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El complejo histona acetiltransferasa B de la levadura Saccharomyces cerevisiae.Poveda Gabaldón, Ana María 25 October 2005 (has links)
En las células eucariotas el DNA se encuentra asociado a diferentes tipos de proteínas,empaquetándose en una estructura organizada, denominada cromatina. La unidad básica de lacromatina es el nucleosoma, que consiste en 147 pb de DNA ensamblados alrededor de unoctámero de histonas, formado por dos copias de cada una de las histonas, H2A, H2B, H3 y H4.Cada histona contiene dos motivos funcionales, el motivo histone fold que participa eninteracciones histona-histona y también en interacciones histona-DNA, y las colas de losextremos NH2-terminal, que son susceptibles de sufrir modificaciones postraduccionales, talescomo acetilación, metilación, fosforilación, ubiquitinación y sumoilación. Estas colas tambiénparticipan en la interacción con nucleosomas adyacentes. Además de las histonas internas, lacromatina de eucariotas también contiene la histona H1, que se dispone en el exterior delnucleosoma, y otras proteínas no histona como las HMGs (High Mobility Group). La acetilaciónde histonas es una de las modificaciones postraduccionales que más se ha estudiado. Estamodificación es realizada por complejos histona acetiltransferasa (HATs), y es revertida porcomplejos histona desacetilasa (HDs). En base a la localización subcelular, la preferencia dehistona y la habilidad de modificar histonas nucleosomales, los complejos HAT nativos se hanclasificado en dos grupos. Los enzimas HAT tipo A son enzimas nucleares capaces de acetilarhistonas ensambladas en cromatina, y que frecuentemente se asocian con procesos deregulación de la transcripción. Los enzimas HAT tipo B tienen una localización principalmentecitoplasmática y únicamente acetilan histonas libres, presumiblemente antes de su deposiciónen el DNA para formar nucleosomas. En levadura se describió la presencia de una HAT tipo B,[Ruiz-García et al., 1998], que se aisló en la fracción citoplásmica y que tenía una masamolecular de 200 kDa. Este enzima acetila específicamente la histona H4 libres, pero esincapaz de acetilar nucleosomas, y está formado, al menos, por la subunidad catalítica Hat1p ypor Hat2p [Lopez-Rodas et al., 1991, Kleff et al., 1995 y Parthun et al., 1996]. En este trabajo seha identificado bioquímicamente la proteína Hif1 (43.3 kDa, 385 aminoácidos), como unasubunidad del enzima B, no identificada hasta el momento. Además se han realizado estudiosde localización subcelular, mostrando que las proteínas del complejo HAT-B se encuentranmayoritariamente en el núcleo. Asimismo, encontramos una dependencia de la localizaciónsubcelular de Hat1p con la presencia de Hat2p. En este trabajo mostramos que el complejoHAT-B acetila una fracción soluble de H4, no ensamblada en cromatina, en las lisinas 12 y 5.Cuando esta fracción soluble de H4 se acumula por alguna causa, es degradada por una rutadependiente de la proteína Rad53, una proteína quinasa de checkpoint. La acetilación de lahistona H4 es dependiente de las proteínas Hat1 y Hat2, pero no de la subunidad Hif1p, que noparece estar implicada en la función de acetilación. Además, tanto la proteína Hat1 como Hat2son necesarias para la unión del sustrato, H4, pero Hif1p no participa en esta unión. / Hat1 is the catalytic subunit of the only type B histone acetyltransferase known (HAT-B). Theenzyme specifically acetylates lysine 12, and to a lesser extent lysine 5, of free, non-chromatinboundhistone H4. The complex is usually isolated with cytosolic fractions and is thought to beinvolved in chromatin assembly. The Saccharomyces cerevisiae HAT-B complex also containsHat2, a protein stimulating Hat1 catalytic activity. At these work we identified by two-hybridexperiments Hif1 as both a Hat1- and a histone H4-interacting protein. These interactions weredependent on HAT2, indicating a mediating role for Hat2. Biochemical fractionation and coimmunoprecipitationassays demonstrated that Hif1 is a component of a yeast heterotrimericHAT-B complex, in which Hat2 bridges Hat1 and Hif1 proteins. In contrast to Hat2, this novelsubunit does not appear to regulate Hat1 enzymatic activity. Nevertheless, similarly to Hat1,Hif1 influences telomeric silencing. In a localization analysis by immunofluorescencemicroscopy on yeast strains expressing tagged versions of Hat1, Hat2, and Hif1, we have foundthat all three HAT-B proteins are mainly localized in the nucleus, and the nuclear Hat1plocalization is dependent on Hat2 protein. Thus, we propose that the distinction between A- andB-type enzymes should henceforth be based on their capacity to acetylate histones bound tonucleosomes and not on their location within the cell. At these work we demonstrate HAT-Bcomplex acetylates a soluble histone H4 fraction, not assembled in chromatin, at lysines 5 and12. When the soluble histone fraction is acumulated in the cell, it is degradated by a pathwayregulated by Rad53p.Histone H4 acetylation is dependent on Hat1 and Hat2 proteins, but noton Hif1p. These subunit not seems be related with histone acetylation function. Indeed, both,Hat1p and Hat2p, are necessaries for the histone H4 binding, but not Hif1p.
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Regulación redox de la Rubisco: Contribución estructural y funcional del par de residuos conservados Cys172 y Cys192.García Murria, María Jesús 06 April 2006 (has links)
La Ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa (Rubisco) cataliza el primer paso en la fijación fotosintética del CO2 a través del ciclo de Calvin. La estructura del holoenzima activo en organismos eucariotas es un hexadecámero compuesto por 8 subunidades grandes (de 51-58KDa) y 8 subunidades pequeñas (de 12-18KDa). En condiciones de senescencia natural o inducida por estrés la Rubisco sufre una degradación rápida y selectiva. Una de las respuestas más generalizadas ante diferentes tipos de estrés en distintos organismos es la oxidación de grupos tioles de la Rubisco, que se ha relacionado in vitro e in vivo con la inactivación y susceptibilización proteolítica del enzima. Los residuos de cisteínas filogenéticamente conservados de la Rubisco son candidatos potenciales a mediar esta regulación redox. Con estos antecedentes, el objetivo general del presente trabajo ha sido evaluar la implicación de los residuos Cys172 y Cys192 (altamente conservados en eucariotas y cianobacterias) en la actividad, modulación redox, y en la organización estructural del holoenzima. Para ello se han abordado los siguientes aspectos:I. Obtención y caracterización de las Rubiscos mutantes C172S, C192S y C172S/C192S Las funciones de los residuos Cys172 y Cys192 se han investigado estudiando el fenotipo de mutantes en los que dichos residuos se han sustituido por serina mediante mutagénesis dirigida del gen rbcL en el alga unicelular Chlamydomonas reinhardtii. El enzima C172S posee un factor de especificidad mayor que el silvestre, con unas constantes aparentes de Michaelis para el CO2 y O2 aumentadas. La Rubisco C192S presenta una especial sensibilidad a la inactivación por agentes modificadores de grupos sulfhidrilo. Ello parece responder al carácter crítico de la modificación de la Cys172 en la actividad enzimática y al efecto protector que sobre este residuo ejerce la Cys192. El estudio del ensayo de la sensibilidad térmica, de los cambios en la sensibilidad proteolítica y de la movilidad del holoenzima en geles nativos indica que la sustitución de las Cys172 y/o Cys192 afecta a la estructura de los enzimas. II. Determinación de la estructura de las Rubiscos C172S y C192S por difracción de rayos X Se ha determinado la estructura tridimensional de la Rubisco de los mutantes C172S y C192S. Como diferencia más significativa se ha detectado un desplazamiento de la hebra β1 del barril α/β en el enzima C172S en relación a la estructura del enzima silvestre. III. Estudio de la respuesta de los mutantes a diferentes tipos de estrés El mutante C172S sometido a estrés salino degrada la Rubisco de forma más lenta que la cepa silvestre o los demás mutantes. Además, bajo un estrés por diamida específicamente dirigido a la oxidación de los grupos sulfhidrilo, el mutante C172S se muestra resistente a la inactivación que sufren las demás cepas. Ello apunta a un papel singular del residuo Cys172 en la modulación del catabolismo de la Rubisco en respuesta a situaciones de estrés. En condiciones de estrés por diamida, todas las cepas mutantes (C172S, C192S y C172S/C192S) presentan una degradación retardada de la Rubisco por comparación con la cepa silvestre. Ello sugiere que, en estas condiciones de oxidación directa de los tioles celulares, la formación de un puente disulfuro entre la Cys172 y la Cys192 podría actuar como una señal condicionante de la degradación del enzima. / Cysteines 172 and 192 from the large subunit of the photosynthetic enzyme ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco) are a pair of vicinal residues evolutively conserved among cyanobacteria, algae and higher plants. In the present study, it has been analyzed the effect of the substitution of Cys172 and Cys192 by serine on the catalytic properties, thermostability, three-dimensional structure of the mutant enzymes, and the in vivo turnover and inactivation of Rubisco enzymes in stressed cells.1. Site-directed mutagenesis of conserved cysteine residues (Cys172 and Cys192) of Rubisco in Chlamydomonas reinhardtii and Rubisco mutants characterization.The most remarkable effect of the C172S mutant was a 15% increase in the value of the specificity factor compared to the wild-type enzyme, while the specificity factor of C192S Rubisco was identical to wild-type.The C192S enzyme was more sensitive to inactivation through oxidation of cysteines than the wild type and the rest of the enzymes. The results suggest that the Cys192 protects the critical modification of the Cys172. The results of thermal stability, proteolytic susceptibility assays and holoenzyme mobility in native electrophoresis show that the substitution of Cys172 and/or Cys192 affect to the enzyme structure. 2. Crystallization and Structure determination of C172S and C192S Rubisco mutants.X-ray structures of the mutant enzymes reveal that the substitution at position 172 causes a significant shift of the main chain backbone atoms of β-strand1 of the α/β-barrel.3. In Vivo turnover and inactivation of the C172S, C192S, C172S/C192S and wild-type Rubisco Enzymes in stressed Cells.The absence of Cys172 protects Rubisco from degradation under saline stress conditions. The C172S mutant enzyme is more resistant to inactivation under oxidative (diamide induced) stress.In a oxidative conditions (diamide stress) Cys172-Cys192 disulfide bond formation could act as a redox signaling pathway.
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Muscleblind, relevancia clínica y análisis de la función molecular en Drosophila melanogaster.Pascual Lucas, Maya 10 November 2005 (has links)
Las proteínas Muscleblind humanas, MBNL1, MBNL2 y MBNL3, son factores de splicing alternativo que se unen a sus pre-mRNAs diana mediante un nuevo dominio de dedos de zinc del tipo CCCH que esta conservado evolutivamente. Las proteínas MBNL están implicadas en la ruta de patogénesis de la Distrofia Miotónica (DM) ya que son secuestradas por la expansión del trinucleótido CUG presente en los mRNA mutantes de los genes DMPK (DM1) y ZNF9 (DM2). De acuerdo con el fenotipo de la DM, las mutaciones por pérdida de función en el gen muscleblind (mbl) de Drosophila afectan a la diferenciación terminal de la musculatura y los fotorreceptores. Sin embargo, no se conoce la función molecular de las proteínas Mbl en organismos modelo de invertebrados tales como Drosophila. En este trabajo mostramos que los tres genes MBNL humanos son parálogos, que tienen un patrón de expresión regulado a lo largo del desarrollo y que sus pre-mRNAs sufren un complejo patrón de procesado alternativo que genera distintas isoformas proteicas. Un estudio evolutivo muestra que las proteínas Mbl están presentes en todos los Bilateria y que se caracterizan por la presencia de, al menos, dos dedos de zinc del tipo CX7CX6CX3H. En humanos describimos un polimorfismo en la región 5´ no traducida del gen MBNL1 y analizamos su posible relevancia como modificador genético del fenotipo de la DM. Además, descartamos la presencia de mutaciones en la región codificante de MBNL1 en pacientes con DM sin expansión en el gen DMPK y en pacientes con Retinitis pigmentosa tipo 3. También descartamos mutaciones en la región codificante de MBNL3 en pacientes con Ptosis congénita asociada al cromosoma X. En Drosophila, hacemos un rastreo genético de modificadores dominantes del fenotipo de sobreexpresión de muscleblind en ojo. Los genes que interaccionan genéticamente se pueden agrupar en tres categorías generales: (1) Metabolismo del RNA, que incluye componentes del exon junction complex (EJC) tales como Aly y factores de splicing como nonA; (2) Regulación de la Transcripción, que incluye tanto proteínas que regulan la estructura de la cromatina (Jumeaux) como activadores de la transcripción (Dp), y (3) Control de la Apoptosis, que incluye tanto genes proapoptóticos (thread) como antiapoptóticos (Traf). Además, en este trabajo generamos moscas transgénicas que expresan la proteína de fusión MblC:GFP y las usamos para llevar a cabo experimentos de co-immunoprecipitación (coIP) con el fin de identificar proteínas que interaccionen físicamente con Mbl. Como resultado, hemos identificado seis bandas que coIP in vivo con la proteína de fusión MblC:GFP. Mediante la técnica de Western blot, descartamos la presencia en el coIP de MblC:GFP de algunas proteínas candidatas como Jumu, Aly, Amos y NonA. Este resultado nos permite concluir que estas cuatro proteínas no interaccionan físicamente con Mbl, al menos bajo las condiciones experimentales testadas. / Human Muscleblind proteins MBNL1, MBNL2 and MBNL3 are alternative splicing regulators that bind pre-mRNAs through an evolutionarily conserved tandem CCCH zinc finger domain. MBNL proteins have been implicated in the pathogenetic pathway of the Myotonic Dystrophy (DM) as they are sequestered by the CUG triplet repeat expansion-containing mRNAs of mutant DMPK (DM1) and ZNF9 (DM2) genes. In agreement with the DM phenotype, Drosophila muscleblind (mbl) loss-of-function mutations impair terminal differentiation of muscle and photoreceptor cells. However, little is known about the molecular function of Mbl proteins in invertebrate model organisms. In this work, we report that the three human MBNL genes are paralogues, their expression pattern is developmentally regulated and their pre-mRNAs undergo a complex alternative splicing regulation generating several protein isoforms. An evolutionary study shows that Mbl proteins are present in all Bilateria and are characterized by the presence of, at least, two CX7CX6CX3H zinc fingers. In humans, we describe a polymorphism in the 5´ untranslated region of the MBNL1 gene and analyze its potential relevance as a genetic modifier of the DM phenotype. Moreover, we discard mutations in the coding region of the MBNL1 gene in DM patients showing no CTG expansion in the DMPK gene and in patients with Retinitis Pigmentosa type 3. We also discard mutations in the coding region of the MBNL3 gene in patients with X-linked Congenital Isolated Ptosis. In Drosophila, we made a genetic screen for dominant modifiers of a muscleblind overexpression phenotype in the eye. Genes that genetically interact with mbl fall into three broad categories: (1) RNA metabolism, including components of the exon junction complex (EJC) such as Aly and splicing factors such as nonA; (2) Transcription regulation, which includes chromatin structure regulators (Jumeaux) and transcription activators such as Dp, and (3) Apoptosis control, including both proapoptotic (thread) and antiapoptotic (Traf) genes. In addition, we generated transgenic flies expressing a MblC:GFP fusion protein and used them to perform co-inmunoprecipitation (coIP) experiments to uncover proteins that physically interact with Mbl. We identified six bands specifically coIP with the MblC:GFP fusion protein and discarded Jumu, Aly, Amos and NonA as Mbl molecular partners.
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Estudios sobre la inmunogenicidad y los mecanismos fisiopatológicos de la proteína NSP4 de rotavirus.Rodríguez Díaz, Jesús 10 June 2005 (has links)
Rotavirus es el principal agente causante de gastroenteritis viral en niños y animales jóvenes en todo el mundo. Una de las principales proteínas de rotavirus es la glicoproteína no estructural 4 (NSP4) que juega un papel crucial tanto en el ciclo replicativo de rotavirus, actuando como receptor de partículas inmaduras en el retículo endoplasmático, como en la fisiopatología de rotavirus, siendo la primera enterotoxina de origen vírico descrita hasta el momento. El objetivo de la presente tesis fue clonar y producir la glicoproteína NSP4 de diferentes cepas humanas y animales de rotavirus para así poder realizar estudios inmunogénicos tales como la caracterización de epitopos presentes en la proteína y la respuesta inmune que esta proteína despierta tras la infección por rotavirus. Así mismo nos planteábamos estudiar la capacidad que poseen tanto la infección por rotavirus como la proteína NSP4 de producir óxido nítrico (ON) tanto "in vivo" como "in vitro" y la posible implicación del ON en la fisiopatología de rotavirus. Se utilizó el sistema de expresión de baculovirus en células de insecto para la producción y purificación de la proteína NSP4 de diferentes cepas de rotavirus humanas y de animales en forma biológicamente activa. Experimentos de inmunización de ratones demostraron que los anticuerpos producidos frente a la proteína NSP4 reconocen principalmente el fragmento carboxi-terminal de la proteína (aminoácidos 114 a 175), por lo que esta región es inmunodominante. En la presente tesis se utilizó la tecnología de "phage display" para producir anticuerpos monoclonales de simple cadena (scFv) frente a la proteína NSP4. Esta técnica nos permitió aislar scFvs frente a regiones no inmunodominantes de la proteína NSP4.Los estudios realizados con sueros de niños convalecientes de una infección por rotavirus muestran que la proteína NSP4 provoca una respuesta inmune humoral tras la infección natural por rotavirus en niños, constituída por anticuerpos séricos de clase IgG y que esta respuesta no parece ser de larga duración, según los resultados obtenidos con sueros de niños y adultos sanos. Proteínas NSP4 procedentes de dos diferentes genotipos (A y B) fueron utilizadas para estudiar la reactividad cruzada de los anticuerpos frente a NSP4. Los resultados obtenidos muestran que los anticuerpos IgG séricos desarrollados frente a NSP4 en niños con gastroenteritis aguda por rotavirus presentan en el 40% de los casos estudiados reactividad cruzada frente a más de un genotipo de dicha proteína, por lo que este reconocimento de los genotipos A y B de NSP4 no es siempre heterotípico. Los experimentos realizados con células epiteliales humanas HT-29 "in vitro" muestran que la proteína NSP4 provoca un incremento de la secreción de ON en este tipo celular. Este incremento ocurre de forma paralela al incremento de calcio intracelular observado en la misma línea celular en respuesta a NSP4, indicando una posible participación de la enzima óxido nítrico sintasa constitutiva (cNOS). Por último los experimentos realizados "in vivo" en el modelo murino, así como en muestras de orina procedentes de niños con gastroenteritis por rotavirus muestran que las infecciones por rotavirus en ratones Balb/c provocan un aumento en la concentración de los productos derivados del ON en la orina de los animales infectados, con la participación de la enzima óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) en el modelo murino y que este incremento se observa también en la orina de niños con gastroenteritis por rotavirus. / The baculovirus expression system in insect cells was utilized to produce and purify the biologically active form of the NSP4 protein from rotavirus strains isolated from different animal and human strains. After the immunization of mice with the different ourified NSP4 proteins the super-immune sera obtained from NSP4 immunized mice, strongly recognize the carboxi-end of the protein (aminoacids 114 to 175), being indicative of the immunodominance of this region.One of the objebtives of this thesis was to obtain monoclonal antibodies, using the phage display technique that showed to be a useful tool in producing antibodies that recognize different epitopes in the NSP4 protein, thus being able to conduct inhibitory studies to identify biological activity. One interesting result when using this technique was that the phage display technique allowed us for the isolation of single chain monoclonal antibodies against non-immunodominant regions of NSP4.We also present data on the immunogenicity of the NSP4 protein in natural rotavirus infections in humans. Our results show that the NSP4 protein elicits a humoral immune response in children that had been naturally infected by rotavirus. The IgG serical antibodies developed against the NSP4 in children suffering acute rotavirus gastroenteritis, present cross reactivity against more than one genotype of the protein in 40% of the studied cases, indicating that the recognition of A and B NSP4 genotypes is not always heterotypic.Finally we studied the possible role of the nitric oxide (NO) in rotavirus pathophysiology. The NSP4 protein produced an increase in NO secretion in cultured HT-29 human epithelial cells. This increase occurred in parallel to the intracellular calcium increase previously observed in the same cell line in response to the NSP4.The rotaviral infections in Blab/c mice produced an increase in the concentration of the nitric oxide derived products in the urine of the infected animals, through the induction of the inducible nitric oxide enzyme (iNOS) in the murine model. This increase was also observed in the urine of children suffering acute rotaviral gastroenteritis.
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Caractérisation de mollusques gastéropodes terrestres en tant que bioindicateurs de la contamination polymétallique (Al, Cr, Mn, Fe, Ni, Zn, Cu, Cd et Pb)Pihan, François. Gomot, Lucien. January 2001 (has links) (PDF)
Thèse doctorat : Sciences de la vie. Spécialité : Ecotoxicologie : Metz : 2001. / 2001METZ039S. Bibliogr. p.404-421.
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Etude de la qualité de l'air en Lorraine-Nord par les lichens contribution en tant que bioindicateurs écologiques, bioaccumulateurs d'éléments chimiques et biomarqueurs du stress oxydant /Signoret, Jonathan. Müller, Serge. January 2008 (has links) (PDF)
Reproduction de : Thèse doctorat : Sciences de la vie : Metz : 2002. / Titre provenant de l'écran-titre. Notes bibliographiques.
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Formulation d'une émulsion Eau dans Huile avec des ingrédients naturelsKeromnes, Hélène Billon, Aurélie January 2008 (has links)
Reproduction de : Thèse d'exercice : Pharmacie : Nantes : 2008. / Bibliogr.
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Les processus biogéochimiques impliqués dans la mobilité de l'arsenic recherche de bioindicateurs /Quemeneur, Marianne Leyval, Corinne Jauzein, Michel January 2008 (has links) (PDF)
Thèse de doctorat : Géosciences : Nancy 1 : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre.
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Mise au point et validation sur sites contaminés (ETM-HAP) d'un test de biosurveillance en microcosme croissance et bioaccumulation par gastéropode terrestre Helix Aspersa Aspersa /Viard-La Rocca, Bénédicte. Pihan, Jean-Claude. January 2008 (has links) (PDF)
Reproduction de : Thèse de doctorat : Sciences de la vie : Toxicologie de l'environnement : Metz : 2004. / Titre provenant de l'écran-titre. Notes bibliographiques.
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Etude écotoxicologique en milieu aquatique du Mexel 432, substance antisalissureCzembor, Nathalie. Pihan, Jean-Claude. January 2001 (has links) (PDF)
Thèse doctorat : Sciences de la vie. Spécialité : Ecotoxicologie : Metz : 2001. / 2001METZ038S. Bibliogr. p. 185-197.
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