Abstract Multifunctional enzyme type 1 (MFE-1) is a monomeric member of the hydratase/isomerase superfamily (H/I) involved in the β-oxidation of fatty acids. MFE-1 has 2-enoyl-CoA hydratase-1, Δ3-Δ2-enoyl-CoA isomerase, and several other enoyl-CoA isomerase activities at the N-terminus. The C-terminus has (3S)-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase activity. MFE-1 can also convert certain hydroxylated C27 bile acid synthesis intermediates. In these studies, a domain assignment of MFE-1 by sequence alignment with the H/I family (domains A and B in MFE-1) and mitochondrial monofunctional 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenases (HAD, domains C, D and E) was proposed. This was further improved with the structural information obtained from the crystal structure of the construct containing domains B, C, D and E (MFE1-DH). The structure of MFE1-DH resembles the bilobal structure of the α-subunit of the bacterial fatty acid metabolising complex and the mammalian HAD enzyme. The N-terminal linker helix of MFE1-DH (domain B) corresponds to helix-10 of the hydratase/isomerase enzymes having residues important for substrate contacts. Domain C adopts the classical Rossmann fold and forms the first lobe of the MFE1-DH structure. The C-terminal domains D and E form the second lobe and have local symmetry between each other. This local symmetry corresponds to the D domain-mediated dimerisation of the HAD dimer. The domain deletion studies showed that the presence of domains D and E, but not domain C, was essential to obtain a functional hydratase 1 enzyme; this can be understood from stabilising contacts from domain E to the linker helix, as seen in the MFE1-DH structure. The structure of human ACBP from liver was determined with and without a physiological ligand. This structure adopts the classical four-helix bundle of the ACBP family. The ligand binding mode seen in the presence of myristoyl-CoA shows that one ligand molecule is bound jointly by the two protein molecules of the asymmetric unit such that the fatty acid tail is bound by one protein molecule, and the 3'-phosphate AMP moiety of the CoA is bound by the other protein molecule, essentially as in known complexed ACBP structures in the monomeric binding mode. The observed ligand binding mode suggests a new model for the ACBP-mediated ligand transfer observed in biochemical in vitro studies. / Tiivistelmä Tyypin 1 monitoiminen entsyymi (MFE-1) on hydrataasi/isomeraasiperheen (H/I) jäsen ja se osallistuu rasvahappojen β-oksidaatioon. MFE-1:n N-päädyssä on 2-enoyyli-CoA-hydrataasi 1- ja Δ3-Δ2-enoyyli-CoA-isomeraasiaktiivisuus sekä useita muita enoyyli-CoA-isomeraasiaktiivisuuksia. C-päädyssä on (3S)-hydroksiasyyli-CoA-dehydrogenaasiaktiivisuus. MFE-1 voi myös katalysoida tiettyjen hydroksyloitujen C27-sappihapposynteesin välituotteiden reaktioita. Tässä tutkimuksessa määritettiin MFE-1:n domeenirakenne H/I-perheen (MFE-1:n domeenit A ja B) ja 3-hydroksiasyyli-CoA-dehydrogenaasiperheen (HAD, domeenit C, D ja E) sekvenssilinjausten perusteella. Rakennetta tarkennettiin domeenit B, C, D ja E sisältävän konstruktin (MFE1-DH) kiderakenteesta saadun tiedon avulla. MFE1-DH:n kiderakenne muistuttaa bakteerien rasvahappoja hajottavan kompleksin α-alayksikön sekä nisäkkäiden HAD-entsyymin kahdesta alayksiköstä muodostuvaa rakennetta. MFE1-DH:n N-päädyn α-kierre vastaa H/I-entsyymien kierre-10:tä, jossa sijaitsee substraattikontaktien kannalta tärkeitä aminohappotähteitä. C-domeeni muodostaa Rossmann-laskoksen ja se on MFE1-DH:n rakenteen ensimmäinen alayksikkö. C-päädyssä sijaitsevat D- ja E-domeenit muodostavat yhdessä toisen alayksikön ja niiden välillä on symmetria, joka vastaa D-domeenien välittämää HAD-entsyymien dimerisaatiota. Domeenitutkimukset osoittivat, että D- ja E-domeenien läsnä olo oli välttämätöntä hydrataasi 1:n toiminnalle, mutta C-domeeni voitiin poistaa ja säilyttää hydrataasi 1 -aktiivisuus. Havainto voitiin selittää MFE1-DH:n rakenteen avulla, jossa nähdään stabiloivia vuorovaikutuksia E-domeenin ja N-päädyn α-kierteen välillä. Ihmisen maksan ACBP:n kiderakenne määritettiin fysiologisen ligandin kanssa sekä ilman ligandia. Tämä rakenne laskostuu ACBP-perheelle tyypilliseksi neljän kierteen nipuksi. Myristoyyli-CoA:n läsnä ollessa havaitussa ligandin sitoutumistavassa yksi ligandimolekyyli on sitoutunut kahden proteiinimolekyylin välille siten, että rasvahappo-osa sitoutuu toiseen proteiinimolekyyliin ja CoA:n 3'-fosfaatti-AMP-osa sitoutuu toiseen proteiinimolekyyliin kuten tunnetuissa monomeerisissä ACBP:n sitomistavoissa. Havaitun sitoutumisen avulla voidaan ehdottaa uutta mallia ACBP:n välittämälle ligandinsiirrolle, joka on havaittu aikaisemmin biokemiallisissa in vitro -tutkimuksissa.

Abstract The aim of this PhD-study was to better understand the structure-function relationship of triosephosphate isomerase (TIM) and to use this expertise to change its substrate specificity. TIM is an important enzyme of the glycolytic pathway which catalyzes the interconversion of D-glyceraldehyde phosphate (D-GAP) and dihydroxyacetone phosphate (DHAP). Two main subjects are discussed: the engineering of monomeric TIM to create new substrate specificity and the structure-function relationship studies of the catalytically important mobile loop6. The starting point for the protein engineering project was the monomeric ml8bTIM, with an extended binding pocket between loop7 and loop8. Rational protein engineering efforts have resulted in a new variant called A-TIM that can competently bind wild type transition state analogues. A-TIM was also able to bind citrate, a compound that the wild type TIM does not bind. This A-TIM citrate complex structure is a good starting point for future protein engineering efforts. Based on the assumption that it would be beneficial for the monomeric forms of TIM to have loop6 closed permanently to increase the population of competent active sites, two point mutation variants, A178L and P168A were generated and characterized. The A178L-mutation was made to favor the closed conformation of loop6 through steric clashes in the open conformation. The P168A variant was made to stabilize the closed conformation of loop6 by removing strain. The A178L mutation induced some features of the closed conformation, but did not result in a closed conformation in the absence of ligands. Our structural studies also show that the P168A mutation does not favor the closed conformation either. However, the structures of the unliganded and liganded P168A variant, together with other known TIM structures show that the substrate binding first induces closure of loop7. This conformational switch subsequently forces loop6 to adopt its closed conformation. The protein engineering project was successful, but the efforts to find variants with a permanently closed loop6 did not fully succeed. In the context of this thesis a monomeric variant of TIM, with new binding properties, was created. Nevertheless, A-TIM still competently binds the inhibitors and transition state analogues of wild type TIM. Also, when combined, results discussed in the context of this thesis indicate that in wild type TIM the closure of loop7 after ligand binding is the initial step in the series of conformational changes that lead to the formation of the competent active site. / Tiivistelmä Tämän väitöskirjatyön tarkoituksena oli oppia paremmin ymmärtämään trioosifosfaatti-isomeraasin (TIM) toimintamekanismeja sen rakenteen perusteella ja käyttää tätä tietämystä samaisen proteiinin muokkaamiseen uusiin tarkoituksiin. TIM on keskeinen entsyymi solun energian tuotannossa ja sen toiminta on välttämätöntä kaikille eliöille. Tämän vuoksi on tärkeää oppia ymmärtämään miten se saavuttaa tehokkaan reaktionopeutensa ja miksi se katalysoi vain D-glyseraldehydi-3-fosfaattia (D-GAP) ja dihydroksiasetonifosfaattia (DHAP). TIM:n toiminta mekanismien ymmärtämiseksi sen aminohapposekvenssiä muokattiin kahdesta kohtaa (P168A ja A178L) ja seuraukset todettiin mittaamalla tuotettujen proteiinien stabiilisuutta optisesti eri lämpötiloissa ja selvittämällä niiden kolmiulotteinen rakenne käyttäen röntgensädekristallografiaa. Mutaatioita tehtiin dimeeriseen villityypin TIM:in (wtTIM) ja jo aikaisemmin muokattuun monomeeriseen TIM:in (ml1TIM). Näiden mutaatioiden tarkoituksena oli suosia entsyymin aktiivista konformaatiota, jossa reaktion kannalta välttämätön vapaasti liikkuva peptidisilmukka numero 6 on suljetussa konformaatiossa. Monomeerisissä TIM:ssa peptidisilmukka numero 6:n ei ole välttämätöntä aueta. Tulokset mutaatiokokeista olivat osittain lupaavia. P168A-mutaatio lisäsi D-GAP:in sitoutumista, mutta rikkoi tärkeän mekanismin suljetussa, ligandia sitovassa, konformaatiossa. A178L-mutaatio aiheutti muutoksia avoimeen konformaatioon ja teki siitä suljettua konformaatiota muistuttavan jopa ilman ligandia, mutta samalla koko proteiini muuttui epävakaammaksi. Näistä kahdesta mutaatiosta A178L voisi olla hyödyllinen muokattujen TIM-versioiden ominaisuuksien parantamiseksi. Lisäksi yhdessä jo aikaisemmin julkaistujen yksityiskohtien kanssa nämä tulokset tekevät mahdolliseksi esittää tarkennusta siihen miten TIM toimii kun ligandi saapuu sen lähettyville. Tämän väitöskirjatyön yksi tavoite oli myös muokata edelleen monomeeristä TIM versiota (ml8bTIM), joka on suunniteltu siten, että se voi mahdollisesti sitoa uudenlaisia ligandeja. Tämä projekti vaati onnistuakseen 20 eri versiota ml8bTIM:n sekvenssistä ja noin 30 rakennetta. Uusia ligandeja sitova muoto (A-TIM) sitoi onnistuneesti sitraattia ja villityypin TIM:n inhibiittoreita. Erityisen lupaavaa oli, että A-TIM sitoi myös bromohydroksiasetonifosfaattia (BHAP), joka sitoutuu ainoastaan toimivaan aktiiviseen kohtaan. Nämä tulokset osoittavat, että A-TIM kykenee tarvittaessa katalysoimaan isomerisaatio reaktion uudenlaisille molekyyleille. Esimerkiksi katalysoimaan isomerisointireaktiota sokerianalogien tuotannossa.