Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Th. 3e cycle--Pharm.--Paris 5, 1981. N°: 22.

Ce travail s’inscrit dans un cadre de recherche global du génome humain. Il s'intéresse particulièrement à l'identification de milliers de gènes qui demeurent toujours inconnus à ce jour. Afin de pouvoir effectuer cette tâche sur une plateforme informatique, les séquences d’acide désoxyribonucléique (ADN) seront traitées comme étant des signaux pour permettre l’usage des techniques en traitement numérique de signaux (TNS). Cette approche permettra de réduire les coûts et surtout, le temps que prennent les chercheurs à trouver un gène impliqué dans une maladie. Le projet est divisé en deux volets. Le premier volet de cette recherche consiste à réduire de façon importante les temps de calcul de certains algorithmes en bio-informatique. Cette recherche propose une méthode de mise en oeuvre des algorithmes de prédiction de gènes en parallèle avec le logiciel MATLAB. Les approches proposées sont basées soit sur l’algorithme de Goertzel ou de FFT en utilisant diverses procédures de parallélisme sur une unité centrale de traitement (CPU) et à une unité de processeur graphique (GPU). Les résultats montrent que l’utilisation d’une approche simple, c’est-à-dire sans modification de l’implémentation dans MATLAB, peut nécessiter plus de 4 h et demie pour le traitement de 15 millions de paires de bases (pb) alors qu’une implémentation optimisée peut effectuer la même tâche en moins d’une minute. Nous avons obtenu les meilleurs résultats avec l’implémentation sur GPU qui a pu compléter l'analyse en 57 s, ce qui est plus de 270 fois plus rapide qu’une approche conventionnelle. Ce premier volet de recherche propose deux stratégies pour accélérer le traitement des données du génome humain et s’appuie sur les différents mécanismes de parallélisation. Lorsque l'implantation se fait avec un CPU, les résultats indiquent qu'il serait préférable d'utiliser une fonction de bas niveau (MEX) afin d'augmenter la vitesse d’exécution. De plus, l'usage des boucles parallèles (PARFOR) doit être effectué dans un ordre précis pour bénéficier au maximum du parallélisme dans l’implantation de Goertzel. Lorsque l'implantation est exécutée sur le GPU, les données doivent être segmentées en plus petits blocs afin d'optimiser les temps de traitement. En effet, les blocs qui sont trop gros risquaient de dépasser la taille de la mémoire tandis que des blocs trop petits ne permettaient pas à l'usager de bénéficier pleinement du parallélisme. Dans le second volet, nous avons poursuivi avec l’implantation d’un second algorithme qui permet de cibler les régions susceptibles à la présence de gènes. Cet algorithme se base sur les hexamères qui sont de courtes séquences d’ADN composées de 6 nucléotides. De toutes les variations d’hexamères possibles (4096), seulement 40 de celles-ci se retrouvent plus souvent dans les régions codantes que non codantes. Les autres hexamères se retrouvent autant dans les introns que dans les exons. Il est donc possible de survoler les séquences d’ADN et, selon la présence ou l’absence de certains hexamères, de prédire quelles régions sont codantes. Lors de la superposition des deux approches, soit l’analyse en fréquence et l’analyse des hexamères, il est possible de mieux cibler les zones où l’on peut retrouver de nouveaux gènes. Les analyses effectuées avec les différents algorithmes présentent des valeurs qui témoignent de la probabilité de retrouver un gène dans une région donnée. Pour compléter le processus de prédiction, il est important de déterminer un critère à partir duquel le programme décide qu’il s’agit réellement d’un gène. Ce critère est basé sur trois paramètres, soient le seuil positif, le seuil négatif et taille de la fenêtre. Afin de déterminer les valeurs optimales, les trois paramètres ont été balayés et la meilleure combinaison a été identifiée. L’approche proposée dans ce mémoire permet d’analyser de grandes séquences d’ADN en peu de temps afin d’identifier des zones susceptibles de coder un gène. Ce processus est important puisqu’on estime qu’il reste encore quelques milliers de gènes inconnus qui peuvent être responsables de plusieurs maladies génétiques. Nous espérons que ce travail contribuera à la découverte de nouveaux gènes pour ainsi mieux diagnostiquer certaines maladies génétiques.

La microscopie de fluorescence est devenue un outil incontournable en biologie. En particulier, il est possible de suivre dans le temps et dans l’espace en cellules vivantes l’activité de protéines en utilisant des biosenseurs FRET génétiquement encodés. Mon travail de thèse a consisté à développer de nouvelles méthodes de microscopie de fluorescence quantitative pour dépasser les limitations rencontrées dans le suivi de biosenseurs FRET. En premier lieu, j’ai eu à développer une méthodologie pour le suivi de deux biosenseurs FRET génétiquement encodés par mesure de durée de vie (FLIM) en simultané avec une seule longueur d’onde d’excitation. En effet, il n’est pas facile de suivre deux activités biochimiques par biosenseurs FRET dans un même échantillon vivant par microscopie de fluorescence à cause de l’existence de fuites spectrales dans les canaux de détection des différentes protéines fluorescentes et l’utilisation de deux longueurs d’onde d’excitation pour chacun des deux donneurs. En combinant les deux couples de protéines fluorescentes mTFP1/ShadowG et LSSmOrange/mKate2, les artefacts de fuite spectrale ont pu être négligés. Il a été possible de suivre les activités kinases des protéines ERK et PKA en simultané par FLIM. À l’aide de cette méthodologie, nous avons pu mettre en évidence une activation de la voie PKA lors d’une stimulation à l’EGF. En second lieu, j’ai développé une méthode pour le suivi de biosenseur FRET par la technique de spectroscopie à corrélation croisée de fluorescence (FCCS). Le suivi d’activité de certaines protéines peut s’avérer difficile du fait de leur faible expression au sein de l’échantillon vivant et de leur localisation. La méthode de FCCS nécessite une faible concentration de fluorophores et peut donc s’adapter à ces échantillons. Le FRET a un effet direct sur l’amplitude de corrélation croisée lorsque celle-ci est mesurée en suivant la co-diffusion de deux protéines fluorescentes attachées à un même biosenseur. Une diminution de ratio d’amplitude des courbes d’autocorrélation (verte ou rouge) sur l’amplitude de la courbe de corrélation croisée correspond à la présence de FRET. Nous avons pu mesurer cette diminution dans des cellules exprimant le biosenseur FRET Aurora A WT (FRET) en comparaison avec un mutant K162M (non FRET). Ces premiers résultats sont très prometteurs pour l’utilisation de cette approche au suivi d’un biosenseur faiblement exprimé en cellules vivantes. L’amélioration du suivi de biosenseur FRET, par les méthodes de microscopie de fluorescence quantitative présentées dans ce travail, doit pouvoir permettre la réponse à des questions d’intérêt biologiques nécessitant le suivi multiplex de FRET ou la mesure de biosenseurs à faible niveau d’expression, là où les techniques conventionnelles se heurtaient à leur limitation. / Fluorescence microscopy has become an invaluable tool in biology. In particular, it allows to follow in time and space the activity of proteins, using genetically encoded FRET biosensors, in live cell imaging. In my thesis work, I have developed new quantitative fluorescence microscopy methods to overcome the limitations encountered in monitoring FRET biosensors. First, I developed a methodology to monitor simultaneously two genetically encoded FRET biosensors by lifetime measures (FLIM) with a single excitation wavelength. Previously, it was not easy to follow two biochemical activities by FRET biosensors in the same live sample by fluorescence microscopy. Two reasons for that: the existence of spectral bleed through in the detection channel of each fluorescent proteins and the use of two excitation wavelengths for the two donors. By combining two fluorescent proteins pairs: mTFP1 / ShadowG and LSSmOrange / mKate2, the “spectral bleed through” artifact became negligible. It became then possible to follow the kinase activity of PKA and ERK proteins simultaneously by FLIM. Using this methodology, we were able to show an activation of the PKA pathway upon stimulation with EGF. Second, I developed a method to monitor FRET biosensor by fluorescence cross-correlation spectroscopy technique (FCCS). Monitoring the activity of certain proteins may be difficult due to their low expression in living sample and their sub-cellular localization. The FCCS methods requires a low concentration of fluorophores and can therefore be adapted to these samples. FRET has a direct effect on the cross-correlation amplitude when it is measured by following the co-diffusion of two fluorescent proteins attached to a same biosensor. An amplitude ratio decrease, of the autocorrelation curves (green or red) on the amplitude of the cross-correlation curve, corresponds to the presence of FRET. We were able to measure this ratio decreases in cells expressing the FRET biosensor Aurora A wild type (FRET) compared to the K162M mutant one (non-FRET). These first results are very promising to monitor the activity of a weakly expressed protein in living cells biosensor using this approach. The improvement of FRET biosensor monitoring, by quantitative fluorescence microscopy methods presented in this work, will help to answer biological questions of interest requiring the measurement of multiplex FRET monitoring or biosensors at low level expression, where conventional techniques are facing these limitations

La Réalité Virtuelle propose un nouvel outil d'investigation des systèmes biologiques complexes : l'expérimentation in virtuo. La modélisation de tels systèmes implique nécessairement celle de la cinétique de réactions biochimiques. Dans ce contexte, nous soutenons la thèse qu'il est possible d'expérimenter in virtuo la cinétique biochimique d'un système biologique complexe par des systèmes multi-agents (SMA) ordonnancés sur la base d'itérations asynchrones et chaotiques. Cette cinétique peut être abordée selon trois échelles de modélisation : macroscopique, mésoscopique et microscopique. Ainsi, nous proposons d'abord un SMA capable de simuler cette dernière à l'échelle macroscopique. Nous proposons ensuite un SMA pour la cinétique à l'échelle microscopique. Afin d'illustrer ces modèles, nous les appliquons à l'exemple de la coagulation du sang. Le modèle macroscopique est illustré sur le test du temps de Quick, tandis que le modèle microscopique est appliqué à la réaction d'activation de la prothrombine en thrombine.

Ce travail nous a permis de montrer qu'il était maintenant possible de déterminer de manière fiable de nombreux éléments métalliques dans les neiges Antarctiques à des niveaux de concentration extrêmement bas, en combinant des techniques de prélèvement ultra propres sur le terrain, des méthodes de préparation d'échantillon adaptées et des techniques d'analyse ultra sensibles comme l'ICP-SFMS ou la spectrométrie de masse à ionisation thermique. C'est ainsi que nous avons pu déterminer les concentrations de douze métaux (V, Cr, Mn, Co, Cu, Zn, Ag, Cd, Ba, Pb, Bi et U) et l'abondance isotopique du plomb dans l'excellente série d'échantillons prélevée en Terre de Coats, dans le secteur Atlantique du continent Antarctique. Les résultats obtenus nous ont permis de reconstituer l'évolution des apports naturels et anthropiques de métaux vers l'Antarctique, depuis les années 1830 jusqu'au début des années 1990. Ainsi pour Pb, la pollution commence dès la fin du 19ème Siècle, elle atteint son paroxysme aux alentours des années 1970-1980 pour redescendre ensuite au cours des décennies récentes. L'évolution des rapports isotopiques montre que les apports de plomb sont le résultat d'un mélange complexe de différentes contributions, provenant des pays d'Amérique du Sud et de l'Australie. Pour Cr, Cu, Zn, Ag, Bi et U, les concentrations dans la neige augmentent significativement à partir des années 1950. Cette évolution qui ne peut s'expliquer par des variations naturelles, démontre que la pollution atmosphérique pour ces métaux, en relation avec les activités anthropiques dans les pays de l'Hémisphère Sud comme par exemple la production des métaux ferreux et non-ferreux, a pris une ampleur globale. Une étude de la période 1920-1990, a permis de détailler l'évolution des concentrations en métaux, à l'échelle intra et inter annuelle. Les fortes variations enregistrées à Coats Land montrent que les apports de métaux sont complexes, associés aux processus de transport des moyennes latitudes vers la zone polaire mais aussi à la variabilité des différentes sources naturelles, comme le volcanisme local, les embruns marins ou les flux de poussières crustales.

Les mécanismes qui contrôlent le stockage du carbone dans le sol ne sont pas tous clairement identifiés et il reste une grande incertitude concernant leur quantification. L'usage et la gestion des sols sont les facteurs principaux qui influencent les transformations de la matière organique, déterminant la minéralisation du carbone et de l'azote ou leur rétention dans le sol<br />L'objectif principal de cette thèse est l'identification des processus physiques et biologiques qui sont influencés par la localisation des résidus dans le sol, en interaction avec la qualité de ces résidus. La localisation initiale des résidus modifie des propriétés physiques du sol : les dynamiques d'eau, le transport des solutés ou la température du sol. La qualité biochimique des résidus influence les processus (micro-)biologiques : les biotransformations du carbone et de l'azote, l'activité et la composition des populations microbiennes dans le sol. Ces changements physiques et biologiques interagissent, peuvent modifier la structure du sol (par l'agrégation) et, en retour, influencer la décomposition de la matière organique. <br />La première partie de ce travail traite de l'influence de la qualité des résidus végétaux et du type de sol sur la minéralisation du C et N en contact 'optimal' avec le sol (incorporation homogène des résidus finement coupés). Il est montré que sous conditions contrôlées et d'azote non limitant, la qualité des résidus est le facteur principal déterminant la vitesse de décomposition. Le type de sol a un effet négligeable sur les dynamiques de décomposition à court terme. Par contre, la minéralisation du carbone à plus long terme dépend du type de sol, ce qui est probablement lié aux différences dans la capacité du sol à stabiliser du carbone soluble ou d'origine microbienne.<br />La deuxième partie traite de l'effet de la localisation des résidus sur la minéralisation du C et N pour des résidus de colza dans un sol limoneux. Des colonnes de sol sont construites avec des résidus soit incorporés soit laissés à la surface du sol. Les colonnes sont placées périodiquement sous un simulateur de pluie pour simuler des conditions hydriques relativement similaires au champ. L'évaporation du sol est fortement réduite avec le mulch, ce qui conduit à une humidité du sol plus grande que lorsque les résidus sont incorporés. Simultanément, on observe un dessèchement rapide du mulch de résidus. Le C et N issu des résidus est distribué différemment dans le sol selon que ceux-ci sont à la surface ou incorporés. Les différences dans la disponibilité d'eau et des nutriments conduisent à une vitesse de décomposition plus lente pour des résidus à la surface que pour des résidus incorporés dans le sol. Cependant, la minéralisation nette de l'azote est plus grande dans le sol sous mulch qu'avec incorporation des résidus en raison de l'humidité plus grande qui favorise la minéralisation et d'une moindre organisation d'azote.<br />L'influence de la localisation des résidus sur le devenir du C et N dans le sol et dans les agrégats est examinée afin d'évaluer les mécanismes qui contrôlent le stockage du carbone dans le sol. A court terme, une grande partie de la matière organique particulaire (MOP) est retenue à la surface du sol avec le traitement mulch alors que toute la MOP a disparu quand les résidus sont incorporés. La présence des résidus augmente la taille moyenne des agrégats comparé au sol témoin et des agrégats plus larges sont trouvés dans la couche de sol 0-5 cm sous le mulch que dans la couche ou les résidus sont incorporés. La quantité totale du C des résidus récupérée dans les agrégats est similaire avec les résidus laissés à la surface et les résidus incorporés, mais elle est distribuée différemment dans le profil du sol. Malgré les différences dans la façon dont le C 'nouveau' entre dans le sol, la distribution relative du C des résidus dans les micro et macro agrégats est la même pour les deux localisations, probablement parce que dans les deux cas le C des résidus entre dans les agrégats sous forme soluble.<br />Finalement, l'interaction entre la localisation des résidus et leur qualité est étudiée. Un mulch réduit fortement l'évaporation du sol et l'importance de cette réduction dépend de la qualité physique du mulch. Des changements dans l'humidité du mulch, identifié comme facteur principal qui détermine la décomposition du mulch, dépend aussi de la qualité (physique) des résidus. Avec l'incorporation des résidus, la vitesse de minéralisation de C est principalement influencée par la qualité biochimique des résidus. L'interaction la plus forte entre localisation et qualité des résidus est observée sur les dynamiques de l'azote : la minéralisation nette de l'azote est déterminée par l'interaction entre l'humidité du sol (effet localisation) et la disponibilité de l'azote (effet qualité). Ces résultats permettent de développer et de calibrer un module du modèle PASTIS (Garnier et al., 2003), conçu pour simuler la décomposition d'un mulch. La modélisation avec PASTISmulch a permis d'avoir accès au flux brut d'azote, d'estimer le transport des nitrates et le lessivage potentiel dans le profil du sol, et de quantifier l'impact de la localisation et qualité des résidus sur la minéralisation du C et N dans le sol.

La protéine « Selenium Binding Protein » (SBP1), présente chez la plupart des êtres vivants, a un rôle qui n'est pas encore élucidé. Cette protéine possède dans sa structure primaire de nombreux sites potentiels de liaisons aux métaux. Chez Arabidopsis thaliana, la surexpression de SBP1 augmente la tolérance à deux composés toxiques pour la plante, le cadmium (Cd) et le sélénium (Se) qui sont présents dans les sols pollués. Pour mieux comprendre la fonction de SBP1 dans les mécanismes de détoxication, une démarche intégrée combinant deux approches complémentaires, in vitro et in planta, a été menée. La caractérisation biochimique de SBP1 a mis en évidence ses propriétés chélatrices vis-à-vis de différents ligands dont le Cd et le Se. Le Cd se lie à SBP1 avec un ratio molaire ligand/SBP1 de 3 et un KD de 2,2 × 10-7 M via principalement des acides aminés soufrés et potentiellement à moindre échelle des résidus histidines. Le Se, initialement sous forme SeO32-, se lie à SBP1 de façon covalente, avec un ratio molaire ligand/SBP1 de 1, via les cystéines 21 et 22 pour former une liaison de type R-S-Se-S-R. Les analyses in planta de localisation subcellulaire ont montré que SBP1 était à la fois cytosolique et nucléaire. L'utilisation de lignées bioluminescentes a permis d'analyser la zone promotrice du gène SBP1. Le motif cis ‘GAGAC' connu pour être impliqué dans la régulation de certains gènes à une carence en soufre (S) a été identifié comme élément cis majeur de la régulation de l'expression de SBP1 en réponse à différents stress, dont le Cd et le Se. Ce résultat démontre l'existence d'un lien entre la fonction de SBP1 et une demande en S de la cellule. La surexpression de SBP1 in planta perturbe le niveau d'accumulation du Se dans les parties aériennes, mais pas sa spéciation. L'ensemble de ces résultats semble indiquer que SBP1 soit impliquée dans des mécanismes de détoxication via ses propriétés chélatrices et qu'elle joue également un rôle dans le métabolisme du S et du Se. / The function of the protein “Selenium binding protein 1” (SBPP1), present in almost all organisms, is not yet well established. This protein has numerous potential metal binding sites. In Arabidopsis thaliana, SBP1 overexpression increases tolerance to two toxic compounds for the plant, cadmium (Cd) and selenium (Se), which are often found as soil pollutants. For a better understanding of SBP1 function and its involvement in detoxification mechanisms, an integrated approach combining in vitro and in planta experiments, has been performed. Biochemical characterization of SBP1 has revealed its chelating properties to different ligands including Cd and Se. Cd is bound to SBP1 with a metal ion to protein molar ratio of 3 and a KD of 2.2 × 10-7 M mainly via sulfur-containing amino acids and potentially histidine residues. Se from SeO32- can covalently bound SBP1 with a ligand to protein molar ratio of 1. This binding occurs via cysteines 21 and 22 and forms a R-S-Se-S-R complex. In planta analyses have shown that SBP1 is cytosolic and nuclear. The use of bioluminescent lines allowed the identification of a GAGAC motif in the SBP1 promoter region. This motif is a sulfur starvation responsive element and a major cis element involved in SBP1 expression in response to stress, including Cd and Se. The result directly links SBP1 function to an enhanced sulfur demand of the cell. SBP1 over expression in plants disturbs Se accumulation in shoots but not its speciation. All together these results strongly suggested that SBP1 could act as a detoxifying protein through its chelating properties and plays a role in S/Se metabolisms.

Nos activités quotidiennes impliquent des déplacements sur différents types de sol. Pour des personnes souffrant d'un trouble d’équilibre ou de perte d'autonomie, marcher sur certains sols pourrait s’avérer difficile. Il est d’ailleurs connu que 44% des chutes surviennent en trébuchant ou en glissant sur une surface. Ainsi, en raison du risque de chute que représenteraient certains sols, le premier facteur de risque qui devrait être étudié serait le type de sol. Dans cette thèse, nous présentons l'utilisation d'une chaussure interactive pour la différenciation automatique de six types de sol qui possèdent des propriétés physiques différentes. L'analyse de leur vibration lors du coup de talon a permis de les différencier. En effet, un coup de talon au sol donne une approximation de la réponse impulsionnelle du sol, qui peut être analysée aussi bien dans le domaine temporel que fréquentiel. À partir de ces analyses, un indice permettant la différenciation a été calculé. À l'aide d'un second prototype amélioré et adapté aux tailles des pieds, des personnes atteintes de la maladie de Parkinson (PAMP) ; des personnes âgées sans cette maladie et des jeunes adultes en bonne santé ont effectué deux tests cliniques sur différents types de sol. Un indice du risque de chute en fonction des paramètres d’équilibre est également calculé. De cette deuxième expérience, nous avons conclu que le type de sol affecte grandement l’équilibre humain, les paramètres de la marche et donc le niveau du risque de chute. Dans l’objectif de normaliser les paramètres de la marche, plusieurs recherches ont démontré les effets positifs d’une stimulation auditive et/ou visuelle sur les troubles d’équilibre en particulier chez les PAMP. Cependant, dans ces travaux, peu d'études ont évalué l’effet de la stimulation vibrotactile sous la plante du pied tout en la comparant aux autres types de stimulation. Ainsi, dans une troisième partie de notre thèse, nous avons utilisé et comparé trois types de stimulation (auditive, visuelle et vibrotactile). La fréquence de la stimulation a été fixée à 10% au-dessus de la cadence calculée sur le sol ayant le plus faible risque de chute. En fonction de la cadence obtenue, le second prototype (une semelle interactive) peut activer une stimulation vibrotactile visant à améliorer la marche et le contrôle de l'équilibre. Afin d’évaluer l’effet des stimulations utilisées sur le niveau du risque de chute sur un sol, nous avons comparé ces derniers résultats (avec stimulation) avec ceux obtenus dans la deuxième expérimentation (sans stimulation). Nos résultats suggèrent qu'une stimulation appropriée pourrait contribuer à la réduction d’un niveau du risque de chute sur un sol. Nous avons trouvé une différence significative et une diminution des risques de chutes calculés pour la plupart des types de sol en particulier pour les sols déformables qui peuvent faire chuter une personne présentant un trouble de la marche ou en perte d'autonomie. Our daily activities imply displacements on different types of soil. For people with a balance disorder or losing functional autonomy, walking on some types of soil could be difficult. It is known that 44% of falls occur by stumbling or sliding on a surface. Thus, due to the risk of falling of some soils, the first risk factor that should be studied would be the type of soil. In this thesis, we present the use of an interactive shoe for the automatic differentiation of six types of soil with different physical properties. The analysis of their vibration during the heel strike allows differentiating them. Indeed, a heel strike on the soil gives an approximation of the impulse response of the soil, which can be analyzed both in the temporal and frequency domain. From these analyzes, an index allowing differentiation was computed. Using a second improved prototype adapted to the size of the feet, people with Parkinson's disease (PD); the elderly without this disease and healthy young people carried out two clinical tests on different types of soil. An index of the risk of falling as a function of the gait parameters is also computed. From this second experiment, we concluded that the types of soil greatly affect the human balance, the walking parameters and therefore the level of risk of falling. To regulate walking and balance parameters, several studies have demonstrated the positive effects of auditory and/or visual stimulation on balance disorders, particularly in PD participants. However, in these works, few studies have evaluated the effect of vibrotactile stimulation under the sole of the foot while comparing it with other types of stimulation. Thus, in a third part of our thesis, we used and compared three types of stimulation (auditory, visual and vibrotactile). The frequency of stimulation was set at 10% above the cadence evaluated on the soil with the lowest risk of falling. Based on this cadence, the second prototype (an interactive insole) could activate a vibrotactile stimulation to improve walking and balance control. To evaluate the effect of the stimulations on the level of risk of falling over the soil, we compared these results (with stimulation) with those obtained in the second experiment (without stimulation). Our results suggest that an appropriate stimulation may contribute to reducing the risk of falling on soil. We found a significant difference and reduction in the risk of falls computed for most types of soil, particularly for deformable soils that can lead a person with a walking disorder or losing functional autonomy to fall.