Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Th. 3e cycle--Pharm.--Paris 5, 1981. N°: 22.

Ce travail s’inscrit dans un cadre de recherche global du génome humain. Il s'intéresse particulièrement à l'identification de milliers de gènes qui demeurent toujours inconnus à ce jour. Afin de pouvoir effectuer cette tâche sur une plateforme informatique, les séquences d’acide désoxyribonucléique (ADN) seront traitées comme étant des signaux pour permettre l’usage des techniques en traitement numérique de signaux (TNS). Cette approche permettra de réduire les coûts et surtout, le temps que prennent les chercheurs à trouver un gène impliqué dans une maladie. Le projet est divisé en deux volets. Le premier volet de cette recherche consiste à réduire de façon importante les temps de calcul de certains algorithmes en bio-informatique. Cette recherche propose une méthode de mise en oeuvre des algorithmes de prédiction de gènes en parallèle avec le logiciel MATLAB. Les approches proposées sont basées soit sur l’algorithme de Goertzel ou de FFT en utilisant diverses procédures de parallélisme sur une unité centrale de traitement (CPU) et à une unité de processeur graphique (GPU). Les résultats montrent que l’utilisation d’une approche simple, c’est-à-dire sans modification de l’implémentation dans MATLAB, peut nécessiter plus de 4 h et demie pour le traitement de 15 millions de paires de bases (pb) alors qu’une implémentation optimisée peut effectuer la même tâche en moins d’une minute. Nous avons obtenu les meilleurs résultats avec l’implémentation sur GPU qui a pu compléter l'analyse en 57 s, ce qui est plus de 270 fois plus rapide qu’une approche conventionnelle. Ce premier volet de recherche propose deux stratégies pour accélérer le traitement des données du génome humain et s’appuie sur les différents mécanismes de parallélisation. Lorsque l'implantation se fait avec un CPU, les résultats indiquent qu'il serait préférable d'utiliser une fonction de bas niveau (MEX) afin d'augmenter la vitesse d’exécution. De plus, l'usage des boucles parallèles (PARFOR) doit être effectué dans un ordre précis pour bénéficier au maximum du parallélisme dans l’implantation de Goertzel. Lorsque l'implantation est exécutée sur le GPU, les données doivent être segmentées en plus petits blocs afin d'optimiser les temps de traitement. En effet, les blocs qui sont trop gros risquaient de dépasser la taille de la mémoire tandis que des blocs trop petits ne permettaient pas à l'usager de bénéficier pleinement du parallélisme. Dans le second volet, nous avons poursuivi avec l’implantation d’un second algorithme qui permet de cibler les régions susceptibles à la présence de gènes. Cet algorithme se base sur les hexamères qui sont de courtes séquences d’ADN composées de 6 nucléotides. De toutes les variations d’hexamères possibles (4096), seulement 40 de celles-ci se retrouvent plus souvent dans les régions codantes que non codantes. Les autres hexamères se retrouvent autant dans les introns que dans les exons. Il est donc possible de survoler les séquences d’ADN et, selon la présence ou l’absence de certains hexamères, de prédire quelles régions sont codantes. Lors de la superposition des deux approches, soit l’analyse en fréquence et l’analyse des hexamères, il est possible de mieux cibler les zones où l’on peut retrouver de nouveaux gènes. Les analyses effectuées avec les différents algorithmes présentent des valeurs qui témoignent de la probabilité de retrouver un gène dans une région donnée. Pour compléter le processus de prédiction, il est important de déterminer un critère à partir duquel le programme décide qu’il s’agit réellement d’un gène. Ce critère est basé sur trois paramètres, soient le seuil positif, le seuil négatif et taille de la fenêtre. Afin de déterminer les valeurs optimales, les trois paramètres ont été balayés et la meilleure combinaison a été identifiée. L’approche proposée dans ce mémoire permet d’analyser de grandes séquences d’ADN en peu de temps afin d’identifier des zones susceptibles de coder un gène. Ce processus est important puisqu’on estime qu’il reste encore quelques milliers de gènes inconnus qui peuvent être responsables de plusieurs maladies génétiques. Nous espérons que ce travail contribuera à la découverte de nouveaux gènes pour ainsi mieux diagnostiquer certaines maladies génétiques.

La microscopie de fluorescence est devenue un outil incontournable en biologie. En particulier, il est possible de suivre dans le temps et dans l’espace en cellules vivantes l’activité de protéines en utilisant des biosenseurs FRET génétiquement encodés. Mon travail de thèse a consisté à développer de nouvelles méthodes de microscopie de fluorescence quantitative pour dépasser les limitations rencontrées dans le suivi de biosenseurs FRET. En premier lieu, j’ai eu à développer une méthodologie pour le suivi de deux biosenseurs FRET génétiquement encodés par mesure de durée de vie (FLIM) en simultané avec une seule longueur d’onde d’excitation. En effet, il n’est pas facile de suivre deux activités biochimiques par biosenseurs FRET dans un même échantillon vivant par microscopie de fluorescence à cause de l’existence de fuites spectrales dans les canaux de détection des différentes protéines fluorescentes et l’utilisation de deux longueurs d’onde d’excitation pour chacun des deux donneurs. En combinant les deux couples de protéines fluorescentes mTFP1/ShadowG et LSSmOrange/mKate2, les artefacts de fuite spectrale ont pu être négligés. Il a été possible de suivre les activités kinases des protéines ERK et PKA en simultané par FLIM. À l’aide de cette méthodologie, nous avons pu mettre en évidence une activation de la voie PKA lors d’une stimulation à l’EGF. En second lieu, j’ai développé une méthode pour le suivi de biosenseur FRET par la technique de spectroscopie à corrélation croisée de fluorescence (FCCS). Le suivi d’activité de certaines protéines peut s’avérer difficile du fait de leur faible expression au sein de l’échantillon vivant et de leur localisation. La méthode de FCCS nécessite une faible concentration de fluorophores et peut donc s’adapter à ces échantillons. Le FRET a un effet direct sur l’amplitude de corrélation croisée lorsque celle-ci est mesurée en suivant la co-diffusion de deux protéines fluorescentes attachées à un même biosenseur. Une diminution de ratio d’amplitude des courbes d’autocorrélation (verte ou rouge) sur l’amplitude de la courbe de corrélation croisée correspond à la présence de FRET. Nous avons pu mesurer cette diminution dans des cellules exprimant le biosenseur FRET Aurora A WT (FRET) en comparaison avec un mutant K162M (non FRET). Ces premiers résultats sont très prometteurs pour l’utilisation de cette approche au suivi d’un biosenseur faiblement exprimé en cellules vivantes. L’amélioration du suivi de biosenseur FRET, par les méthodes de microscopie de fluorescence quantitative présentées dans ce travail, doit pouvoir permettre la réponse à des questions d’intérêt biologiques nécessitant le suivi multiplex de FRET ou la mesure de biosenseurs à faible niveau d’expression, là où les techniques conventionnelles se heurtaient à leur limitation. / Fluorescence microscopy has become an invaluable tool in biology. In particular, it allows to follow in time and space the activity of proteins, using genetically encoded FRET biosensors, in live cell imaging. In my thesis work, I have developed new quantitative fluorescence microscopy methods to overcome the limitations encountered in monitoring FRET biosensors. First, I developed a methodology to monitor simultaneously two genetically encoded FRET biosensors by lifetime measures (FLIM) with a single excitation wavelength. Previously, it was not easy to follow two biochemical activities by FRET biosensors in the same live sample by fluorescence microscopy. Two reasons for that: the existence of spectral bleed through in the detection channel of each fluorescent proteins and the use of two excitation wavelengths for the two donors. By combining two fluorescent proteins pairs: mTFP1 / ShadowG and LSSmOrange / mKate2, the “spectral bleed through” artifact became negligible. It became then possible to follow the kinase activity of PKA and ERK proteins simultaneously by FLIM. Using this methodology, we were able to show an activation of the PKA pathway upon stimulation with EGF. Second, I developed a method to monitor FRET biosensor by fluorescence cross-correlation spectroscopy technique (FCCS). Monitoring the activity of certain proteins may be difficult due to their low expression in living sample and their sub-cellular localization. The FCCS methods requires a low concentration of fluorophores and can therefore be adapted to these samples. FRET has a direct effect on the cross-correlation amplitude when it is measured by following the co-diffusion of two fluorescent proteins attached to a same biosensor. An amplitude ratio decrease, of the autocorrelation curves (green or red) on the amplitude of the cross-correlation curve, corresponds to the presence of FRET. We were able to measure this ratio decreases in cells expressing the FRET biosensor Aurora A wild type (FRET) compared to the K162M mutant one (non-FRET). These first results are very promising to monitor the activity of a weakly expressed protein in living cells biosensor using this approach. The improvement of FRET biosensor monitoring, by quantitative fluorescence microscopy methods presented in this work, will help to answer biological questions of interest requiring the measurement of multiplex FRET monitoring or biosensors at low level expression, where conventional techniques are facing these limitations

La Réalité Virtuelle propose un nouvel outil d'investigation des systèmes biologiques complexes : l'expérimentation in virtuo. La modélisation de tels systèmes implique nécessairement celle de la cinétique de réactions biochimiques. Dans ce contexte, nous soutenons la thèse qu'il est possible d'expérimenter in virtuo la cinétique biochimique d'un système biologique complexe par des systèmes multi-agents (SMA) ordonnancés sur la base d'itérations asynchrones et chaotiques. Cette cinétique peut être abordée selon trois échelles de modélisation : macroscopique, mésoscopique et microscopique. Ainsi, nous proposons d'abord un SMA capable de simuler cette dernière à l'échelle macroscopique. Nous proposons ensuite un SMA pour la cinétique à l'échelle microscopique. Afin d'illustrer ces modèles, nous les appliquons à l'exemple de la coagulation du sang. Le modèle macroscopique est illustré sur le test du temps de Quick, tandis que le modèle microscopique est appliqué à la réaction d'activation de la prothrombine en thrombine.

Ce travail nous a permis de montrer qu'il était maintenant possible de déterminer de manière fiable de nombreux éléments métalliques dans les neiges Antarctiques à des niveaux de concentration extrêmement bas, en combinant des techniques de prélèvement ultra propres sur le terrain, des méthodes de préparation d'échantillon adaptées et des techniques d'analyse ultra sensibles comme l'ICP-SFMS ou la spectrométrie de masse à ionisation thermique. C'est ainsi que nous avons pu déterminer les concentrations de douze métaux (V, Cr, Mn, Co, Cu, Zn, Ag, Cd, Ba, Pb, Bi et U) et l'abondance isotopique du plomb dans l'excellente série d'échantillons prélevée en Terre de Coats, dans le secteur Atlantique du continent Antarctique. Les résultats obtenus nous ont permis de reconstituer l'évolution des apports naturels et anthropiques de métaux vers l'Antarctique, depuis les années 1830 jusqu'au début des années 1990. Ainsi pour Pb, la pollution commence dès la fin du 19ème Siècle, elle atteint son paroxysme aux alentours des années 1970-1980 pour redescendre ensuite au cours des décennies récentes. L'évolution des rapports isotopiques montre que les apports de plomb sont le résultat d'un mélange complexe de différentes contributions, provenant des pays d'Amérique du Sud et de l'Australie. Pour Cr, Cu, Zn, Ag, Bi et U, les concentrations dans la neige augmentent significativement à partir des années 1950. Cette évolution qui ne peut s'expliquer par des variations naturelles, démontre que la pollution atmosphérique pour ces métaux, en relation avec les activités anthropiques dans les pays de l'Hémisphère Sud comme par exemple la production des métaux ferreux et non-ferreux, a pris une ampleur globale. Une étude de la période 1920-1990, a permis de détailler l'évolution des concentrations en métaux, à l'échelle intra et inter annuelle. Les fortes variations enregistrées à Coats Land montrent que les apports de métaux sont complexes, associés aux processus de transport des moyennes latitudes vers la zone polaire mais aussi à la variabilité des différentes sources naturelles, comme le volcanisme local, les embruns marins ou les flux de poussières crustales.