Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr.: f. [82]-94. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

L'hydrolyse pepsique de l’hémoglobine bovine purifiée ou à partir d'un coproduit des abattoirs : le cruor, peut être considérée comme une voie importante d'obtention de peptides antibactériens. Une étude cinétique nous a permis de maîtriser cette hydrolyse et de déterminer un modèle mathématique capable de prédire la concentration de chaque peptides antibactériens des deux familles de peptides α 1-32 et α 107-141 et ceux pour un intervalle de température de 15-37°C, de pH de 3,5-5,5 et de rapport enzyme/substrat de 1/5-1/20. Le calcul des énergies d'activation pour les différentes réactions impliquées dans le mécanisme était effectué grâce à l’équation d’Arrhenius qui a permis d’étudier l’effet de la température sur les différents coefficients cinétiques. L’effet du pH et du rapport E/S était également étudié et le modèle trouvé a démontré une augmentation linéaire de la vitesse d’hydrolyse en diminuant le pH (entre 3,5 et 5,5) et une vitesse invariable avec le rapport E/S (1/5-1/20). L'étude de la relation structure-fonction des peptides antibactériens α 1-32 et α 137-141 a été effectuée grâce à un suivie de la cinétique de K+ extracellulaire en présence de Lisrea innocua et le déterminant antibactérien minimal a été déterminé pour le peptide α 137-141. La possibilité de valoriser les peptides antibactérien α 1-32 et α 137-141 dans un emballage bioactif pour la conservation des aliments contre le développement de bactéries pathogènes a été étudiée par l'adsorption de ces peptides en surface d'un film de polyéthylène basse densité, traité avec le plasma froid. / The pepsin hydrolysis of purified bovine hemoglobin or from a co-product of slaughterhouses: cruor, can be considered as an important route for obtaining antibacterial peptides. A kinetic study has allowed us to control the hydrolysis and to determine a mathematical model able to predict the concentration of each antibacterial peptides of two families of peptides α 1-32 and α 107-141 and those of an interval of temperature 15-37°C, of pH 3,5-5,5 and ratio enzyme/substrate of 1/5-1/20 . The calculation of activation energies for the different reactions involved in the mechanism was made by the Arrhenius equation, which was used to study the effect of temperature on the various kinetic coefficients. The effect of pH and ratio E / S was also studied and the model found showed a linear increase in the rate of hydrolysis decreasing the pH ( between 3,5 and 5,5 ) and an invariable speed with the ratio E / S ( 1/5-1/20 ). The study of the structure-function relationship of antibacterial peptides α 1-32 and α 137-141 was carried out thanks to a followed the kinetics of extracellular K + in the presence of Lisrea innocua and the minimal determinant antibacterial was determined for the peptide α 137-141. The possibility to recovery the antibacterial peptides α 1-32 and α 137-141 in to a bioactive food packaging against the growth of pathogenic bacteria has been studied by the adsorption of these peptides on the surface of a low density polyethylene film treated with cold plasma.

En raison de la perception du caractère santé des jus de fruits par les consommateurs, il serait intéressant de développer des jus de fruit fonctionnels par l'ajout de composés bioactifs. Or, nombreux sont les composés bioactifs qui sont sensibles aux procédés de transformation des aliments et à leurs conditions d'entreposage. Une technique originale d'encapsulation par emulsion multiple (E1/H/E2) pour différents composés bioactifs a été développée. Le type d'émulsifiant, leur concentration, les ratios d'eau et d'huile, les conditions d'agitation (temps, vitesse, température) et les caractéristiques des emulsions produites (viscosité, microscopie, granulométrie laser) ont été étudiés. La cinétique de stabilisation de la tension interfaciale et la concentration micellaire critique (CMC) ont été déterminées. De façon à valider le choix des concentrations optimales en émulsifiants, les isothermes de compression de Langmuir ont été mesurés. Des gouttelettes multiples (E1/H) d'un diamètre volumétrique d'environ 90 um contenant des gouttelettes aqueuses (E1) inférieures à 1 um ont été obtenues. Après 25 jours à température ambiante, le diamètre des gouttelettes multiples a atteint 110 um, indiquant une coalescence limitée. Les emulsions multiples protègent les acides gras oméga-3 et les composés hydrosolubles comme la vitamine C. Cependant, une portion de la vitamine C des emulsions multiples est instable physiquement et serait relarguée de la phase interne des emulsions vers la phase externe (dans le jus). L'effet de la température d'entreposage a montré que, quelque soit le type de composé encapsulé, il s'avère nécessaire de réfrigérer les jus à 4°C pour améliorer l'effet protecteur des emulsions.

Le brocoli est une excellente source de composés nutraceutiques ayant de nombreux effets sur la santé tels que les propriétés anticancéreuses, anti-diabétiques, antioxydantes et antimicrobiennes. Les glucosinolates, les polyphénols, les vitamines, les minéraux et les fibres alimentaires sont les principales molécules présentes dans le brocoli. La production annuelle mondiale de brocoli est de 21 millions de tonnes. On estime que 35 à 40% des cultures horticoles sont perdues en raison de pratiques agricoles inadéquates, générant d'énormes quantités de déchets agricoles. Ces cultures perdues pourraient être utilisées comme matières premières pour l'extraction et la purification d'ingrédients bioactifs destinés à l'industrie nutraceutique et alimentaire. L'objectif principal de ce projet était de développer une technique économique et respectueuse de l'environnement pour la fabrication d'un extrait riche en glucoraphanine à partir de rejets industriels de brocoli, en fournissant une voie alternative pour sa valorisation. Ce travail se concentre principalement sur l'identification, la caractérisation et la quantification des glucosinolates et des polyphénols présents dans 10 lots rejetés de graines de brocoli et de résidus industriels de brocoli tels que les fleurons, les tiges et le mélange de fleurons et de tiges. De plus, le procédé d'extraction de la glucoraphanine a été optimisé en utilisant des solvants verts tels que l'éthanol et l'eau. En outre, la glucoraphanine provenant d'extraits de brocoli bruts a été purifiée en utilisant des résines échangeuses d'ions par une Méthodologie de Surface de Réponse, basé sur le Box-Behnken Design (BBD) et l'Analyse des Composants Principaux. Enfin, des expériences pilotes ont été réalisées en utilisant les paramètres optimisés pour vérifier leur adéquation pour une application industrielle. La caractérisation et la quantification simultanées par UPLC MS/MS ont indiqué la présence de 12 glucosinolates (principalement de la glucoraphanine) et de 5 polyphénols dans les sous-produits du brocoli. La teneur en glucosinolates variait de 0,2 à 2% de matière sèche (MS), tandis que les polyphénols étaient inférieurs à 0,02% de MS. L'abondance relative de la glucoraphanine dans les sous-produits du brocoli a fait un matériau de départ prometteur pour la fabrication de compléments alimentaires fonctionnels. De plus, un procédé d'extraction de la glucoraphanine écologique et à base de solvant a été optimisé pour les sous-produits de graines de brocoli et de fleurons. Un extracteur à agitation magnétique unique a maximisé l'extractibilité de la glucoraphanine. Les paramètres d'extraction optimisés étaient de 50% et 70% d'éthanol aqueux extraits pendant 60 et 30 minutes à 60 et 23°C pour les sous-produits de graines et de fleurons, respectivement, en utilisant un rapport matière/solvant de 1:20. Le procédé vert optimisé a donné un rendement de glucoraphanine de 55,5 g/kg MS de graines et de 4,3 g/kg MS de fleurons. Le procédé vert développé dans cette étude a fourni 37 et 81 fois plus d'extractibilité de la glucoraphanine que la technique analytique standard basée sur le méthanol. Enfin, un procédé de purification de la glucoraphanine respectueux de l'environnement et industriellement réalisable a été développé en utilisant des résines échangeuses d'ions par approche de surface de réponse pour les sous-produits de graines de brocoli et de fleurons. Un ensemble de 27 essais, 3 niveaux dans le BBD ont été proposés pour les résines cationiques et anioniques en série, pour maximiser les réponses du processus. La purification de la glucoraphanine à partir de l'extrait de graines de brocoli en utilisant une résine cationique a permis une récupération maximale de 94% et une pureté de 14% en utilisant 1:5 du rapport matière/résine pendant 91 min à 80 rpm/min. Dans le cas de la résine anionique, les variables expérimentales de 1:5, 140 min, 160 rpm/min et 7% d'hydroxyde d'ammonium dans de l'éthanol à 70% ont donné un rendement de 72% et une pureté de 37%... / Le brocoli est une excellente source de composés nutraceutiques ayant de nombreux effets sur la santé tels que les propriétés anticancéreuses, anti-diabétiques, antioxydantes et antimicrobiennes. Les glucosinolates, les polyphénols, les vitamines, les minéraux et les fibres alimentaires sont les principales molécules présentes dans le brocoli. La production annuelle mondiale de brocoli est de 21 millions de tonnes. On estime que 35 à 40% des cultures horticoles sont perdues en raison de pratiques agricoles inadéquates, générant d'énormes quantités de déchets agricoles. Ces cultures perdues pourraient être utilisées comme matières premières pour l'extraction et la purification d'ingrédients bioactifs destinés à l'industrie nutraceutique et alimentaire. L'objectif principal de ce projet était de développer une technique économique et respectueuse de l'environnement pour la fabrication d'un extrait riche en glucoraphanine à partir de rejets industriels de brocoli, en fournissant une voie alternative pour sa valorisation. Ce travail se concentre principalement sur l'identification, la caractérisation et la quantification des glucosinolates et des polyphénols présents dans 10 lots rejetés de graines de brocoli et de résidus industriels de brocoli tels que les fleurons, les tiges et le mélange de fleurons et de tiges. De plus, le procédé d'extraction de la glucoraphanine a été optimisé en utilisant des solvants verts tels que l'éthanol et l'eau. En outre, la glucoraphanine provenant d'extraits de brocoli bruts a été purifiée en utilisant des résines échangeuses d'ions par une Méthodologie de Surface de Réponse, basé sur le Box-Behnken Design (BBD) et l'Analyse des Composants Principaux. Enfin, des expériences pilotes ont été réalisées en utilisant les paramètres optimisés pour vérifier leur adéquation pour une application industrielle. La caractérisation et la quantification simultanées par UPLC MS/MS ont indiqué la présence de 12 glucosinolates (principalement de la glucoraphanine) et de 5 polyphénols dans les sous-produits du brocoli. La teneur en glucosinolates variait de 0,2 à 2% de matière sèche (MS), tandis que les polyphénols étaient inférieurs à 0,02% de MS. L'abondance relative de la glucoraphanine dans les sous-produits du brocoli a fait un matériau de départ prometteur pour la fabrication de compléments alimentaires fonctionnels. De plus, un procédé d'extraction de la glucoraphanine écologique et à base de solvant a été optimisé pour les sous-produits de graines de brocoli et de fleurons. Un extracteur à agitation magnétique unique a maximisé l'extractibilité de la glucoraphanine. Les paramètres d'extraction optimisés étaient de 50% et 70% d'éthanol aqueux extraits pendant 60 et 30 minutes à 60 et 23°C pour les sous-produits de graines et de fleurons, respectivement, en utilisant un rapport matière/solvant de 1:20. Le procédé vert optimisé a donné un rendement de glucoraphanine de 55,5 g/kg MS de graines et de 4,3 g/kg MS de fleurons. Le procédé vert développé dans cette étude a fourni 37 et 81 fois plus d'extractibilité de la glucoraphanine que la technique analytique standard basée sur le méthanol. Enfin, un procédé de purification de la glucoraphanine respectueux de l'environnement et industriellement réalisable a été développé en utilisant des résines échangeuses d'ions par approche de surface de réponse pour les sous-produits de graines de brocoli et de fleurons. Un ensemble de 27 essais, 3 niveaux dans le BBD ont été proposés pour les résines cationiques et anioniques en série, pour maximiser les réponses du processus. La purification de la glucoraphanine à partir de l'extrait de graines de brocoli en utilisant une résine cationique a permis une récupération maximale de 94% et une pureté de 14% en utilisant 1:5 du rapport matière/résine pendant 91 min à 80 rpm/min. Dans le cas de la résine anionique, les variables expérimentales de 1:5, 140 min, 160 rpm/min et 7% d'hydroxyde d'ammonium dans de l'éthanol à 70% ont donné un rendement de 72% et une pureté de 37%. Alors que pour les rejets industriels de fleurons de brocoli, les paramètres optimisés pour la purification de la glucoraphanine étaient un ratio matière/résine de 1:1.87, un temps de contact de 30 min, une vitesse d'agitation de 80 rpm/min et un solvant d'élution de 100% eau. La purification subséquente de l'extrait cationique en utilisant la résine anionique a été réalisée en utilisant les paramètres expérimentaux optimisés du rapport matière/résine de 1:1.3 pendant 170 min à 140 rpm/min et éluée en utilisant 7% d'hydroxyde d'ammonium dans 70% d'éthanol, fournissant une récupération de 78% et pureté de 5%. Enfin, les paramètres du processus d'extraction et de purification optimisés à l'échelle du laboratoire ont été extrapolés à l'échelle pilote pour la fabrication d'extraits en poudre, indiquant que le procédé optimisé était très efficace pour récupérer la glucoraphanine avec une grande pureté même à grande échelle. Par conséquent, la présente étude a mis au point un procédé écologique efficace et industriellement viable pour la fabrication d'extraits de rejets industriels de brocoli. Le processus optimisé a fourni une voie alternative économiquement viable pour la valorisation de la récolte perdue qui nous rapproche de la sécurité alimentaire et la durabilité environnementale. / Le brocoli est une excellente source de composés nutraceutiques ayant de nombreux effets sur la santé tels que les propriétés anticancéreuses, anti-diabétiques, antioxydantes et antimicrobiennes. Les glucosinolates, les polyphénols, les vitamines, les minéraux et les fibres alimentaires sont les principales molécules présentes dans le brocoli. La production annuelle mondiale de brocoli est de 21 millions de tonnes. On estime que 35 à 40% des cultures horticoles sont perdues en raison de pratiques agricoles inadéquates, générant d'énormes quantités de déchets agricoles. Ces cultures perdues pourraient être utilisées comme matières premières pour l'extraction et la purification d'ingrédients bioactifs destinés à l'industrie nutraceutique et alimentaire. L'objectif principal de ce projet était de développer une technique économique et respectueuse de l'environnement pour la fabrication d'un extrait riche en glucoraphanine à partir de rejets industriels de brocoli, en fournissant une voie alternative pour sa valorisation. Ce travail se concentre principalement sur l'identification, la caractérisation et la quantification des glucosinolates et des polyphénols présents dans 10 lots rejetés de graines de brocoli et de résidus industriels de brocoli tels que les fleurons, les tiges et le mélange de fleurons et de tiges. De plus, le procédé d'extraction de la glucoraphanine a été optimisé en utilisant des solvants verts tels que l'éthanol et l'eau. En outre, la glucoraphanine provenant d'extraits de brocoli bruts a été purifiée en utilisant des résines échangeuses d'ions par une Méthodologie de Surface de Réponse, basé sur le Box-Behnken Design (BBD) et l'Analyse des Composants Principaux. Enfin, des expériences pilotes ont été réalisées en utilisant les paramètres optimisés pour vérifier leur adéquation pour une application industrielle. La caractérisation et la quantification simultanées par UPLC MS/MS ont indiqué la présence de 12 glucosinolates (principalement de la glucoraphanine) et de 5 polyphénols dans les sous-produits du brocoli. La teneur en glucosinolates variait de 0,2 à 2% de matière sèche (MS), tandis que les polyphénols étaient inférieurs à 0,02% de MS. L'abondance relative de la glucoraphanine dans les sous-produits du brocoli a fait un matériau de départ prometteur pour la fabrication de compléments alimentaires fonctionnels. De plus, un procédé d'extraction de la glucoraphanine écologique et à base de solvant a été optimisé pour les sous-produits de graines de brocoli et de fleurons. Un extracteur à agitation magnétique unique a maximisé l'extractibilité de la glucoraphanine. Les paramètres d'extraction optimisés étaient de 50% et 70% d'éthanol aqueux extraits pendant 60 et 30 minutes à 60 et 23°C pour les sous-produits de graines et de fleurons, respectivement, en utilisant un rapport matière/solvant de 1:20. Le procédé vert optimisé a donné un rendement de glucoraphanine de 55,5 g/kg MS de graines et de 4,3 g/kg MS de fleurons. Le procédé vert développé dans cette étude a fourni 37 et 81 fois plus d'extractibilité de la glucoraphanine que la technique analytique standard basée sur le méthanol. Enfin, un procédé de purification de la glucoraphanine respectueux de l'environnement et industriellement réalisable a été développé en utilisant des résines échangeuses d'ions par approche de surface de réponse pour les sous-produits de graines de brocoli et de fleurons. Un ensemble de 27 essais, 3 niveaux dans le BBD ont été proposés pour les résines cationiques et anioniques en série, pour maximiser les réponses du processus. La purification de la glucoraphanine à partir de l'extrait de graines de brocoli en utilisant une résine cationique a permis une récupération maximale de 94% et une pureté de 14% en utilisant 1:5 du rapport matière/résine pendant 91 min à 80 rpm/min. Dans le cas de la résine anionique, les variables expérimentales de 1:5, 140 min, 160 rpm/min et 7% d'hydroxyde d'ammonium dans de l'éthanol à 70% ont donné un rendement de 72% et une pureté de 37%. Alors que pour les rejets industriels de fleurons de brocoli, les paramètres optimisés pour la purification de la glucoraphanine étaient un ratio matière/résine de 1:1.87, un temps de contact de 30 min, une vitesse d'agitation de 80 rpm/min et un solvant d'élution de 100% eau. La purification subséquente de l'extrait cationique en utilisant la résine anionique a été réalisée en utilisant les paramètres expérimentaux optimisés du rapport matière/résine de 1:1.3 pendant 170 min à 140 rpm/min et éluée en utilisant 7% d'hydroxyde d'ammonium dans 70% d'éthanol, fournissant une récupération de 78% et pureté de 5%. Enfin, les paramètres du processus d'extraction et de purification optimisés à l'échelle du laboratoire ont été extrapolés à l'échelle pilote pour la fabrication d'extraits en poudre, indiquant que le procédé optimisé était très efficace pour récupérer la glucoraphanine avec une grande pureté même à grande échelle. Par conséquent, la présente étude a mis au point un procédé écologique efficace et industriellement viable pour la fabrication d'extraits de rejets industriels de brocoli. Le processus optimisé a fourni une voie alternative économiquement viable pour la valorisation de la récolte perdue qui nous rapproche de la sécurité alimentaire et la durabilité environnementale. / Le brocoli est une excellente source de composés nutraceutiques ayant de nombreux effets sur la santé tels que les propriétés anticancéreuses, anti-diabétiques, antioxydantes et antimicrobiennes. Les glucosinolates, les polyphénols, les vitamines, les minéraux et les fibres alimentaires sont les principales molécules présentes dans le brocoli. La production annuelle mondiale de brocoli est de 21 millions de tonnes. On estime que 35 à 40% des cultures horticoles sont perdues en raison de pratiques agricoles inadéquates, générant d'énormes quantités de déchets agricoles. Ces cultures perdues pourraient être utilisées comme matières premières pour l'extraction et la purification d'ingrédients bioactifs destinés à l'industrie nutraceutique et alimentaire. L'objectif principal de ce projet était de développer une technique économique et respectueuse de l'environnement pour la fabrication d'un extrait riche en glucoraphanine à partir de rejets industriels de brocoli, en fournissant une voie alternative pour sa valorisation. Ce travail se concentre principalement sur l'identification, la caractérisation et la quantification des glucosinolates et des polyphénols présents dans 10 lots rejetés de graines de brocoli et de résidus industriels de brocoli tels que les fleurons, les tiges et le mélange de fleurons et de tiges. De plus, le procédé d'extraction de la glucoraphanine a été optimisé en utilisant des solvants verts tels que l'éthanol et l'eau. En outre, la glucoraphanine provenant d'extraits de brocoli bruts a été purifiée en utilisant des résines échangeuses d'ions par une Méthodologie de Surface de Réponse, basé sur le Box-Behnken Design (BBD) et l'Analyse des Composants Principaux. Enfin, des expériences pilotes ont été réalisées en utilisant les paramètres optimisés pour vérifier leur adéquation pour une application industrielle. La caractérisation et la quantification simultanées par UPLC MS/MS ont indiqué la présence de 12 glucosinolates (principalement de la glucoraphanine) et de 5 polyphénols dans les sous-produits du brocoli. La teneur en glucosinolates variait de 0,2 à 2% de matière sèche (MS), tandis que les polyphénols étaient inférieurs à 0,02% de MS. L'abondance relative de la glucoraphanine dans les sous-produits du brocoli a fait un IV matériau de départ prometteur pour la fabrication de compléments alimentaires fonctionnels. De plus, un procédé d'extraction de la glucoraphanine écologique et à base de solvant a été optimisé pour les sous-produits de graines de brocoli et de fleurons. Un extracteur à agitation magnétique unique a maximisé l'extractibilité de la glucoraphanine. Les paramètres d'extraction optimisés étaient de 50% et 70% d'éthanol aqueux extraits pendant 60 et 30 minutes à 60 et 23°C pour les sous-produits de graines et de fleurons, respectivement, en utilisant un rapport matière/solvant de 1:20. Le procédé vert optimisé a donné un rendement de glucoraphanine de 55,5 g/kg MS de graines et de 4,3 g/kg MS de fleurons. Le procédé vert développé dans cette étude a fourni 37 et 81 fois plus d'extractibilité de la glucoraphanine que la technique analytique standard basée sur le méthanol. Enfin, un procédé de purification de la glucoraphanine respectueux de l'environnement et industriellement réalisable a été développé en utilisant des résines échangeuses d'ions par approche de surface de réponse pour les sous-produits de graines de brocoli et de fleurons. Un ensemble de 27 essais, 3 niveaux dans le BBD ont été proposés pour les résines cationiques et anioniques en série, pour maximiser les réponses du processus. La purification de la glucoraphanine à partir de l'extrait de graines de brocoli en utilisant une résine cationique a permis une récupération maximale de 94% et une pureté de 14% en utilisant 1:5 du rapport matière/résine pendant 91 min à 80 rpm/min. Dans le cas de la résine anionique, les variables expérimentales de 1:5, 140 min, 160 rpm/min et 7% d'hydroxyde d'ammonium dans de l'éthanol à 70% ont donné un rendement de 72% et une pureté de 37%. Alors que pour les rejets industriels de fleurons de brocoli, les paramètres optimisés pour la purification de la glucoraphanine étaient un ratio matière/résine de 1:1.87, un temps de contact de 30 min, une vitesse d'agitation de 80 rpm/min et un solvant d'élution de 100% eau. La purification subséquente de l'extrait cationique en utilisant la résine anionique a été réalisée en utilisant les paramètres expérimentaux optimisés du rapport matière/résine de 1:1.3 pendant 170 min à 140 rpm/min et éluée en utilisant 7% d'hydroxyde d'ammonium dans 70% d'éthanol, fournissant une récupération de 78% et pureté de 5%. Enfin, les paramètres du processus d'extraction et de purification optimisés à V l'échelle du laboratoire ont été extrapolés à l'échelle pilote pour la fabrication d'extraits en poudre, indiquant que le procédé optimisé était très efficace pour récupérer la glucoraphanine avec une grande pureté même à grande échelle. Par conséquent, la présente étude a mis au point un procédé écologique efficace et industriellement viable pour la fabrication d'extraits de rejets industriels de brocoli. Le processus optimisé a fourni une voie alternative économiquement viable pour la valorisation de la récolte perdue qui nous rapproche de la sécurité alimentaire et la durabilité environnementale. / Le brocoli est une excellente source de composés nutraceutiques ayant de nombreux effets sur la santé tels que les propriétés anticancéreuses, anti-diabétiques, antioxydantes et antimicrobiennes. Les glucosinolates, les polyphénols, les vitamines, les minéraux et les fibres alimentaires sont les principales molécules présentes dans le brocoli. La production annuelle mondiale de brocoli est de 21 millions de tonnes. On estime que 35 à 40% des cultures horticoles sont perdues en raison de pratiques agricoles inadéquates, générant d'énormes quantités de déchets agricoles. Ces cultures perdues pourraient être utilisées comme matières premières pour l'extraction et la purification d'ingrédients bioactifs destinés à l'industrie nutraceutique et alimentaire. L'objectif principal de ce projet était de développer une technique économique et respectueuse de l'environnement pour la fabrication d'un extrait riche en glucoraphanine à partir de rejets industriels de brocoli, en fournissant une voie alternative pour sa valorisation. Ce travail se concentre principalement sur l'identification, la caractérisation et la quantification des glucosinolates et des polyphénols présents dans 10 lots rejetés de graines de brocoli et de résidus industriels de brocoli tels que les fleurons, les tiges et le mélange de fleurons et de tiges. De plus, le procédé d'extraction de la glucoraphanine a été optimisé en utilisant des solvants verts tels que l'éthanol et l'eau. En outre, la glucoraphanine provenant d'extraits de brocoli bruts a été purifiée en utilisant des résines échangeuses d'ions par une Méthodologie de Surface de Réponse, basé sur le Box-Behnken Design (BBD) et l'Analyse des Composants Principaux. Enfin, des expériences pilotes ont été réalisées en utilisant les paramètres optimisés pour vérifier leur adéquation pour une application industrielle. La caractérisation et la quantification simultanées par UPLC MS/MS ont indiqué la présence de 12 glucosinolates (principalement de la glucoraphanine) et de 5 polyphénols dans les sous-produits du brocoli. La teneur en glucosinolates variait de 0,2 à 2% de matière sèche (MS), tandis que les polyphénols étaient inférieurs à 0,02% de MS. L'abondance relative de la glucoraphanine dans les sous-produits du brocoli a fait un matériau de départ prometteur pour la fabrication de compléments alimentaires fonctionnels. De plus, un procédé d'extraction de la glucoraphanine écologique et à base de solvant a été optimisé pour les sous-produits de graines de brocoli et de fleurons. Un extracteur à agitation magnétique unique a maximisé l'extractibilité de la glucoraphanine. Les paramètres d'extraction optimisés étaient de 50% et 70% d'éthanol aqueux extraits pendant 60 et 30 minutes à 60 et 23°C pour les sous-produits de graines et de fleurons, respectivement, en utilisant un rapport matière/solvant de 1:20. Le procédé vert optimisé a donné un rendement de glucoraphanine de 55,5 g/kg MS de graines et de 4,3 g/kg MS de fleurons. Le procédé vert développé dans cette étude a fourni 37 et 81 fois plus d'extractibilité de la glucoraphanine que la technique analytique standard basée sur le méthanol. Enfin, un procédé de purification de la glucoraphanine respectueux de l'environnement et industriellement réalisable a été développé en utilisant des résines échangeuses d'ions par approche de surface de réponse pour les sous-produits de graines de brocoli et de fleurons. Un ensemble de 27 essais, 3 niveaux dans le BBD ont été proposés pour les résines cationiques et anioniques en série, pour maximiser les réponses du processus. La purification de la glucoraphanine à partir de l'extrait de graines de brocoli en utilisant une résine cationique a permis une récupération maximale de 94% et une pureté de 14% en utilisant 1:5 du rapport matière/résine pendant 91 min à 80 rpm/min. Dans le cas de la résine anionique, les variables expérimentales de 1:5, 140 min, 160 rpm/min et 7% d'hydroxyde d'ammonium dans de l'éthanol à 70% ont donné un rendement de 72% et une pureté de 37%. Alors que pour les rejets industriels de fleurons de brocoli, les paramètres optimisés pour la purification de la glucoraphanine étaient un ratio matière/résine de 1:1.87, un temps de contact de 30 min, une vitesse d'agitation de 80 rpm/min et un solvant d'élution de 100% eau. La purification subséquente de l'extrait cationique en utilisant la résine anionique a été réalisée en utilisant les paramètres expérimentaux optimisés du rapport matière/résine de 1:1.3 pendant 170 min à 140 rpm/min et éluée en utilisant 7% d'hydroxyde d'ammonium dans 70% d'éthanol, fournissant une récupération de 78% et pureté de 5%. Enfin, les paramètres du processus d'extraction et de purification optimisés à l'échelle du laboratoire ont été extrapolés à l'échelle pilote pour la fabrication d'extraits en poudre, indiquant que le procédé optimisé était très efficace pour récupérer la glucoraphanine avec une grande pureté même à grande échelle. Par conséquent, la présente étude a mis au point un procédé écologique efficace et industriellement viable pour la fabrication d'extraits de rejets industriels de brocoli. Le processus optimisé a fourni une voie alternative économiquement viable pour la valorisation de la récolte perdue qui nous rapproche de la sécurité alimentaire et la durabilité environnementale. / Le brocoli est une excellente source de composés nutraceutiques ayant de nombreux effets sur la santé tels que les propriétés anticancéreuses, anti-diabétiques, antioxydantes et antimicrobiennes. Les glucosinolates, les polyphénols, les vitamines, les minéraux et les fibres alimentaires sont les principales molécules présentes dans le brocoli. La production annuelle mondiale de brocoli est de 21 millions de tonnes. On estime que 35 à 40% des cultures horticoles sont perdues en raison de pratiques agricoles inadéquates, générant d'énormes quantités de déchets agricoles. Ces cultures perdues pourraient être utilisées comme matières premières pour l'extraction et la purification d'ingrédients bioactifs destinés à l'industrie nutraceutique et alimentaire. L'objectif principal de ce projet était de développer une technique économique et respectueuse de l'environnement pour la fabrication d'un extrait riche en glucoraphanine à partir de rejets industriels de brocoli, en fournissant une voie alternative pour sa valorisation. Ce travail se concentre principalement sur l'identification, la caractérisation et la quantification des glucosinolates et des polyphénols présents dans 10 lots rejetés de graines de brocoli et de résidus industriels de brocoli tels que les fleurons, les tiges et le mélange de fleurons et de tiges. De plus, le procédé d'extraction de la glucoraphanine a été optimisé en utilisant des solvants verts tels que l'éthanol et l'eau. En outre, la glucoraphanine provenant d'extraits de brocoli bruts a été purifiée en utilisant des résines échangeuses d'ions par une Méthodologie de Surface de Réponse, basé sur le Box-Behnken Design (BBD) et l'Analyse des Composants Principaux. Enfin, des expériences pilotes ont été réalisées en utilisant les paramètres optimisés pour vérifier leur adéquation pour une application industrielle. La caractérisation et la quantification simultanées par UPLC MS/MS ont indiqué la présence de 12 glucosinolates (principalement de la glucoraphanine) et de 5 polyphénols dans les sous-produits du brocoli. La teneur en glucosinolates variait de 0,2 à 2% de matière sèche (MS), tandis que les polyphénols étaient inférieurs à 0,02% de MS. L'abondance relative de la glucoraphanine dans les sous-produits du brocoli a fait un matériau de départ prometteur pour la fabrication de compléments alimentaires fonctionnels. De plus, un procédé d'extraction de la glucoraphanine écologique et à base de solvant a été optimisé pour les sous-produits de graines de brocoli et de fleurons. Un extracteur à agitation magnétique unique a maximisé l'extractibilité de la glucoraphanine. Les paramètres d'extraction optimisés étaient de 50% et 70% d'éthanol aqueux extraits pendant 60 et 30 minutes à 60 et 23°C pour les sous-produits de graines et de fleurons, respectivement, en utilisant un rapport matière/solvant de 1:20. Le procédé vert optimisé a donné un rendement de glucoraphanine de 55,5 g/kg MS de graines et de 4,3 g/kg MS de fleurons. Le procédé vert développé dans cette étude a fourni 37 et 81 fois plus d'extractibilité de la glucoraphanine que la technique analytique standard basée sur le méthanol. Enfin, un procédé de purification de la glucoraphanine respectueux de l'environnement et industriellement réalisable a été développé en utilisant des résines échangeuses d'ions par approche de surface de réponse pour les sous-produits de graines de brocoli et de fleurons. Un ensemble de 27 essais, 3 niveaux dans le BBD ont été proposés pour les résines cationiques et anioniques en série, pour maximiser les réponses du processus. La purification de la glucoraphanine à partir de l'extrait de graines de brocoli en utilisant une résine cationique a permis une récupération maximale de 94% et une pureté de 14% en utilisant 1:5 du rapport matière/résine pendant 91 min à 80 rpm/min. Dans le cas de la résine anionique, les variables expérimentales de 1:5, 140 min, 160 rpm/min et 7% d'hydroxyde d'ammonium dans de l'éthanol à 70% ont donné un rendement de 72% et une pureté de 37%. Alors que pour les rejets industriels de fleurons de brocoli, les paramètres optimisés pour la purification de la glucoraphanine étaient un ratio matière/résine de 1:1.87, un temps de contact de 30 min, une vitesse d'agitation de 80 rpm/min et un solvant d'élution de 100% eau. La purification subséquente de l'extrait cationique en utilisant la résine anionique a été réalisée en utilisant les paramètres expérimentaux optimisés du rapport matière/résine de 1:1.3 pendant 170 min à 140 rpm/min et éluée en utilisant 7% d'hydroxyde d'ammonium dans 70% d'éthanol, fournissant une récupération de 78% et pureté de 5%. Enfin, les paramètres du processus d'extraction et de purification optimisés à l'échelle du laboratoire ont été extrapolés à l'échelle pilote pour la fabrication d'extraits en poudre, indiquant que le procédé optimisé était très efficace pour récupérer la glucoraphanine avec une grande pureté même à grande échelle. Par conséquent, la présente étude a mis au point un procédé écologique efficace et industriellement viable pour la fabrication d'extraits de rejets industriels de brocoli. Le processus optimisé a fourni une voie alternative économiquement viable pour la valorisation de la récolte perdue qui nous rapproche de la sécurité alimentaire et la durabilité environnementale. / Broccoli is an excellent source of nutraceutical compounds with many health effects such as anticancerous, anti-diabetic, antioxidant and anti-microbial properties. Glucosinolates, polyphenols, vitamins, minerals, dietary fibers are the most important molecules present in broccoli. The global annual production of broccoli is 21 million tons. It is estimated that 35-40% of the horticultural crops are lost due to inadequate agricultural practices, generating huge quantities of agro-waste. These lost crops, could be used as raw materials for the extraction and purification of bioactive ingredients for the nutraceutical and food industry. The main objective of this project was to develop an economical and environmental friendly technique for the fabrication of an extract rich in glucoraphanin from broccoli industrial discards, providing an alternative route for its valorization. This work predominantly focuses on the identification, characterization and quantification of glucosinolates and polyphenols present in 10 rejected lots of broccoli seeds and broccoli industrial residues such as florets, stalks and the mixture of florets and stalks. Additionally, the glucoraphanin extraction process was optimized using green solvents such as ethanol and water. Further, the glucoraphanin from crude broccoli extracts were purified using ion exchange resins by Response Surface Methodology, based on Box-Behnken Design (BBD) and Principle component analysis. Finally, pilot experiments were performed using the optimized parameters to verify their industrial applicability. The simultaneous characterization and quantification by UPLC MS/MS indicated the presence of 12 glucosinolates (predominantly glucoraphanin) and 5 polyphenols in broccoli by-products. The glucosinolates content varied from 0.2 to 2% dry weight (DW), whereas, the polyphenols were less than 0.02% DW. The relative abundance of glucoraphanin in broccoli by-products makes it a promising starting material for the fabrication of functional food supplements. Further, an eco-friendly, solvent based glucoraphanin extraction process was optimized for broccoli seeds and florets by-products. A single batch magnetically stirred extractor was found to maximize glucoraphanin extractability. The optimized extraction parameters were 50% and 70% aqueous ethanol extracted for 60 and 30 minutes at 60 and 23°C for seeds and florets by-products, respectively, using a feed to solvent ratio of 1:20. The optimized green process provided a glucoraphanin yield of 55.5 g/Kg DW seeds and 4.3 g/kg DW florets by-products. The green process developed in this study provided 37 and 81 times more glucoraphanin extractability than the standardized methanol based analytical technique. Finally, an environmental friendly and industrially feasible glucoraphanin purification process was developed using ion exchange resins by response surface approach for broccoli seeds and florets by-products. A 27 run, 3 level BBD, were proposed for cationic and anionic resins in series, to maximize the process responses. Glucoraphanin purification from broccoli seeds extract using cationic resin provided a maximal recovery of 94% and purity of 14% using 1:5 of feed to resin ratio for 30 min, at 80 rpm agitation speed and eluting solvent concentration of 100% water. For anionic resin, the experimental variables of 1:5, 140 min, 160 rpm and 7% ammonium hydroxide in 70% ethanol provided a process efficiency of 72% and a purity of 37%. Whereas, for broccoli florets industrial discards, the optimized process parameters for the purification of glucoraphanin were a feed to resin ratio of 1:1.87, contact time of 30 min, agitation speed of 80 rpm and eluting solvent of 100% water. Subsequent purification of the cationic extract using the anionic resin was performed using the optimized experimental parameters of feed to resin ratio of 1:1.3 for 170 min at 140 rpm and eluted using 7% ammonium hydroxide in 70% ethanol, providing a recovery of 78% and purity of 5%. Finally, the laboratory scale optimized extraction and purification process parameters was extrapolated onto the pilot scale for the fabrication of powdered extracts, indicated that the optimized process was highly efficient in recovering glucoraphanin with high purity even on large scale operation. Hence, the present study developed an efficient, industrially viable green process, for the fabrication of extracts from broccoli industrial discards. The optimized process provided an economically feasible alternative route for the valorization of the lost crop bringing us closer to food security and environmental sustainability.

La découverte et l'application de produits naturels bioactifs en médecine humaine continuent d'attirer l'attention des scientifiques. De plus en plus de données montrent que les produits naturels ayant une valeur médicinale ont un taux de réussite plus élevé que les drogues purement synthétiques. En plus, les produits naturels bioactifs possèdent des propriétés stéréochimiques complexes qui compliquent leur synthèse totale en laboratoire. Il existe donc un effort soutenu pour découvrir de nouvelles voies de biosynthèse de produits naturels provenant de différents environnements et/ou de producteurs naturels afin d'obtenir une bioactivité plus efficace ou nouvelle. De tels efforts sur des bactéries ont révélé que le métabolisme secondaire riche de Streptomyces produit les deux tiers des produits bactériens naturels connus ayant une valeur médicinale. Les enzymes liant la flavine sont connues pour jouer un rôle crucial dans la catalyse de réactions uniques et difficiles dans plusieurs voies de biosynthèse de produits naturels chez les bactéries, les champignons et les plantes. Récemment, nos collaborateurs ont élucidé les voies de biosynthèse menant aux produits naturels piericidine et à la xiamycine. Ces voies contiennent deux flavoenzymes intéressantes, PieE et XiaI, qui catalysent les réactions de monooxygénation impliquant certaines similitudes et certaines différences. Ce projet de thèse a été conçu pour étudier les propriétés structurelles et fonctionnelles sous-jacentes à ces deux flavoenzymes en utilisant la cristallographie aux rayons X et des dosage enzymatiques comme méthodes principales. PieE est classé en tant que monooxygénase dépendante de la flavine à un composant, par opposition à XiaI, qui est une monooxygénase à liaison à la flavine à deux composants. Naturellement, PieE utilise deux sous-sites distincts pour la réduction de la flavine (position OUT) et son utilisation ultérieure en monooxygénation (position IN). Nous observons en effet cette dynamique dans nos structures et ceci a également été rapporté auparavant pour d'autres protéines apparentées dans le groupe A des monooxygénases flavine-dépendantes. Cependant, une étude systématique des différentes structures cristallines de PieE en complexe avec flavin adenine nucleotide (FAD) et avec son substrat ainsi que d'autres monooxygénases flavine-dépendantes du groupe A nous a permis d'identifier la position «glissante» de FAD qui relie les positions OUT et IN qui n'avait pas été signalée auparavant. De plus, une analyse minutieuse de la structure de PieE et des enzymes qui s'y rapportent nous a amenés à identifier la présence d'un ion chlorure que l'on trouve près de la position IN de ces enzymes et qui avait déjà été confondu avec une molécule d'eau. Cet ion chlorure semble verrouiller la flavine dans cette position IN et inhiber sa réduction, comme le confirment les dosages enzymatiques en présence ou en l'absence de celle-ci. D'autre part, XiaI interagit avec la flavine d'une manière totalement différente. XiaI et les enzymes apparentées ont une plus grande affinité pour la flavine réduite par rapport à la flavine oxydée. Les déterminants structurels dictant cette différence n'avaient pas été observés auparavant. En déterminant la structure cristalline aux rayons X de XiaI dans différentes conditions réductrices, nous avons pu observer des changements significatifs dans les éléments de structure secondaire locaux de la protéine. Ces changements incluent la «fusion» d'une hélice C-terminale qui semble non seulement «ouvrir» le site de liaison de la flavine, mais également déclencher une structuration à l'échelle du tétramère des régions de boucle moyenne de la protéine. Ces événements semblent conduire à la réorganisation du site catalytique de l'enzyme. Nous avons également observé un mouvement de la région de boucle F123 avec un rôle potentiel d'accueil ou d'éjection de la flavine. Ces observations appellent des recherches plus approfondies sur la dynamique de XiaI et des enzymes de liaison à la flavine à deux composants apparentés en relation avec leur interaction différentielle avec le cofacteur de la flavine. Globalement, nous avons observé des évènements structurels uniques chez PieE et XiaI après la liaison avec leur substrat ou leur cofacteur. Ces observations soulignent l'importance de déterminer les structures cristallines et la activité d'une même protéine dans différentes conditions pour attraper des instantanés de possibles mouvements dynamiques fonctionnels qui pourraient autrement être manqués. Nos résultats fournissent les bases d'une étude plus approfondie de la dynamique dans ces deux systèmes, qui concerne d'autres protéines ayant une dynamique similaire mais des fonctions différentes. / The discovery and application of bioactive natural products in human medicine continues to attract scientific interest. Increasing amount of data show that natural products of medicinal value have more hit-rates than purely synthetic molecules and usually show complex stereo chemical properties that complicate their total laboratory synthesis. Hence, there is a sustained effort to discover new natural product biosynthetic pathways from different environments and/or natural producers to obtain more efficient or new bioactivities. Such efforts in bacteria revealed that the rich secondary metabolism of Streptomyces produces two-third of known bacterial natural products of medicinal value. Flavin-binding enzymes are known to play a crucial role in catalyzing unique and challenging reactions in numerous natural product biosynthetic pathways in Streptomyces, fungi and plants. Recently, our collaborators elucidated the biosynthetic pathways leading to the synthesis of piericidin A1 and xiamycin. The pathways contain two interesting flavoenzymes, PieE and XiaI that catalyze monooxygenation reactions involving some similarities and certain differences. This doctoral project was designed to investigate the underlying structural and functional properties of these two flavoenzymes using X-ray crystallography and enzymatic assays as the main experimental approaches. PieE is classified as a one-component flavin-dependent monooxygenase as opposed to XiaI which is a two-component flavin-binding monooxygenase. Naturally, PieE uses two distinct sub-sites forthe reduction of flavin (OUT position) and its subsequent use in monooxygenation (IN position). We indeed observed this dynamics in our structures and this has also been reported before for other related proteins in the group A flavin-dependent monooxygenases. However, a systematic investigation of different crystal structures of PieE in complex with FAD and with its substrate as well as other group A Flavin-dependent monooxygenases enabled us to identify a "sliding" position of FAD that bridges the OUT and IN positions that had not been reported before. Moreover, a careful analysis of the structure of PieE and related enzymes has led us to identify the presence of a chloride ion that is found near the IN position of these enzymes that has at times been mistaken for a water molecule in other group A monooxygenases. This chloride ion seems to lock the flavin in this IN position and inhibit its reduction as confirmed by enzymatic assays in its presence or absence. On the other hand, XiaI interacts with flavin in a totally different manner. XiaI's close relatives were reported to have higher affinity to reduced flavin compared to the oxidized one. The structural determinants dictating this difference have not been reported before. By determining the X-ray crystal structure of XiaI under different reducing an aerobic conditions, we were able to observe significant changes in local secondary structure elements of the protein. These changes include "melting" of a C-terminal helix that seems to not only "open up" the flavin binding-site but also to trigger a tetramer-wide structuring of middle loop regions of the protein. These events seem to lead to the reorganization of the catalytic site of the enzyme. We have also observed movement of the F123 loop region with a potential role of flavin welcoming or ejection. These observations call for further investigation of the dynamics in XiaI and related two-component flavin-binding enzymes in relation to their differential interaction with the flavin cofactor. Overall, we have observed unique structural events in both PieE and XiaI that follow substrate or cofactor binding. These observations point to the importance of determining crystal structures and activity of the same protein in different conditions to trap snap-shots of possible functional dynamic movements that could otherwise be difficult to predict. Our results lay the ground for further study of dynamics in both these systems as it relates to other proteins with similar dynamics but different functions.

Titre de l'écran-titre (visionné le 15 décembre 2023)

Plusieurs milliards de dollars sont investis chaque année pour la recherche de molécules bioactives contre diverses maladies. De nos jours, la majorité de ces composés sont synthétisés par l’homme et se conforme à la règle de 5 de Lipinski qui analyse les propriétés physicochimiques d’une molécule bioactive et son potentiel à atteindre une cible thérapeutique. Or, plusieurs composés synthétisés sont extrêmement actifs, mais ne respectent pas la règle de Lipinski. L’aspect limitant pour plusieurs de ces molécules est leur faible caractère hydrophile qui diminue la solubilité physiologique. Dans la littérature, plusieurs méthodes ont été publiées pour améliorer cette caractéristique. Un exemple est la conjugaison de la molécule hydrophobe sur des macromolécules telles des polymères, des polysaccharides ou des peptides. En tenant compte de l’expertise de notre laboratoire, nous avons utilisé le dendrimère PEOT, un polymère monodisperse hyperbranché, comme plateforme pour améliorer les propriétés physicochimiques d’un composé bioactif, l’aminostéroïde AH-38, sur diverses lignées cancéreuses. Pour conjuguer l’AH-38 sur le PEOT, il a été nécessaire d’ajouter une méthode d’ancrage par la préparation d’une molécule d’espacement. L’idée initiale était d’utiliser un espaceur qui permettrait de lier de manière réversible l’aminostéroïde bioactif pour être libéré à la cible thérapeutique. La présence intrinsèque d’un groupement fonctionnel hydrophile dans la structure de la molécule d’espacement serait idéale pour une fonctionnalisation complète des terminaisons. De plus, la molécule d’espacement devrait pouvoir se conjuguer en périphérie du dendrimère par cycloaddition 1,3-dipolaire de Huisgen sans avoir recours à un catalyseur de cuivre. Plusieurs tentatives ont été effectuées sans succès pour fonctionnaliser une molécule d’espacement correspondant à ces critères. Finalement, nous avons choisi de ne pas avoir de fonction hydrophile dans l’espaceur et la conjugaison au dendrimère fait intervenir un catalyseur de cuivre. Dans ce mémoire de maîtrise, les avantages de la nanomédecine, le cheminement de pensée et les travaux effectués pour arriver aux molécules cibles sont présentés. / Each year, billions of dollars are invested in research to treat different illnesses using bioactive molecules. Nowadays, most drugs are synthesized by men; they usually comply with the Lipinski rule of 5 which analyses their physicochemical properties and their potential reach the biological target. However, there are still numerous extremely active compounds, but they do not act in accordance to the Lipinski’s rule. Many of those compounds are limited by their low hydrophilicity which reduces their physiological solubility. In the literature, many strategies have been published on ways to enhance this property. For example, a poorly water-soluble drug may be grafted onto a macromolecule such as a polymer, a polysaccharide or a peptide. Considering our laboratory area of expertise, we used the PEOT dendrimer -- a monodisperse hyperbranched polymer -- as carrier to enhance the physicochemical properties of the aminosteroid AH-38, a bioactive compound over multiple cancer cell lines. To graft the AH-38 onto the PEOT, a linker molecule must be used. In our preliminary research, we wanted to choose a structure that could link reversibly the bioactive aminosteroid to be released at the therapeutic target. In the linker’s structure, a hydrophilic functional group should be present, it would be ideal to completely functionalize the dendrimer’s terminis. Also, the linker should be able to graft onto the dendrimère using the Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition without any copper catalyst. Many attempts were made to synthesize a linker with following these criteria, but they all failed. Consequently, we opted for a linker that does not have a hydrophilic functional group and uses a copper catalyst to graft onto the dendrimer. In this master’s report, nanomedecine’s advantages, the entire thinking process and experiments that were performed in order to obtain the target’s molecules are presented.

La réparation des défauts osseux de taille importante (fracture, tumeur, nécrose de l'os) pour lesquelles une partie de l'os est manquante et doit être remplacée, demeure un défi important pour le domaine médical. Des matériaux synthétiques, comme des matériaux céramiques, métalliques, et polymères, sont ainsi développés comme substituts osseux. Mais ces matériaux n'interagissent pas suffisamment avec l'os du patient et finissent par être encapsulés par une couche de tissu fibreux, ce qui peut résulter en une fracture de l'os, de l'implant, ou de l'interface entre les deux. La recherche vise donc à étudier et comprendre les interactions entre les cellules et les matériaux, afin de développer des matériaux capables d'interagir avec les cellules, et de mettre au point des implants combinant un matériau bioactif, des cellules, et des facteurs bioactifs permettant la reconstruction du tissu osseux. Dans ce contexte, les cellules souches mésenchymateuses (MSCs) ont gagné en popularité en médecine régénératrice compte tenu de leur capacité d'auto-renouvellement, leur multipotence, et leur taux de prolifération élevé. Cependant, une fois extraites du patient et cultivées in vitro, les MSCs ont tendance à se différencier de manière aléatoire, ce qui conduit à une population hétérogène de cellules avec laquelle il est difficile de reconstruire un tissu. Bien que les MSCs soient utilisées en clinique pour le traitement de diverses pathologies, une meilleure compréhension de leur comportement reste nécessaire pour permettre de contrôler leur différenciation vers une lignée spécifique et ainsi améliorer leurs performances en clinique. Les hydrogels ont émergé comme matériaux prometteurs pour la culture cellulaire puisqu'ils permettent de mimer la matrice extracellulaire naturelle des cellules. Notamment, de nombreuses études ont évalué l'impact de la rigidité des hydrogels sur la différenciation des MSCs et ont montré qu'une rigidité proche de celle d'un tissu naturel favorise la différenciation vers les cellules de ce tissu. Cependant, il est maintenant reconnu que les hydrogels et les tissus naturels ne sont pas caractérisés uniquement par leur rigidité, mais aussi par leur viscoélasticité. Or peu d'études ont été menées sur l'impact des propriétés viscoélastiques des hydrogels sur la différenciation des MSCs (15 articles sur les cinq dernières années via PubMed). Dans ce projet, il a été montré qu'il était possible de synthétiser des hydrogels de poly(acrylamide-co-acide acrylique) avec une rigidité et une viscoélasticité contrôlées, mesurées par compression et par AFM. Cinq hydrogels ont été choisis pour étudier l'impact des propriétés mécaniques sur la différenciation ostéogénique des MSCs en variant la rigidité et le pourcentage de relaxation : 15 kPa-15%, 60 kPa-15%, 140 kPa-15%, 100 kPa-30%, et 140 kPa-70%. Il a été montré que la fonctionnalisation de surface de ces hydrogels avec un peptide mimétique de la protéine BMP-2 a mené à une forme cellulaire étoilée après deux semaines de différenciation, sauf pour la rigidité la plus basse (15 kPa). Cette forme cellulaire étoilée correspondrait à une forme d'ostéocyte, qui est le dernier stade de différenciation ostéogénique des MSCs, et qui n'a jamais été obtenu in vitro à notre connaissance. De plus, une rigidité de 60 kPa a mené à une plus forte expression de marqueurs de différenciation ostéocytaires par rapport à des rigidités de 15 et 140 kPa, pour une même relaxation de 15%. Enfin, la plus forte expression de marqueurs de différenciation d'ostéoblastes et d'ostéocytes a été observée pour l'hydrogel présentant 70% de relaxation et une rigidité de 140 kPa. Ceci semble montrer qu'une viscoélasticité élevée favorise la différenciation ostéogénique des MSCs, même si elle est associée à une rigidité qui n'est pas la plus favorable. Ainsi, les propriétés viscoélastiques de la matrice auraient un impact non négligeable sur la différenciation des MSCs et devraient être considérées à l'avenir. / The repair of large bone defects, including large fracture, tumor, and necrosis for which a part of the bone is missing and has to be replaced, is still a challenge for the medical field. Synthetic materials, such as ceramic, metallic, and polymeric materials, have been developed as bone substitutes. However, these materials do not interact with the bone of the patient and generally end up being encapsulated by a layer of fibrous tissue, that might result in the fracture of the bone, the implant, or the interface between the two. The research therefore aims at studying and understanding cell-material interactions in order to develop materials capable of interacting with cells, and to create new implants combining a carrier material, cells, and bioactive factors, allowing bone reconstruction. In this context, mesenchymal stem cells (MSCs) have gained high interest in regenerative medicine considering their self-renewal ability, multipotency, and high proliferative rate. However, once extracted from the patient and cultivated in vitro, MSCs tend to differentiate randomly, which leads to a heterogeneous population of cells with which it is difficult to reconstruct any tissue. Therefore, although MSCs are used in clinics for the treatment of various pathologies, a better understanding of their biological behavior is still required to provide the ability to control their in vitro differentiation into a specific lineage and improve their clinical performance. Hydrogels have emerged as promising materials for cell culture as they allow to mimic the natural extracellular matrix of cells. Particularly, many studies have evaluated the impact of hydrogels stiffness on MSCs differentiation and showed that a stiffness close to that of a biological tissue leads to a differentiation towards cells of this tissue. Nevertheless, it is now recognized that hydrogels as well as biological tissues are not only described by their stiffness, but also by their viscoelastic properties. However, only few studies have been conducted on the impact of hydrogels viscoelastic properties on MSCs differentiation (15 articles over the past five years from PubMed). In this project, it has been shown that it was possible to synthesize poly(acrylamide-co- acrylic acid) hydrogels with different controlled stiffness and viscoelasticity, evaluated using compression and AFM. Five hydrogels have been chosen to study the impact of hydrogels mechanical properties on MSCs osteogenic differentiation by varying the stiffness and the relaxation percent : 15 kPa-15%, 60 kPa-15%, 140 kPa-15%, 100 kPa-30%, and 140 kPa- 70%. It has been shown that the surface functionalization of these hydrogels with a mimetic peptide of the BMP-2 protein led to star-like cells, except for the lowest stiffness (15 kPa). This star-like shape would correspond to the shape of osteocytes, which is the last stage of osteogenic differentiation, and which has never been obtained in vitro to our knowledge. Moreover, a stiffness of 60 kPa led to a higher expression of osteocyte markers as compared to stiffnesses of 15 and 140 kPa, for a constant low relaxation of 15%. Finally, the strongest expression of osteoblast and osteocyte differentiation markers has been observed for the hydrogel with a high relaxation of 70% and a stiffness of 140 kPa. This shows that a high viscoelasticity would favor MSCs osteogenic differentiation, even if it is associated with a stiffness that is not the most favorable. Thus, the viscoelastic properties of the matrix would have a significant impact on MSCs differentiation and should be considered in the future.

Les biomatériaux jouent un rôle majeur dans le développement du génie tissulaire. Au cours des dernières années, les propriétés physiques, chimiques, et en particulier biologiques de ces matériaux ont été optimisées pour différentes applications. Le polypyrrole (PPy) électriquement conducteur et ses matières composites sont utiles pour connecter des composants électriques, des cellules ou des tissus vivants. Des efforts ont été faits pour bio-activer le PPy en incorporant électrochimiquement des biomolécules comme l'héparine et l'acide hyaluronique. Cette méthode est cependant limitée par la petite taille des électrodes, la dénaturation des biomolécules pendant les réactions électrochimiques, le changement des propriétés physiques et surtout la conductivité du polypyrrole. Le but de cette étude est de bio-activer le polypyrrole par l'incorporation de molécules bio-actives telles que la fibronectine et l'albumine de sérum bovin. Ce biomatériau serait d'une grande utilité dans le domaine de l'ingénierie tissulaire et constituerait un support bioactif, biodégradable et électriquement conducteur pour la culture de différents types cellulaires avec de multiples applications biomédicales

Les maladies cardio-vasculaires sont la principale cause de mortalité dans le monde. Parmi celles-ci, et une des plus importantes, se trouve l'athérosclérose. Cette maladie se traduit par la formation d'une plaque sur les parois artérielles réduisant alors le diamètre luminal. La plaque d'athérome entrave la circulation du sang et peut se compliquer par la formation d'un thrombus artérielle pouvant provoquer un infarctus du myocarde. Une intervention capable de rétablir le flux (recanalisation) est alors nécessaire. Dans le cas des artères coronaires, l'intervention coronaire est percutanée (ICP) et consiste à amener et déployer jusqu'au site malade, une endoprothèse, appelé aussi stent. Un stent est un petit treillis métallique tubulaire qui permet de rouvrir la lumière de l'artère et de rétablir la circulation sanguine. Il sert aussi de support à l'artère malade pour empêcher son affaissement. Cependant, après implantation, certaines complications sont induites, telle que la resténose intra-stent (ISR) qui se caractérise par la réduction de la lumière de l'artère, reconduisant les problèmes créés par la plaque d'athérome. Ce phénomène est essentiellement dû à une prolifération excessive des cellules musculaires lisses, et qui résulte d'une lésion de l'endothélium lors de l'implantation. Afin de limiter cette complication, la première approche a été de changer les matériaux utilisés pour ces endoprothèses. Les principaux alliages utilisés pour fabriquer des stents sont l'acier inoxydable, les alliages de nitinol et ceux de chrome cobalt, plus particulièrement le L605. Ce dernier, dû à ses propriétés mécaniques, permet la fabrication de dispositifs plus minces, donc moins de métaux présents dans le corps humain, et a démontré induire moins de complications cliniques. Néanmoins, malgré la diminution des complications par rapport aux autres alliages, les endoprothèses nues en L605 ne s'intègrent que peu ou pas du tout dans le tissu artériel de l'hôte. Pour répondre aux exigences biologiques et cliniques, l'idéal serait d'avoir un dispositif qui favoriserait le recouvrement du dispositif par l'endothélium, ou « endothélialisation » et qui aurait un faible potentiel thrombotique et inflammatoire. L'approche couramment utilisée pour répondre à ces critères est de recourir à des dispositifs qui libèrent des médicaments anti-inflammatoires. Pour ce faire, il faut recouvrir les dispositifs métalliques avec des revêtements à base de polymères, en tant que couche intermédiaire, fonctionnalisée ensuite par des molécules bioactives. Toutefois, les dépôts de ces couches polymériques impliquent l'utilisation de chimie en solution incluant des solvants organiques. En outre, ces dernières démontrent avoir une faible adhésion au substrat métallique, dû au procédé utilisé, mais aussi un manque de cohésion. Lors de la procédure d'implantation, les stents subissent une déformation plastique, comme ces revêtements manquent de résistance, ils ont tendance à fissurer ou délaminer. Ce projet de recherche s'insère donc dans cette problématique générale, et propose une nouvelle approche qui permettrait d'éviter ce revêtement polymérique, tout en apportant les propriétés biologiques recherchées. Pour ce faire, la modification de surface proposée implique la fonctionnalisation directe des surfaces métalliques par un procédé plasma. Ce procédé permet de ne pas modifier les propriétés de cœur du matériau, et de créer des groupes fonctionnels en surface, ici des groupes amine réactifs (NH₂), qui servent de points d'ancrage pour le greffage ultérieur des molécules bioactives d'intérêt. En résumé, ce procédé original peut être divisé en 3 parties principales : a) préparation de la surface, b) fonctionnalisation par plasma et c) greffage de molécules bioactives. Tout au long de ce projet de recherche, l'optimisation de chaque partie a été réalisée en vue d'obtenir les propriétés adéquates et nécessaires pour l'application cardiovasculaire visée. Concernant la partie a), c'est-à-dire la préparation de la surface, les traitements suivants ont été testés : électropolissage, traitements thermiques et implantation ionique par immersion dans un plasma. Ces modifications ont été optimisées en vue d'obtenir une couche d'oxyde stable sous déformation présentant la meilleure résistance possible à la corrosion, tout en démontrant la plus haute efficacité d'amination directe par plasma pour la partie b). Enfin, en ce qui concerne le bloc c), le greffage de molécule bioactive, deux bras de liaison différents ont été étudiés pour évaluer leur impact sur la conformation et la performance biologique. Cette étude a été effectuée avec un peptide bioactif dérivé de la molécule d'adhésion des cellules endothéliales et des plaquettes (PECAM-1 ou CD31), en raison de ses propriétés anti-inflammatoire, anti-thrombotique et pro-endothélialisation. Les 2 bras d'ancrage testés sont un à chaine courte, l'anhydride glutarique (GA), contenant seulement 5 atomes de carbone, et un à longue chaine (600 atomes), le polyéthylène glycol (PEG) choisi aussi pour ses propriétés anti-adhérentes. Tout d'abord, cette stratégie a été développée sur des échantillons plats, qui facilitaient grandement les analyses de surface, telles que XPS et ToF-SIMS, et donc les processus d'optimisation de chaque étape, comme la résistance à la déformation, corrosion et l'analyse des propriétés biologiques. Ceci a permis de démontrer que le prétraitement de surface optimal pour les substrats L605 était l'électropolissage, agissant sur sa couche d'oxyde passive pour une efficacité maximale lors de l'étape d'amination. Le bras de liaison qui a démontré le plus grand potentiel pour immobiliser le peptide d'intérêt est le PEG, avec une augmentation significative de la migration et viabilité des cellules endothéliales, par rapport au substrat métallique nu. De plus, le greffage du peptide sur le PEG ajoutait des propriétés anti-thrombotique et anti-inflammatoire par rapport aux échantillons électropolis. Ce procédé a été ensuite adapté à des stents, dont la configuration 3D est très complexe. Après optimisation, les stents pegylées + peptides biomimétiques (Plasma-P8RI) ont été testés in vivo par implantation dans les coronaires de porc porcin pendant 7 jours et 28 jours et leur potentiel de ré-endothélialisation et anti-resténotique ont été évalués. Il a été constaté que la stratégie proposée dans ce projet de recherche favorisait la ré-endothélialisation après 7 jours par rapport au DES (Drug Eluting Stent) commercial, et limitait l'adhérence des leucocytes et des plaquettes lorsque comparé au BMS (Bare Metal Stent). Après 28 jours d'implantation le diamètre luminal des artères n'était pas réduit sur le stent Plasma-P8RI, ce qui signifie que ces stents modifiés ne présentaient pas de risque de resténose, contrairement aux BMS. Ce projet de recherche a permis de développer et de valider une stratégie prometteuse consistant à immobiliser directement des molécules bioactives sur des dispositifs cardiovasculaires en L605, alliage de chrome-cobalt. A notre connaissance, cette approche n'a jamais été rapportée dans la littérature à notre connaissance. Cette stratégie originale, dépourvue des limites associées à l'usage des polymères et basée sur un procédé plasma, présente des avantages évidents et ouvre la voie vers le développement de dispositifs cardiovasculaires innovants. / Cardiovascular diseases represent the leading cause of death in the world. Among them is atherosclerosis that characterizes by the formation of a plaque on the arterial walls that narrows the lumen diameter. This atherosclerotic plaque disrupts the blood flow and can be complicated by thrombosis which can ultimately lead to myocardial infarction. Efficient revascularization is mandatory to treat this disease and a percutaneous coronary intervention (PCI) is performed complemented with the deployment of a stent. Stents are tiny wire mesh that reopens the artery, re-establishing the blood flow whilst supporting the artery avoiding its collapse. Nevertheless, complications after stent implantation exist and in-stent restenosis (ISR) is one of the major concerns. This complication is characterized by the reduction of the lumen diameter, similar to an atherosclerotic plaque, and it is associated to the wound caused on the endothelium by the stent implantation followed by the over-proliferation of smooth muscle cells. One of the first strategies to decrease ISR involved the manufacture of stents using different alloys such as stainless steel, nitinol and cobalt chromium alloys (L605). The latest alloy, L605, has generated significant interest because it allows the fabrication of thinner devices, which have decreased post-implantation clinical complications. Nonetheless, despite the decrease in ISR, when compared to other alloys, the integration of L605 bare metal stents in the host tissue is minimal or inexistent. Thus, enhanced biological properties, such as endothelialisation, low thrombosis activity and anti-inflammatory behaviour represent mandatory requirements for clinical applications. To confer these properties onto metallic devices, polymeric-based coatings, as an intermediate layer to further functionalize with bioactive molecules, are often deposited. Nonetheless, major techniques to deposit these polymeric coatings involve the use of wet-chemistry and do not ensure total resistance during the stent implantation procedure due to lack of cohesion and delamination of the polymeric layer. Thus, a novel approach that foregoes this previously mandatory coating step was developed in this research project. This novel approach involves the use of plasma-based techniques to create functional groups (reactive amine groups, -NH₂), directly onto the metallic surface without modifying the bulk properties, that can be used as anchor points for the further grafting of bioactive molecules of interest. Briefly, this novel approach can be divided in 3 blocks: a) Surface preparation, b) plasma functionalization and c) bioactive molecule grafting. Throughout this research project the optimization of these main blocks was performed aiming for the desired cardiovascular application. Concerning block a), surface preparation, electropolishing, thermal treatments and plasma immersion ion implantations were performed to obtain an oxide layer deformation and corrosion resistant whilst demonstrating the highest direct plasma amination efficiency, for block b). Finally, as regards block c), bioactive molecule grafting, two different linking arms were studied to assess their impact on conformation, and the biological performance of a bioactive peptide derived from the platelet endothelial cell adhesion molecule (PECAM-1 or CD31) due to its pro-endothelialization, anti-inflammatory and anti-thrombotic potential: Glutaric anhydride (GA), as a short chain spacer of 5 carbons, and polyethylene glycol (PEG), as a long chain spacer with antifouling properties. Initially, this strategy was developed on flat samples where using a combination of high-resolution surface characterizations techniques, such as XPS and ToF-SIMS, and corrosion, deformation and biological tests it was confirmed that the optimal surface pre-treatment for L605 was electropolishing, due to its passive oxide layer and that it further allowed to obtain the highest amination efficiency. Furthermore, the best linking arm to immobilize the peptide was PEG, which demonstrated a significantly increase on endothelial cell viability with a faster migration, when compared to the bare metallic substrate. Moreover, peptides immobilized by PEG demonstrated that endothelial cells attached to the surface presented an anti-thrombotic and anti-inflammatory phenotype, when compared to electropolished samples. Thus, this biomimetic surface was selected for an in vivo trial in porcine model to evaluate its potential re-endothelialization and anti-restenotic activity. It was found that by directly attaching a CD31 agonist onto the bare metal stent by this strategy improved re-endothelialization after 7 days when compared to commercial DES, with further, low adhesion of leukocytes and platelets when compared to BMS. Moreover, after 28 days of implantation, Plasma-P8RI did not present a significant decrease on the lumen diameter, which was not the case for BMS that presented in-stent restenosis after this period. Overall, this research project allowed the development and validation of a promising strategy to directly immobilize bioactive molecules onto L605 cobalt chromium cardiovascular devices, providing clear advantages of medical devices currently on the market. Furthermore, to the best of our knowledge, such plasma-based multi-step strategy has never been previously reported in literature.