There is a global need for sustainable, renewable and clean energy sources. Microbial production of hydrogen from renewable carbon sources, biorefinery compounds such as succinic acid or from food and drinks industry waste meets all these criteria. Although it has been studied for several decades, there is still no large scale bio-hydrogen production because the rate and yield of hydrogen production are not high enough to render the process economical. The dependency of biological hydrogen production of incipient light energy is also an important factor affecting economics. In order to improve the prospects of biohydrogen as a renewable and sustainable energy alternative, the genetic and process engineering approaches should be helped and targeted by metabolic engineering tools such as metabolic flux balance analysis. The overall aim of this research was the development of computational metabolic flux balance analysis for the study of growth and hydrogen production in Rhodobacter sphaeroides. The research reported in this thesis had two approaches; experimental and computational. Batch culture experiments for growth and hydrogen production by Rhodobacter sphaeroides were performed with either malate or succinate as carbon source and with glutamate as the nitrogen source. Other conditions investigated included; i) aerobic and anaerobic growth, ii) light and dark fermentation for growth, and iii) continuous light and cycled light/dark conditions for hydrogen production. The best growth was obtained with succinate under anaerobic photoheterotrophic conditions with the maximum specific growth rate of 0.0467 h– 1, which was accompanied with the maximum specific hydrogen production rate of 1.249 mmol(gDW.h)– 1. The range of the photon flux used was 5.457 - 0.080 mmol(gDW.h)– 1. The metabolic flux balance model involved 218 reactions and 176 metabolites. As expected the optimised specific rates of growth and hydrogen production were higher than those of the experimental values. The best prediction was for hydrogen production on succinate with computed specific hydrogen production rates in the range of 2.314 - 1.322 mmol(gDW.h)– 1. Sensitivity analyses indicated that the specific growth rate was affected by the nitrogen source uptake rate under aerobic dark condition whereas the flux of protein formation had the largest effect on the specific growth rate under anaerobic light condition.

O presente estudo avaliou o efeito do TDH (tempo de detenção hidráulica) (24 a 1 h) na produção de H2 em reator anaeróbio de leito granular expandido (Expanded Granular Slugde Bed) (ESGB) sob condições mesofílicas (30 ± 2 °C), com cultura mista e a partir do caldo de cana nas concentrações: 5, 10 e 15 g L-1, nos reatores EGSB5, EGSB10 e EGSB15, respectivamente. Foram atingidos valores máximos de produção volumétrica de H2 (PVH) ao decrescer o TDH para: 1 h no EGSB5 (6,96 L d-1 L-1); 1 h no EGSB10 (19,14 L d-1 L-1); e 2 h no EGSB15 (52,40 L d-1 L-1). Os resultados corroboram a afirmação de que reatores de alta taxa como o EGSB suportam aplicação de cargas mais elevadas, visto que o rendimento de H2 (Hydrogen Yield) (HY) máximo (0,73 mol H2 mol-1 hexose) foi observado no EGSB15 para a taxa de carregamento orgânico (TCO) igual a 182,9 kgcarboidrato m-3 d-1. Os HY visualizados no presente estudo foram inferiores aos observados nos estudos em que utilizaram culturas puras, isto pode ocorrer devido ao fato de que o tratamento térmico não é capaz de selecionar apenas culturas produtoras de H2. Foram identificados os possíveis consumos de H2 em consequência à homoacetogênese, com percentuais máximos de ácido acético (HAc) de 59,0 %, 50,0 % e 25,0 % em relação aos demais metabólitos produzidos nos EGSB5, EGSB10 e EGSB15, respectivamente. Devido à provável ocorrência de homoacetogênese o H2 detectado não pode ser inteiramente atribuído a presença de HAc, atribui-se então a produção de H2 à rota de produção de ácido butírico (HBu). Coincidentemente com o HY máximo, as concentrações e percentuais de HBu foram de 1,95 g L-1 e 44,0 % para o EGSB10 no TDH de 4 h, e de 4,07 g L-1 e 43,0 % para o EGSB15 no TDH de 2 h. De modo geral, a redução do TDH de 24 a 1 h melhorou a produtividade de H2. Observou-se devido à elevada PVH, que o caldo de cana pode ser uma alternativa viável para a produção de H2 em larga escala. / The present study evaluated HRT (hydrualic retention time) (24 to 1 h) effect on H2 production in anaerobic expanded granular sludge bed reactor (ESGB) under mesophilic conditions (30 ± 2°C), with mixed culture and sugarcane juice concentration of 5, 10 and 15 g L-1 in EGSB5, EGSB10 and EGSB15, respectively. Maximum hydrogen production rates (HPR) were visualized by decreasing TDH to: 1 h in EGSB5 (6.96 L d-1 L-1); 1 h at EGSB10 (19.14 L d-1 L-1); and 2 h in EGSB15 (52.40 L d-1 L-1). Results attest that high rate reactors such as EGSB support higher loads application, since maximum hydrogen yield (HY) was observed in EGSB15 for the highest organic loading rate (OLR) applied (0.73 mol H2 mol-1 hexose in OLR 182.9 kgcarboidrato m-3 d-1). HY visualized in present study were lower than those observed in studies using pure cultures, this may occur due to heat treatment is not able to select only H2 producing cultures. Possible H2 intakes were observed as a consequence of homoacetogenesis, with maximum acetic acid (HAc) 59.0%, 50.0% and 25.0% for EGSB5, EGSB10 and EGSB15, respectively. Due to probable occurrence of homoacetogenesis the H2 production can\'t be entirely attributed to HAc, then H2 production is attributed to butyric acid (HBu) route. Coincidentally with maximum HY, the HBu concentrations and percentages were 1.95 g L-1 and 44.0% for the EGSB10 in TDH 4 h, 4.07 g L-1 and 43.0% for EGSB15 in TDH 2 h. Overall, the TDH reduction from 24 to 1 h improved H2 productivity. Due to high HPR observed the sugarcane juice can be a feasible alternative for H2 production on large scale.

O hidrogênio (H2) tem sido considerado uma fonte de energia limpa bastante promissora, pois sua combustão origina apenas moléculas de água, sendo uma alternativa ao uso de combustíveis fósseis. Entretanto, os métodos atuais de produção de H2 demandam matérias-primas finitas e uma grande quantidade de energia, tornando a sua obtenção não sustentável. Mais recentemente, a via fermentativa tem sido considerada para a produção de H2, utilizando como matérias-primas efluentes industriais, materiais lignocelulósicos e biomassa de algas, denominado de bio-hidrogênio de primeira, segunda e terceira geração, respectivamente. Neste trabalho foi isolada uma bactéria anaeróbia a partir de uma cultura mista (lodo) de um sistema de tratamento de vinhaça, após pré-tratamento do lodo a pH 3 por 12 horas. Este microrganismo foi identificado com 99% de similaridade como Clostridium beijerinckii com base na sequência do gene RNAr 16S denominado de C. beijerinckii Br21. A temperatura e o pH mais adequados para o crescimento e produção de H2 por esta cultura foi 35 °C e pH inicial 7,0. A bactéria possui a capacidade de utilizar ampla variedade de fontes de carbono para a produção de H2 por fermentação, especialmente, monossacarídeos resultantes da hidrólise de biomassa de algas, tais como glicose, galactose e manose. Foram realizados ensaios em batelada para a produção de H2 com a bactéria isolada empregando diferentes concentrações de glicose e galactose, visando a sua futura utilização em hidrolisados de alga. Os parâmetros cinéticos dos ensaios de fermentação estimados pelo modelo de Gompertz modificado, como a velocidade máxima de produção (Rm), a quantidade máxima de hidrogênio produzido (Hmáx) e o tempo necessário para o início da produção de hidrogênio (fase lag) para a glicose (15 g/L) foram de: 58,27 mL de H2/h, 57,68 mmol de H2 e 8,29 h, respectivamente. Para a galactose (15 g/L), a Rm, Hmáx e foram de 67,64 mL de H2/h, 47,61 mmol de H2 e 17,22 horas, respectivamente. O principal metabólito detectado ao final dos ensaios de fermentação, foi o ácido butírico, seguido pelo ácido acético e o etanol, tanto para os ensaios com glicose, como com galactose. C. beijerinckii é um candidato bastante promissor para a produção de H2 por fermentação a partir de glicose e galactose e, consequentemente, a partir de biomassa de algas como substratos. / Hydrogen (H2), considered an alternative to fossil fuels, is a promising source of clean energy because its combustion originates water molecules only. However, the current H2 production methods require finite raw materials and a large amount of energy, which makes them unsustainable. The fermentative pathway has been considered for H2 production from renewable raw materials such as industrial wastewater, lignocellulosic materials, and algal biomass, the so-called first, second, and third bio-hydrogen generation, respectively. In this work, after pre-treatment at pH 3 for 12 h, a H2-producing bacterium was isolated from a mixed culture (sludge) collected from an anaerobic bioreactor used to treat sugarcane vinasse. The microorganism was identified as Clostridium beijerinckii based on the sequence of the 16S rRNA gene; it was named C. beijerinckii Br21. The most appropriate temperature and initial pH to achieve H2 production by this strain was 35 °C and 7, respectively. The bacterium was able to use a wide variety of carbon sources, especially the monosaccharides glucose, galactose, and mannose resulting from hydrolysis of algal biomass. Batch assays using different concentrations of glucose and galactose were performed to produce H2. The kinetic parameters of the tests were estimated by the Gompertz modified model. The maximum production rate (Rm), the maximum amount of produced H2 (Hmáx), and the phase lag () for glucose and galactose, both at 15 g/L, were 58.27 and 67.64 mL of H2/h, 57.68 and 47.61 mmol of H2, and 8.29 and 17.22 h, respectively. The main metabolite detected at the end of fermentation tests was butyric acid, followed by acetic acid and ethanol. The results indicated that the new C. beijerinckii isolate is a promising candidate for fermentative H2 production from algal biomass.

In this study, bio-hydrogen generation potential of sugar-beet processing wastes (sugar-beet processing wastewater and beet-pulp) through dark fermentation was investigated. For this purpose, four different experimental set-ups were used. In the first set-up, sugar-beet processing wastewater was used along with four different cultures to investigate the effect of culture type on bio-hydrogen production. In addition, unseeded reactor was prepared to investigate bio-hydrogen production potential of indigenous microorganisms. The highest bio-hydrogen production yield (87.7 mL H2/g COD) was observed in the unseeded reactor. In the second set-up, beet-pulp was compared with sugar-beet processing wastewater in terms of bio-hydrogen generation potentials at an initial COD level of 4.5 g/L. In the third set-up, bio-hydrogen productivities of only beet-pulp and co-digestion of beet-pulp and sugar-beet processing wastewater at high COD values were investigated. The results of third set-up revealed that the reactor fed by 20 g/L COD beet-pulp provided the highest bio-hydrogen production yield (95.6 mL H2 /g COD). Finally, in the fourth set-up, the effects of five different pretreatment methods on solubilization of beet-pulp were investigated. Then, three out of five pretreatment methods were chosen to compare the corresponding bio-hydrogen productivities. Maximum bio-hydrogen production yield (115.6 mL H2/g COD) was observed in reactor which contained alkaline pretreated beet-pulp. Based on the results obtained in this study, it is postulated that, bio-hydrogen production from sugar-beet processing wastes by dark fermentation can not only enable waste minimization but also contribute to sustainability via valuable bio-based product formation from wastes, namely bio-hydrogen.

O hidrogênio (H2) tem sido considerado uma fonte de energia limpa bastante promissora, pois sua combustão origina apenas moléculas de água, sendo uma alternativa ao uso de combustíveis fósseis. Entretanto, os métodos atuais de produção de H2 demandam matérias-primas finitas e uma grande quantidade de energia, tornando a sua obtenção não sustentável. Mais recentemente, a via fermentativa tem sido considerada para a produção de H2, utilizando como matérias-primas efluentes industriais, materiais lignocelulósicos e biomassa de algas, denominado de bio-hidrogênio de primeira, segunda e terceira geração, respectivamente. Neste trabalho foi isolada uma bactéria anaeróbia a partir de uma cultura mista (lodo) de um sistema de tratamento de vinhaça, após pré-tratamento do lodo a pH 3 por 12 horas. Este microrganismo foi identificado com 99% de similaridade como Clostridium beijerinckii com base na sequência do gene RNAr 16S denominado de C. beijerinckii Br21. A temperatura e o pH mais adequados para o crescimento e produção de H2 por esta cultura foi 35 °C e pH inicial 7,0. A bactéria possui a capacidade de utilizar ampla variedade de fontes de carbono para a produção de H2 por fermentação, especialmente, monossacarídeos resultantes da hidrólise de biomassa de algas, tais como glicose, galactose e manose. Foram realizados ensaios em batelada para a produção de H2 com a bactéria isolada empregando diferentes concentrações de glicose e galactose, visando a sua futura utilização em hidrolisados de alga. Os parâmetros cinéticos dos ensaios de fermentação estimados pelo modelo de Gompertz modificado, como a velocidade máxima de produção (Rm), a quantidade máxima de hidrogênio produzido (Hmáx) e o tempo necessário para o início da produção de hidrogênio (fase lag) para a glicose (15 g/L) foram de: 58,27 mL de H2/h, 57,68 mmol de H2 e 8,29 h, respectivamente. Para a galactose (15 g/L), a Rm, Hmáx e foram de 67,64 mL de H2/h, 47,61 mmol de H2 e 17,22 horas, respectivamente. O principal metabólito detectado ao final dos ensaios de fermentação, foi o ácido butírico, seguido pelo ácido acético e o etanol, tanto para os ensaios com glicose, como com galactose. C. beijerinckii é um candidato bastante promissor para a produção de H2 por fermentação a partir de glicose e galactose e, consequentemente, a partir de biomassa de algas como substratos. / Hydrogen (H2), considered an alternative to fossil fuels, is a promising source of clean energy because its combustion originates water molecules only. However, the current H2 production methods require finite raw materials and a large amount of energy, which makes them unsustainable. The fermentative pathway has been considered for H2 production from renewable raw materials such as industrial wastewater, lignocellulosic materials, and algal biomass, the so-called first, second, and third bio-hydrogen generation, respectively. In this work, after pre-treatment at pH 3 for 12 h, a H2-producing bacterium was isolated from a mixed culture (sludge) collected from an anaerobic bioreactor used to treat sugarcane vinasse. The microorganism was identified as Clostridium beijerinckii based on the sequence of the 16S rRNA gene; it was named C. beijerinckii Br21. The most appropriate temperature and initial pH to achieve H2 production by this strain was 35 °C and 7, respectively. The bacterium was able to use a wide variety of carbon sources, especially the monosaccharides glucose, galactose, and mannose resulting from hydrolysis of algal biomass. Batch assays using different concentrations of glucose and galactose were performed to produce H2. The kinetic parameters of the tests were estimated by the Gompertz modified model. The maximum production rate (Rm), the maximum amount of produced H2 (Hmáx), and the phase lag () for glucose and galactose, both at 15 g/L, were 58.27 and 67.64 mL of H2/h, 57.68 and 47.61 mmol of H2, and 8.29 and 17.22 h, respectively. The main metabolite detected at the end of fermentation tests was butyric acid, followed by acetic acid and ethanol. The results indicated that the new C. beijerinckii isolate is a promising candidate for fermentative H2 production from algal biomass.

O presente trabalho de pesquisa teve como objetivo principal avaliar o efeito da carga orgânica volumétrica aplicada (COVA) na produção de hidrogênio usando o reator AnSBBR com recirculação operado em batelada e biomassa imobilizada. Para este efeito, o reator foi operado a 30ºC com dois tempos de ciclo (3 e 4 h), alimentado com três concentrações afluentes (3000, 4000 e 5000 mgDQO.L-1), uma velocidade de recirculação de 30 L.h-1, usando glicerol como única fonte de carbono e a biomassa de uma estação de tratamento de abatedouro de aves. A combinação destes fatores fez com que o reator fosse operado com seis cargas orgânicas volumétricas aplicadas diferentes (7565, 9764, 12911, 10319, 13327 e 16216 mgDQO.L-1.d-1). Os resultados mostraram que não existiu uma tendência clara entre a carga orgânica aplicada e a produção de hidrogênio. Porém, os melhores resultados quanto à produção de hidrogênio foram atingidos quando o reator foi operado com 4 horas de tempo de ciclo e alimentado com uma concentração afluente de 5000 mgDQO.L-1 (COVA de 12911 mgDQO.L-1.d-1), sendo sua produtividade molar média de hidrogênio (PrM) de 67,5 molH2.m-3.d-1. Esta condição também atingiu o melhor rendimento molar de hidrogênio por carga orgânica aplicada RMCAS,m e o melhor rendimento molar de hidrogênio por carga orgânica removida (RMCRS,m), sendo estes de 5,2 e 21,1 molH2.kgDQO-1, respectivamente. Adicionalmente foi estudada a diferença na produção de hidrogênio entre o uso de biomassa pré-tratada e não tratada termicamente, cuja análise de variância (ANOVA) mostrou que a diferença não foi estatisticamente significativa. Finalmente o reator foi operado usando glicerina bruta industrial para comparar os resultados com aqueles obtidos operando com glicerol, observando-se uma clara desvantagem na produção de hidrogênio quando foi usada glicerina bruta. Em geral, o reator AnSBBR operado em batelada sequencial apresentou resultados promissores na produção de hidrogênio usando glicerol como fonte de carbono, porém estudos mais profundos ainda são necessários no intuito de otimizar o sistema para a utilização de glicerina bruta. / This study evaluated the influence of applied volumetric organic load on biohydrogen production in an anaerobic sequencing batch biofilm reactor (AnSBBR) with 3.5 L of liquid medium and treating 1.5 L of glycerin based wastewater per cycle at 30ºC. The reactor was operated with two cycle periods (3 and 4 hours), three influent concentrations (3000, 4000 and 5000 mgCOD.L-1), recirculation rate of 30 L.h-1 and an inoculum from a poultry slaughterhouse. Six applied volumetric organic loads (AVOLCT) were generated from the combination of cycle period and influent concentrations (7565, 9764, 12911, 10319, 13327 e 16216 mgCOD.L-1.d-1). There was not a clear relation between the applied volumetric organic load and hydrogen production. However, the highest hydrogen molar production (MPr: 67.5 molH2.m-3 .d-1) was reached when the reactor was operated with a cycle period of 4 h and an influent concentration of 5000 mgCOD.L-1 (AVOLCT: 12911 mgCOD.L-1. d-1). This condition also reached the highest molar yield per removed load based on organic matter (MYRLC,m: 5.2 molH2.kgCOD-1) and the highest molar yield per applied load based on organic matter (MYALC,m: 21.1 molH2.kgCOD-1). In addition, it was studied whether existed or not a statistical significant difference on molar productivity averages pre-treating and not pre-treating the inoculum. It was observed that this was not statistically significant (p>0.05). Finally, the reactor was operated using crude glycerol as a sole source of carbon to evaluate hydrogen production. The disadvantage on hydrogen production when crude glycerol was used comparing to pure glycerol was clearly observed. The AnSBBR used on hydrogen production experiments operated with pure glycerol as a sole carbon XIV source showed an important potential. Nevertheless, additional studies are required in order to optimize results.

O presente trabalho de pesquisa teve como objetivo principal avaliar o efeito da carga orgânica volumétrica aplicada (COVA) na produção de hidrogênio usando o reator AnSBBR com recirculação operado em batelada e biomassa imobilizada. Para este efeito, o reator foi operado a 30ºC com dois tempos de ciclo (3 e 4 h), alimentado com três concentrações afluentes (3000, 4000 e 5000 mgDQO.L-1), uma velocidade de recirculação de 30 L.h-1, usando glicerol como única fonte de carbono e a biomassa de uma estação de tratamento de abatedouro de aves. A combinação destes fatores fez com que o reator fosse operado com seis cargas orgânicas volumétricas aplicadas diferentes (7565, 9764, 12911, 10319, 13327 e 16216 mgDQO.L-1.d-1). Os resultados mostraram que não existiu uma tendência clara entre a carga orgânica aplicada e a produção de hidrogênio. Porém, os melhores resultados quanto à produção de hidrogênio foram atingidos quando o reator foi operado com 4 horas de tempo de ciclo e alimentado com uma concentração afluente de 5000 mgDQO.L-1 (COVA de 12911 mgDQO.L-1.d-1), sendo sua produtividade molar média de hidrogênio (PrM) de 67,5 molH2.m-3.d-1. Esta condição também atingiu o melhor rendimento molar de hidrogênio por carga orgânica aplicada RMCAS,m e o melhor rendimento molar de hidrogênio por carga orgânica removida (RMCRS,m), sendo estes de 5,2 e 21,1 molH2.kgDQO-1, respectivamente. Adicionalmente foi estudada a diferença na produção de hidrogênio entre o uso de biomassa pré-tratada e não tratada termicamente, cuja análise de variância (ANOVA) mostrou que a diferença não foi estatisticamente significativa. Finalmente o reator foi operado usando glicerina bruta industrial para comparar os resultados com aqueles obtidos operando com glicerol, observando-se uma clara desvantagem na produção de hidrogênio quando foi usada glicerina bruta. Em geral, o reator AnSBBR operado em batelada sequencial apresentou resultados promissores na produção de hidrogênio usando glicerol como fonte de carbono, porém estudos mais profundos ainda são necessários no intuito de otimizar o sistema para a utilização de glicerina bruta. / This study evaluated the influence of applied volumetric organic load on biohydrogen production in an anaerobic sequencing batch biofilm reactor (AnSBBR) with 3.5 L of liquid medium and treating 1.5 L of glycerin based wastewater per cycle at 30ºC. The reactor was operated with two cycle periods (3 and 4 hours), three influent concentrations (3000, 4000 and 5000 mgCOD.L-1), recirculation rate of 30 L.h-1 and an inoculum from a poultry slaughterhouse. Six applied volumetric organic loads (AVOLCT) were generated from the combination of cycle period and influent concentrations (7565, 9764, 12911, 10319, 13327 e 16216 mgCOD.L-1.d-1). There was not a clear relation between the applied volumetric organic load and hydrogen production. However, the highest hydrogen molar production (MPr: 67.5 molH2.m-3 .d-1) was reached when the reactor was operated with a cycle period of 4 h and an influent concentration of 5000 mgCOD.L-1 (AVOLCT: 12911 mgCOD.L-1. d-1). This condition also reached the highest molar yield per removed load based on organic matter (MYRLC,m: 5.2 molH2.kgCOD-1) and the highest molar yield per applied load based on organic matter (MYALC,m: 21.1 molH2.kgCOD-1). In addition, it was studied whether existed or not a statistical significant difference on molar productivity averages pre-treating and not pre-treating the inoculum. It was observed that this was not statistically significant (p>0.05). Finally, the reactor was operated using crude glycerol as a sole source of carbon to evaluate hydrogen production. The disadvantage on hydrogen production when crude glycerol was used comparing to pure glycerol was clearly observed. The AnSBBR used on hydrogen production experiments operated with pure glycerol as a sole carbon XIV source showed an important potential. Nevertheless, additional studies are required in order to optimize results.