L'objectif de ce travail est d'introduire, par ingénierie génétique, un site allostérique dans une enzyme pour moduler son activité catalytique par la liaison d'un ligand choisi. Ces enzymes pourraient servir de senseurs moléculaires pour la détection, voire le dosage du ligand. Nous avons décidé de créer ces sites allostériques dans la beta-lactamase TEM-1 d'E. coli, une enzyme dégradant les antibiotiques de type pénicilline, en réalisant l'ingénierie de trois boucles de l'enzyme. Celles-ci sont proches l'une de l'autre dans l'espace et pourraient servir d'épitope discontinu pour la reconnaissance par un anticorps ou de paratope, à savoir le site de liaison d'un anticorps, pour la reconnaissance d'autres protéines ou de petites molécules. Notre hypothèse de travail est que ces beta-lactamases chimériques partageront certaines similitudes avec les anticorps de camélidés dont le site de reconnaissance n'est constitué que de trois boucles. Comme nous ne savions pas a priori quelles sont les séquences à introduire pour lier la molécule cible, nous avons introduit des séquences dégénérées pour créer une grande banque de mutants et sélectionner dans cette banque les clones ayant une affinité pour le ligand d'intérêt. La partie la plus difficile de ce projet fut la création de la collection d'enzymes mutantes contenant trois boucles dégénérées. La dégénérescence de la boucle 1, située à proximité du site actif, a été réalisée en remplaçant aléatoirement trois résidus. Dans la boucle 2, un peptide aléatoire de cinq, six ou sept résidus a été inséré entre deux cystéines et dans la boucle 3, une insertion de six résidus aléatoires a été réalisée. En pratique, l'ingénierie des boucles 1 et 2 a été effectuée dans la même construction pour créer trois banques (trois tailles d'insert différentes dans la boucle 2). D'autre part, nous disposions déjà de la banque contenant l'insertion dans la boucle 3. Ces banques de première génération ont ensuite subit une sélection in vivo pour ne garder que les clones possédant une certaine activité catalytique, par culture des bactéries infectées sur un milieu contenant de l'ampicilline. Cette étape nous a permis d'avoir un contrôle sur la qualité des banques créées car tous les mutants d'insertions retenus ont obligatoirement une structure tertiaire. Nous avons également montré que la présence de deux résidus cystéines est nécessaire de part et d'autre de l'insert dans la boucle 2 pour maintenir une certaine activité enzymatique. D'autre part, la boucle 1 ne semble pas tolérer d'insertion peptidique et ne permet que la mutagenèse par remplacement. Les banques de première génération ont ensuite été combinées pour créer une banque de seconde génération contenant les trois boucles dégénérées. Cette construction hiérarchisée a permis, avec un bon rendement, la création d'une banque combinatoire de grande taille et de bonne qualité. Grâce à la technique d'expression en surface de phage, cette banque a ensuite été soumise à une sélection in vitro afin d'isoler les clones ayant acquis de l'affinité pour des molécules cibles. Ces ligands sont un ion métallique, le Ni(II), et deux petites molécules organiques, la kanamycine et la sulfanilamide, pour lesquelles une protéine liante serait intéressante comme outil de détection. En ce qui concerne les clones sélectionnés avec le nickel, tous les clones testés contiennent des résidus histidine et montrent une modulation de l'activité en présence du métal, que ce soit une activation ou une inhibition de celle-ci. La meilleure activation a été obtenue pour le clone Ni-5-Amp20-#11, qui voit son activité doublée lorsqu'il est complexé au nickel, tandis que la meilleure inhibition a été obtenue pour le clone Ni-5-#2 avec une diminution de 77 % de l'activité. Quant à la meilleure affinité, elle a été obtenue pour le clone Ni-5-#12 avec une constante de dissociation de 7.10-5 M. Les autres valeurs de Kd varient entre 10-4 M et 10-3 M. Parmi les clones issus de la sélection avec la kanamycine, nous avons trouvé un mutant dont l'activité catalytique est augmentée de 44 % en présence du ligand. Sa constante de dissociation est de 6,6.10-4 M. Quant à la sélection avec la sulfanilamide, elle ne nous a pas permis à ce jour d'isoler des clones ayant acquis une affinité détectable pour cette molécule. Ces résultats nous laissent espérer que la banque construite contient potentiellement des clones ayant la capacité de lier une variété de cibles différentes. Si c'est le cas, ces enzymes chimériques possèdent des avantages sur les anticorps conjugués habituellement utilisés en immuno-détection, car la fonction de reconnaissance et la fonction enzymatique sont portées par la même molécule. Ces protéines pourraient donc être produites facilement et à plus faible coût. De plus, la modulation d'activité permet en principe de détecter la présence du ligand cible en phase homogène.

L'objectif de ce travail est d'introduire, par ingénierie génétique, un site allostérique dans une enzyme pour moduler son activité catalytique par la liaison d'un ligand choisi. Ces enzymes pourraient servir de senseurs moléculaires pour la détection, voire le dosage du ligand. Nous avons décidé de créer ces sites allostériques dans la beta-lactamase TEM-1 d'E. coli, une enzyme dégradant les antibiotiques de type pénicilline, en réalisant l'ingénierie de trois boucles de l'enzyme. Celles-ci sont proches l'une de l'autre dans l'espace et pourraient servir d'épitope discontinu pour la reconnaissance par un anticorps ou de paratope, à savoir le site de liaison d'un anticorps, pour la reconnaissance d'autres protéines ou de petites molécules. Notre hypothèse de travail est que ces beta-lactamases chimériques partageront certaines similitudes avec les anticorps de camélidés dont le site de reconnaissance n'est constitué que de trois boucles. Comme nous ne savions pas a priori quelles sont les séquences à introduire pour lier la molécule cible, nous avons introduit des séquences dégénérées pour créer une grande banque de mutants et sélectionner dans cette banque les clones ayant une affinité pour le ligand d'intérêt. La partie la plus difficile de ce projet fut la création de la collection d'enzymes mutantes contenant trois boucles dégénérées. La dégénérescence de la boucle 1, située à proximité du site actif, a été réalisée en remplaçant aléatoirement trois résidus. Dans la boucle 2, un peptide aléatoire de cinq, six ou sept résidus a été inséré entre deux cystéines et dans la boucle 3, une insertion de six résidus aléatoires a été réalisée. En pratique, l'ingénierie des boucles 1 et 2 a été effectuée dans la même construction pour créer trois banques (trois tailles d'insert différentes dans la boucle 2). D'autre part, nous disposions déjà de la banque contenant l'insertion dans la boucle 3. Ces banques de première génération ont ensuite subit une sélection in vivo pour ne garder que les clones possédant une certaine activité catalytique, par culture des bactéries infectées sur un milieu contenant de l'ampicilline. Cette étape nous a permis d'avoir un contrôle sur la qualité des banques créées car tous les mutants d'insertions retenus ont obligatoirement une structure tertiaire. Nous avons également montré que la présence de deux résidus cystéines est nécessaire de part et d'autre de l'insert dans la boucle 2 pour maintenir une certaine activité enzymatique. D'autre part, la boucle 1 ne semble pas tolérer d'insertion peptidique et ne permet que la mutagenèse par remplacement. Les banques de première génération ont ensuite été combinées pour créer une banque de seconde génération contenant les trois boucles dégénérées. Cette construction hiérarchisée a permis, avec un bon rendement, la création d'une banque combinatoire de grande taille et de bonne qualité. Grâce à la technique d'expression en surface de phage, cette banque a ensuite été soumise à une sélection in vitro afin d'isoler les clones ayant acquis de l'affinité pour des molécules cibles. Ces ligands sont un ion métallique, le Ni(II), et deux petites molécules organiques, la kanamycine et la sulfanilamide, pour lesquelles une protéine liante serait intéressante comme outil de détection. En ce qui concerne les clones sélectionnés avec le nickel, tous les clones testés contiennent des résidus histidine et montrent une modulation de l'activité en présence du métal, que ce soit une activation ou une inhibition de celle-ci. La meilleure activation a été obtenue pour le clone Ni-5-Amp20-#11, qui voit son activité doublée lorsqu'il est complexé au nickel, tandis que la meilleure inhibition a été obtenue pour le clone Ni-5-#2 avec une diminution de 77 % de l'activité. Quant à la meilleure affinité, elle a été obtenue pour le clone Ni-5-#12 avec une constante de dissociation de 7.10-5 M. Les autres valeurs de Kd varient entre 10-4 M et 10-3 M. Parmi les clones issus de la sélection avec la kanamycine, nous avons trouvé un mutant dont l'activité catalytique est augmentée de 44 % en présence du ligand. Sa constante de dissociation est de 6,6.10-4 M. Quant à la sélection avec la sulfanilamide, elle ne nous a pas permis à ce jour d'isoler des clones ayant acquis une affinité détectable pour cette molécule. Ces résultats nous laissent espérer que la banque construite contient potentiellement des clones ayant la capacité de lier une variété de cibles différentes. Si c'est le cas, ces enzymes chimériques possèdent des avantages sur les anticorps conjugués habituellement utilisés en immuno-détection, car la fonction de reconnaissance et la fonction enzymatique sont portées par la même molécule. Ces protéines pourraient donc être produites facilement et à plus faible coût. De plus, la modulation d'activité permet en principe de détecter la présence du ligand cible en phase homogène.

β-lactamase enzymes catalyze the irreversible hydrolysis of the four-membered cyclic amide ring characteristic of β-lactam antibiotics rendering them inactive and useless against pathogenic bacteria. Understanding structure activity relationships between β-lactam antibiotics and β-lactamases is important for designing novel β-lactams, β-lactamase inhibitors, and β-lactam-based fluorescent probes for rapid diagnosis of β-lactam antibiotic resistant infections. The first half of this study focuses on the class A β-lactamase BlaC from Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and addresses intermolecular interactions between BlaC and substrates, inhibitors, and biosensors that influence their kinetic parameters with BlaC and activities against Mtb. The substrate structure activity relationship explained the molecular basis for differential innate resistance of Mtb to faropenem, biapenem, and tebipenem by showing the interactions between BlaC and the lactams that govern differential acyl-intermediate stability and affinity. The inhibitor structure activity relationship revealed features of the BlaC active site that can be exploited to enhance binding and inhibition of BlaC by benzoxaboroles, and demonstrates their utility as potentiators of β-lactam antibiotic activity against Mtb. BlaC-specific β-lactam based fluorescent probes were designed and optimized for Mtb detection. Their utility was demonstrated by detecting down to 10 colony forming units of bacillus Mycobacterium bovis Calmette–Guérin (BCG) in human sputum. The second half of this study focuses on the New Delhi Metallo-β-lactamase-1 (NDM-1), which is rapidly generating bacterial resistance to nearly all β-lactams. The NDM-1 gene encodes a class B1 metallo-β-lactamase enzyme. Purified recombinant NDM-1 was biochemically and biophysically characterized. The crystal structures of apo and monometalated NDM-1 provided structural insight into metal binding and the promiscuous enzymatic activity of NDM-1. Mechanistic details of the NMD-1 reaction were examined by comparing crystal structures of NDM-1 in complex with an unhydrolyzed β-lactam substrate and with hydrolyzed products. These structures were used for quantum mechanics / molecular mechanics simulations to estimate the free energy along the β-lactamase reaction coordinate. The results suggest that NDM-1 uses bulk water as the nucleophile that attacks the β-lactam ring, and a coordinated hydroxide ion or water molecule as the catalytic base depending on pH.

No description available.

No description available.

No description available.

Metallo-beta-lactamases (MBLs) are members of the metallohydrolases family and constitute a very effective resistance mechanism employed by bacteria to escape the action of most beta-lactam antibiotics. Emergence of acquired MBLs among pathogenic species represents a major clinical threat, especially since no efficient inhibitors are available. On the basis of their primary structures, these enzymes have been subdivided in three subclasses (B1, B2 and B3). The enzyme studied in this work, termed BcII, is produced by Bacillus cereus, strain 569/H/9, and is the most studied MBL so far (class B1 ; 227 a.a. ; M.W. 24960 Da). It displays a binuclear active site centre, which can bind various metal ions (e.g. Co2+ and Cd2+), although Zn2+ is the natural cofactor used for beta-lactams hydrolysis. The first part of this work was dedicated to the characterization of the equilibrium folding properties of both the apo and holo forms of BcII. We used a variety of biophysical techniques, including absorbance, circular dichroism and intrinsic fluorescence spectroscopy, nuclear magnetic resonance (NMR), and mass spectrometry (MS). Interestingly, optical measurements revealed that although the apo and dizinc species exhibit undistinguishable tertiary structural organizations, the metal-depleted enzyme shows a significant decrease in its α-helical content, presumably associated with enhanced flexibility. The holoenzyme was found to be much more stable than the zinc-depleted form. Whereas the latter unfold according to a simple two-state mechanism, unfolding of the holoenzyme was found to be non-cooperative, with the population of intermediate species showing 3D structures very similar to the native species. Besides folding studies, we investigated the process of metal binding to BcII. Zinc binding was monitored using complementary techniques, including circular dichroism in the far UV, enzymatic activity measurements, competition with a chromophoric chelator, MS and NMR. Most noticeably, MS and NMR experiments, together with catalytic activity measurements demonstrated that two zinc ions bind cooperatively to the enzyme active site (with K1/K2 ≥ 5, indicating positive cooperativity) and hence that catalysis is associated with the dizinc enzyme species only. Furthermore, competitive experiments with the chromophoric chelator Mag-Fura-2 indicated K2 < 80 nM.

The DNA sequence of the gene coding for the OXA-2 beta-lactamase has been completed. The primary amino acid sequence deduced from the DNA sequence was used to study homologies with other beta-lactamases; no good homologies were observed with any class of beta-lactamase. A more detailed analysis has revealed from comparison of both primary and predicted secondary structure, that the OXA-2 beta-lactamase may be more closely related to class A enzymes. Confirmation that the OXA-2 beta-lactamase is a serine enzyme has come from the DNA sequence and the interaction with mechanism based inactivators. Clavulanic acid and a novel beta-lactamase inhibitor, BRL36148, both interact specifically with the OXA-2 beta-lactamase by branched pathway mechanisms. Analysis of inactivated enzymes by peptide mapping and isoelcetric focusing have revealed that more than one inactive enzyme species is formed with each inactivator. A specific DNA probe was designed to come entirely from within the coding sequence of the OXA-2 beta-lactamase gene. This probe was found to interact only with plasmids specifying the OXA-2 or OXA-3 type enzymes. These results confirm earlier observations that OXA-2 and OXA-3 beta-lactamases are related. Another probe which comprised the whole of the OXA-2 beta-lactamase gene as well as segments of DNA on either side of the gene, was found to hybridise with a number of resistance plasmids. This interaction suggests that multi resistance plasmids carry common segments of DNA. Characterisation of the physical properties of the OXA-2 enzyme by analytical ultracentrifugation have not only confirmed the dimeric nature of this beta-lactamase but have also shown that this enzyme forms aggregates at high protein concentrations. Probing of the enzyme structure with trypsin, strongly points to the OXA-2 beta-lactamase having a domain structure.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo86_1.pdf: 1510824 bytes, checksum: 62b4555e47d568b472501070ff9eaf79 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Faculdade de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / A resistência aos carbapenêmicos pode dar-se através de vários mecanismos, incluindo a expressão de beta-lactamases do tipo carbapenemases. Metalo-beta-lactamases (MBLs) constituem o grupo mais clinicamente importante das carbapenemases, na medida em que elas hidrolisam praticamente todos os beta-lactâmicos e, em alguns casos, também os monobactams (devido a outros mecanismos associados), o que implica em uma vasta redução das opções terapêuticas atualmente disponíveis. O objetivo deste trabalho foi detectar a produção de MBLs em cepas de Pseudomonas aeruginosa resistentes tanto a imipenem quanto a ceftazidima, verificar o perfil de susceptibilidade dos isolados aos mais utilizados grupos de antibióticos comercialmente disponíveis, investigar a ocorrência dos genes blaSPM-1 e blaIMP e realizar a tipagem molecular dos isolados MBL positivos. Foram analisadas 61 amostras do biênio 2002/2003 e 12 amostras do biênio 2008/2009, identificadas em um hospital de ensino. A susceptibilidade aos antimicrobianos foi feita de acordos com os critérios estabelecidos pelo CLSI. A identificação dos isolados MBL positivos seguiu o método de disco-difusão proposto por Arakawa. A detecção dos genes blaSPM-1 e blaIMP foi feita por análise de PCR usando iniciadores específicos. A análise dos fragmentos das macrorestrições do DNA genômico foi feita por PFGE. Os resultados mostraram que 86,3% (63/73) dos isolados resistentes a imipenem e ceftazidima foram confirmados como MBL positivos pelo teste fenotípico. O gene blaSPM-1 foi encontrado em 61 destes isolados. Nenhuma das amostras testadas possuía o gene blaIMP. Quanto aos ensaios de susceptibilidade, foi observado que dos anos 2002 e 2003: 100% dos isolados eram resistentes a ciprofloxacina, gentamicina e amicacina; 44% eram resistentes a piperacilina/tazobactam e 56% mostraram sensibilidade a esta droga. Dos anos 2008 e 2009: 100% dos isolados eram resistentes a ciprofloxacina e gentamicina; 91,6% eram resistentes a amicacina; 8,4% mostraram resistência intermediária a este aminoglicosídeo; 83,3% eram resistentes a piperacilina/tazobactam e 16,7% mostraram sensibilidade a este antimicrobiano. Quando as duas principais drogas para tratamento de infecções causadas por cepas MBL positivas foram analisadas, dos isolados de 2002/2003, apenas 1,63% foram resistentes ao aztreonam; 62,2% tiveram resistência intermediária e 36% mostraram sensibilidade. Dos isolados de 2008/2009, 83,4% foram resistentes e 16,6% apresentaram resistência intermediária, com nenhum isolado mostrando sensibilidade. Quanto à polimixina B, todos os isolados deste trabalho eram sensíveis. A análise dos fragmentos das macrorestrições dos isolados mostrou um único tipo de PFGE (A), com sete subtipos (A1 a A7). Estes achados sugerem que a produção de MBLs mediada por um clone único epidêmico continua sendo um importante mecanismo de resistência aos carbapenems no hospital estudado, como confirmado pela detecção do gene SPM. Além disso, o perfil de pan-resistência encontrado também alerta para a possível presença de múltiplos mecanismos de resistência nos isolados bacterianos, o que sinaliza uma necessidade urgente por estratégias de vigilância e melhoria das práticas de controle de infecções

Les DD-peptidases sont des enzymes impliquées dans la synthèse de la paroi bactérienne. Elles sont aussi appelées "Penicillin Binding Proteins" (PBPs) car elles forment des acyl-enzymes stables avec des antibiotiques de type beta-lactames comme la pénicilline, la stabilité de ces complexes étant à l'origine de l'effet antibiotique. Certaines bactéries sont résistantes aux b-lactames grâce à la production de beta-lactamases, capables d'hydrolyser ces antibiotiques jusqu'à 10E8 fois plus rapidement que les PBPs selon un mécanisme impliquant deux étapes, d'acylation puis de désacylation. Il est généralement accepté que les beta-lactamases ont évolué à partir d'une PBP ancestrale en intégrant au site actif un mécanisme catalytique efficace pour la réaction de déacylation. L'objectif de cette thèse s'inscrit dans la compréhension des mécanismes d'évolution de la catalyse enzymatique au niveau moléculaire. Nous tenterons de reproduire un mécanisme évolutif en créant in vitro une activité b-lactamase à partir d'une DD-peptidase. La protéine de départ pour ce travail est la PBP-A de Thermosynechococcus elongatus, appartenant à une nouvelle famille de PBPs homologue aux beta-lactamases de classe A. L'analyse biochimique de cette protéine suggère que c'est une DD-peptidase, et une approche rationnelle par substitution d'un résidu dans le site actif de PBP-A a permis d'augmenter la vitesse de désacylation de l'acyl-enzyme formé avec la pénicilline d'un facteur 90. L'analyse des structures 3-D de PBP-A sauvage et mutante laisse ouverte la question de savoir comment évoluer cette PBP en beta-lactamase. Ainsi, pour l'évolution dirigée de cette protéine, deux banques ont été construites par approches aléatoire et semi-rationnelle. Il a été possible de sélectionner par "phage display" des enzymes améliorées pour la réaction d'acylation. L'obtention de mutants améliorés pour l'acylation ou la désacylation constitue des premiers pas vers l'évolution de PBP-A en beta-lactamase.