolle 88 6.1.10.4 Kann die Bestrahlungsstärke gemessen anstatt geschätzt werden 89 6.1.10.5 Können Rückschlüsse auf das "Auge der Zelle" gezogen werden? 90 6.2 SCHLUSSFOLGERUNG 93 6.3 AUSBLICK 94 7. ZUSAMMENFASSUNG 96 7.1 SUMMARY 97 8. LITERATURVERZEICHNIS 98 9. ANLAGEN 117 9.1 LABORGERÄTE UND MATERIALIEN 117 9.1.1 Mikroskope 117 9.1.2 Software: 117 9.1.3 Geräte: 118 9.1.4 Verbrauchsmaterialien 118 9.1.5 Medien, Puffer, Lösungen 119 9.2 EIGENE GERÄTSCHAFTEN 120 9.2.1 Frequenzgenerator 120 9.2.2 Halbleiter-Lichtquellen 121 9.2.2.1 Modulierbare Lichtquelle 121 9.2.2.2 Kohärente Lichtquelle 122 9.2.2.3 Photon Micro-Light LED-Lichtquellen mit Pulsmodus f = 1Hz 124 9.2.2.4 Bestrahlungsstärken der verwendeten Lichtquellen 124 9.2.3 Systemträger 125 9.2.4 LWL und Optokoppler 126 9.2.5 Modifizierte Microsoft-Maus 126 9.2.6 Eigene Software 127 10. DANKSAGUNG 128 11. EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG 130 / Background: Fibroblasts are essential constituents of connective tissue and react upon irradiation with long-wavelength light. In cell culture, directed migration (= phototaxis) can be induced by light stimuli. Fibroblast migration and activity play a central role for wound healing and connective tissue regeneration. In consequence, phototherapy with non-thermal, long wavelength light obtained increasing clinical importance. However, accepted guidelines for phototherapeutical treatment parameters are still lacking. Objective: Existing assays for microscopic observation of phototactic reaction of 3T3- fibroblasts in a live cell chamber use closed cell culture flasks with small light-scattering latex particles attached to the surface of the flask bottom prior to cell seeding, which can be illuminated by an external light source. The present work describes the development of a fiberoptic assembly providing free positioning of the light source in an open culture dish. The primary objective is the eligibility of this method for determination of a phototactic action spectrum for photoresponsive adherent cell species. Materials and Methods: Experiments were conducted using Swiss mouse NIH-3T3-cells. Native cells without staining were used for elimination of potential dye-induced cell-light interferences. A light microscope with field illumination shutter simulation and live cell chamber was used in combination with a specially devised LED-light-fed fiberoptic assembly providing different wavelengths, which could be directly positioned on the inner bottom of the culture dish. A scientific image processing application was modified by a special plug-in for semi-automatic acquisition of cellular locomotion parameters and temporal data token. Results: A total of 44 experiments were conducted. 18 essays resulted in full phototactic reaction characterized by pseudopodium contact with the fiberoptic aperture, another 16 essays showed migratory approximation without direct contact with the light source. 10 essays displayed no reaction or discrete negative phototaxis. The positive phototaxis of the two responding groups was highly significant in the two-sided binomial test (p = 0.000388). For 77.3 % of the experiments positive phototaxis could be demonstrated. Conclusions: The newly developed assay is appropriate for the induction of phototactic behaviour and can be utilized for the determination of phototactic action spectra. In contrast to existing methods the irradiances can be measured directly at the aperture of the optical fiber and biasing foreign object-induced effects can be eliminated. Due to arbitrary positioning of the light source the cells can be chosen freely for examination.:INHALTSVERZEICHNIS IV ABBILDUNGSVERZEICHNIS VII TABELLENVERZEICHNIS IX ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS X 1. EINLEITUNG 1 2. DEFINITIONEN UND STAND DER FORSCHUNG 5 2.1 LICHT 5 2.1.1 Sonnenlicht 5 2.1.2 Licht in der Physik 5 2.1.3 Licht in der Biologie 6 2.1.3.1 Taxis 7 2.1.4 Licht in der Medizin 8 2.1.4.1 Historischer Überblick 8 2.2 PHOTOBIOLOGIE VON ROT UND NAHINFRAROT 10 2.2.1 Photochemische Grundlagen 10 2.2.2 Haut 11 2.2.2.1 Aufbau und Funktion 11 2.2.2.2 Optische Eigenschaften 12 2.2.3 Fibroblasten 13 2.2.4 Zellmigration 15 2.2.5 Mitochondrien 16 2.3 PHOTOTAXIS BEI 3T3-FIBROBLASTEN 17 3. FRAGESTELLUNG 23 4. MATERIAL UND METHODEN 25 4.1 GERÄTE, LABORMATERIALIEN UND SOFTWARE 25 4.2 ZELLMATERIAL UND KULTURBEDINGUNGEN 25 4.3 ZELLPRÄPARATION 27 4.4 VERSUCHSAUFBAU 27 4.5 SHUTTER-SIMULATION DER OBJEKTBELEUCHTUNG 32 4.6 ZUFUHR VON DESTILLIERTEM WASSER 33 4.7 VERSUCHSABLAUF 33 4.8 VERMESSUNG DES BEWEGUNGSVERHALTENS 35 4.9 STATISTISCHE BERECHNUNG 36 5. ERGEBNISSE 37 5.1 AUSWAHLKRITERIEN FÜR GÜLTIGE VERSUCHE 37 5.2 GRUPPENEINTEILUNG DER GÜLTIGEN VERSUCHE 38 5.2.1 Die Gruppe "Touchdown" (TD) 38 5.2.2 Die Gruppe "Annäherung/Closer" (CL) 39 5.2.3 Die Gruppe "still/entf./no reaction" (NO) 39 5.2.4 Zusammenfassung des Gruppenverhaltens 40 5.3 GRAFISCHE DARSTELLUNGEN DER AUSGEWERTETEN VERSUCHE 41 5.4 PRIMÄRE FRAGESTELLUNG: PHOTOTAKTISCHE REAKTION 49 5.5 FRAGESTELLUNG 2: EINFLUSS DER MIGRATIONSMODALITÄT 49 5.6 EINFLUSS VON WELLENLÄNGE UND LICHTMODULATION 51 5.6.1 Fragestellung 3: Einfluss der Wellenlänge 51 5.6.2 Fragestellung 4: Einfluss der Pulsationsfrequenz 52 5.7 FRAGESTELLUNG 5: ROLLE DER AUSGANGSPOSITION 53 5.8 LOKOMOTORISCHE PARAMETER 54 5.8.1 Fragestellung 6: Zurückgelegte Wegstrecke 54 5.8.2 Fragestellung 7: Migrationsgeschwindigkeit 56 5.9 FRAGESTELLUNG 8: EINFLUSS DER VITALITÄT 57 5.9.1 Definition der mittleren Vitalität vitmean 57 5.9.2 Definition der relativen Vitalität vitrel 57 5.9.3 Die relative Vitalität vitrel der Zellen FBc, FB1 und FB2 58 5.9.4 Die mittlere Vitalität vitmean in den Versuchsgruppen 59 5.9.5 Die relative Vitalität vitrel des zentralen Fibroblasten 60 5.10 ATYPISCHES ZELLVERHALTEN 61 5.10.1 Atypisches Verhalten in Versuchen mit normalen 3T3-Zellen 61 5.10.1.1 Hohe Geschwindigkeit und große Wegstrecke 61 5.10.1.3 "Überfall" eines Fibroblasten 63 5.10.1.2 Zentraler Fibroblast migriert unter den Lichtwellenleiter 64 5.10.2 Atypisches Verhalten bei frischen humanen Monozyten 66 6. DISKUSSION 68 6.1 ERGEBNISSE 68 6.1.1 Primäre Fragestellung: Phototaktische Reaktion 68 6.1.2 Fragestellung 2: Einfluss der Migrationsmodalität 70 6.1.3 Fragestellung 3: Einfluss der Wellenlänge 71 6.1.4 Fragestellung 4: Einfluss der Pulsationsfrequenz 74 6.1.5 Fragestellung 5: Rolle der Ausgangsposition 78 6.1.6 Fragestellung 6: Zurückgelegte Wegstrecke 79 6.1.6.1 Differenz Startposition - Minimalposition zum LWL 79 6.1.6.2 Insgesamt zurückgelegte Wegstrecke 80 6.1.7 Fragestellung 7: Migrationsgeschwindigkeit 80 6.1.8 Fragestellung 8: Einfluss der Vitalität 81 6.1.9 Atypisches Zellverhalten 83 6.1.9.1 Versuche mit 3T3-Zellen 83 6.1.9.1.1 Hohe Geschwindigkeit und große Wegstrecke 83 6.1.9.1.2 "Überfall" eines Fibroblasten 84 6.1.9.1.3 Phototaxis bei hyperosmotischem Stress 85 6.1.9.2 Atypisches Verhalten bei frischen humanen Monozyten 86 6.1.10 Zusätzliche Fragestellungen 87 6.1.10.1 Wie lange ist die maximale Versuchsdauer im offenen System 88 6.1.10.2 Spielt der Aspekt der potentiellen Verkeimung eine relevante Rolle? 88 6.1.10.3 Spielt die Dimension der Lichtquelle eine objektivierbare Rolle 88 6.1.10.4 Kann die Bestrahlungsstärke gemessen anstatt geschätzt werden 89 6.1.10.5 Können Rückschlüsse auf das "Auge der Zelle" gezogen werden? 90 6.2 SCHLUSSFOLGERUNG 93 6.3 AUSBLICK 94 7. ZUSAMMENFASSUNG 96 7.1 SUMMARY 97 8. LITERATURVERZEICHNIS 98 9. ANLAGEN 117 9.1 LABORGERÄTE UND MATERIALIEN 117 9.1.1 Mikroskope 117 9.1.2 Software: 117 9.1.3 Geräte: 118 9.1.4 Verbrauchsmaterialien 118 9.1.5 Medien, Puffer, Lösungen 119 9.2 EIGENE GERÄTSCHAFTEN 120 9.2.1 Frequenzgenerator 120 9.2.2 Halbleiter-Lichtquellen 121 9.2.2.1 Modulierbare Lichtquelle 121 9.2.2.2 Kohärente Lichtquelle 122 9.2.2.3 Photon Micro-Light LED-Lichtquellen mit Pulsmodus f = 1Hz 124 9.2.2.4 Bestrahlungsstärken der verwendeten Lichtquellen 124 9.2.3 Systemträger 125 9.2.4 LWL und Optokoppler 126 9.2.5 Modifizierte Microsoft-Maus 126 9.2.6 Eigene Software 127 10. DANKSAGUNG 128 11. EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG 130