Universiẗat, Diss., 2004--Heidelberg.

Universiẗat, Diss., 2004--Bonn.

Techn. Universiẗat, Diss., 2005--Berlin.

Tierärztliche Hochsch., Diss., 2005--Hannover.

Proefschrift Universiteit Maastricht. / Met lit. opg.

Proefschrift Universiteit Maastricht. / Met bibliogr., lit. opg. - Met samenvatting in het Nederlands.

Proefschrift Universiteit Maastricht. / Auteursnaam op omslag: Bary Berghmans. Met bibliogr., lit. opg. - Met samenvatting in het Nederlands.

Die vier Crz-Neurone des ventralen Nervensystems von Drosophila melanogaster sammeln Evidenz, wann im Rahmen eines Paarungsakts zirka 6 Minuten vergangen sind. Diese Entscheidung ist für die männliche Fliege von Bedeutung, da das Männchen vor Ablauf dieser ~6 Minuten, welche den Zeitpunkt der Ejakulation darstellen, eher das eigene Leben opfern würde, als dass es die Paarung beenden würde. Nach Ablauf der ~6 Minuten fällt die Motivation des Männchens dagegen dramatisch ab. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde zunächst mittels optogenetischer neuronaler Inhibitionsprotokolle sowie Verhaltensanalysen das Phänomen der Evidenz-akkumulation in den Crz-Neuronen genauer charakterisiert. Dabei zeigte sich, dass die akkumulierte Evidenz auch während einer elektrischen Inhibition der Crz-Neurone persistierte. Dieses Ergebnis warf die Hypothese auf, dass das Äquivalent der akkumulierten Evidenz in den Crz-Neuronen biochemischer Natur sein könnte. Es wurde daraufhin ein Hochdurchsatzscreening-Verfahren entwickelt, mittels dessen 1388 genetische Manipulationen der Crz-Neurone durchgeführt und auf eine Änderung der Evidenzakkumulation getestet wurden. Nur ~30 genetische Manipulationen zeigten eine veränderte Evidenzakkumulation, wobei die meisten dieser Manipulationen den cAMP-Signalweg betrafen. Mittels der optogenetischen Photoadenylatzyklase bPAC, einer Reihe weiterer genetischer Manipulationen des cAMP-Signalwegs sowie der ex vivo Kalzium-Bildgebung und Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie konnte bestätigt werden, dass cAMP das Äquivalent der in den Crz-Neuronen spannungsabhängig akkumulierten Evidenz darstellt, wobei die Kombination dieser Methoden nahelegte, dass der Schwellenwert der Evidenzakkumulation durch die cAMP-Bindungsaffinität der regulatorischen PKA-Untereinheiten festgelegt sein könnte. Mittels genetischer Mosaikexperimente sowie bildgebenden Verfahren konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass innerhalb des Crz-Netzwerks eine positive Rückkopplungsschleife aus rekurrenter Aktivität sowie der cAMP-Akkumulation besteht, welche, sobald die cAMP-Spiegel den Schwellenwert erreichen, zu einem netzwerkweit synchronisierten massiven Kalziumeinstrom führt, was die Abgabe des Crz-Signals an nachgeschaltete Netzwerke triggert. Dieses Phänomen könnte ein Analogon des Aktionspotenzials auf Netzwerkebene sowie auf Intervallzeitskalen darstellen und wurde als „Eruption“ bezeichnet. Genetische, optogenetische sowie Bildgebungsexperimente konnten zeigen, dass die CaMKII derartige Eruptionen durch Niedrighalten der cAMP-Spiegel unterdrückt, was den Zeitmessmechanismus des ersten beschriebenen Intervallzeitmessers CaMKII offenlegt. / The four Crz neurons of the ventral nervous system of Drosophila melanogaster collect evidence about when approximately 6 minutes have elapsed during a mating act. This decision is of importance for the male fly as the male would rather sacrifice his own life than terminate mating before the expiration of these ~6 minutes, which represent the time of ejaculation. After these ~6 minutes, however, the male's motivation drops dramatically. In this dissertation, optogenetic neuronal inhibition protocols as well as behavioral analyses were used to characterize the phenomenon of evidence accumulation in the Crz neurons in more detail. This showed that the accumulated evidence persisted during electrical inhibition of the Crz neurons. This result raised the hypothesis that the equivalent of accumulated evidence in the Crz neurons might be biochemical in nature. A high-throughput-screening-assay was developed using which 1388 genetic manipulations of the Crz neurons were performed and tested for a change in evidence accumulation. Only ~30 genetic manipulations showed altered evidence accumulation, with most of these manipulations involving the cAMP pathway. Using the optogenetic photoadenylyl cyclase bPAC, a number of other genetic manipulations of the cAMP pathway, as well as ex vivo calcium imaging and fluorescence lifetime microscopy techniques, it was confirmed that cAMP represents the equivalent of accumulated evidence in the Crz neurons, and the combination of these methods suggested that the evidence accumulation threshold may be set by the cAMP-binding affinity of regulatory PKA subunits. Using genetic mosaic experiments as well as imaging techniques, it was further shown that within the Crz network there is a positive feedback loop between the recurrent activity as well as the cAMP accumulation, which, once cAMP levels reach the threshold, leads to a network-wide synchronized massive calcium influx, triggering the delivery of the Crz signal to downstream networks. This phenomenon could represent an analog of the action potential at the network level as well as at interval time scales and has been termed an "eruption." Genetic, optogenetic as well as imaging experiments could show that CaMKII suppresses such eruptions by keeping cAMP levels low, revealing the timing mechanism of CaMKII, the first described interval timer.

Das Konzept, Insulin-produzierende Zellen als Ersatz für zerstörte Beta-Zellen beim Diabetes mellitus Typ I einzusetzen, ist auch weiterhin hoch attraktiv. Eine Alternative zur Herstellung Insulin-produzierender Zellen aus embryonalen oder adulten Stammzellen könnten in vitro modifizierte, Insulin-positive Monozyten sein. Seit längerem ist bekannt, dass sich Monozyten in Makrophagen und Dendritische Zellen differenzieren. Weniger bekannt ist, dass sich Monozyten auch in eine Vielzahl nicht-phagozytierender Zellen differenzieren können. Hierzu gehören auch Insulin-positive Zellen. Für die optimale Zelltherapie ist zu fordern, dass die Zellen nicht nur ihre Funktion im Patienten beibehalten, sondern dass von ihnen auch kein immu-nologisches Risiko ausgeht. Blutmonozyten lassen sich einfach gewinnen und stünden somit als autologer Zellersatz für eine mögliche Zelltherapie zur Verfügung. Monozyten von zwölf gesunden Spendern im Alter zwischen 23 und 57 Jahren wurden untersucht. Die Monozyten wurden durch Adhärenz angereichert und für sechs Tage in X-Medium mit den Cytokinen M-CSF und IL-3 und für weitere vier Tage in Y-Medium mit den Cytokinen HGF und EGF inkubiert. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass sich Insulin-positive Monozyten routine-mäßig aus peripheren Blutmonozyten gesunder Spender mittels Leukapharese gewinnen lassen. Frisch isolierte periphere Blutmonozyten waren vor ihrer Kultivierung negativ für Insulin und C-Peptid. Nach zehntägiger Kultur wurden 77±16% Insulin-positive und 49±30% C-Peptid-positive Monozyten nachgewiesen. Weiterhin exprimierten 60±4% der Zellen den Monozytenmarker CD14. Auch wurde gezeigt, dass die Kulturbedingungen die Ausbeute an Insulin-positiven Monozyten beeinflussen. Aus jeweils drei Millionen Insulin-positiven Monozyten wurde das Insulin isoliert und diabetischen Mäusen mit einem Blutzuckerspiegel von 300-600 mg/dL subkutan injiziert (n=8). Daraufhin sank der Blutzuckerspiegel um 51%±12% innerhalb einer Stunde. Auch Insulin-positive Monozyten, die diabetischen Mäusen subkutan injiziert wurden, waren in der Lage, den Blutzuckerspiegel bis zum Zeitpunkt Ihrer Abstoßung aktiv zu regulieren (n=4). In einem Pilotversuch wurde zudem gezeigt, dass transplantierte Insulin-positive Monozyten langfristig (> 100 Tage) den Blutzuckerspiegel einer diabetischen immuninkompetenten Maus regulieren. In dieser Arbeit wurde somit erfolgreich gezeigt, dass in vitro modifizierte Monozyten biologisch aktives Insulin enthalten. / The concept of cell replacement in diabetes mellitus type 1 is to transplant insulin-producing cells into the patient, where these cells should compensate for the lost function of patient's own destroyed beta cells. Insulin-producing beta cells developed from embryonic stem cells, but adult stem cells that are part of any tissue, may also have the potential to different into insulin-producing cells. Recent data indicates that circulating monocytes, known to have the capacity to differentiate into a variety of phagocytes, including macrophages and dendritic cells, are more multipotential than previously thought. They also have the potential to differentiate into a variety of cell types, including insulin-producing cells. In this study the function of monocyte-derived insulin-producing cells was characterised in vitro and in vivo. Blood monocytes are easily harvested from the peripheral blood by leucocyteapheresis. Monocytes of twelve healthy donors between 23 and 57 years of age were analysed in detail. For this purpose, monocytes were enriched by adherence and cultured in X-medium containing the cytokines M-CSF and IL-3 for six days and then in Y-medium containing HGF and EGF for four days. Insulin and c-peptide were detected by immunohistochemistry. Freshly isolated peripheral blood monocytes were negative for insulin and c-peptide. In contrast, freshly isolated peripheral blood monocytes cultured for ten days stained positive for insulin and c-peptide: 77±16 percent of the cells were positive for insulin and 49±30 percent for c-peptide. In addition, these cultured cells expressed the monocyte marker CD14. Different culture conditions were tested, but in the late phase of culture macrophages always dominated the population. Insulin of three million insulin-positive monocytes was isolated and injected subcutaneously into diabetic mice with a blood glucose level between 300-600 mg/dL (16.7-33.3 mmol/L) (n=8). Blood glucose levels were lowered by 51±12% within one hour. Even living insulin-positive monocytes subcutaneously transplanted into diabetic mice were able to regulate blood glucose levels into "normal" regions until their rejection (n=4). In a first attempt we could show that insulin positive monocytes transplanted into immunocompromised diabetic mice have the ability to regulate blood glucose levels permanently. In vitro modified peripheral blood monocytes appear to be a potential source of insulin-producing cells and an alternative cell source for stem cells. However, the induction of insulin biosynthesis in surrogate beta cells is not the only goal. These cells must secrete insulin in response to physiological signals, e.g. increased blood glucose levels. The biological activity of monocyte insulin was successfully proved in diabetic mice and the long-term results in immunocompromised diabetic mice underline the potential of transplanted in vitro modified monocytes to regulate blood glucose levels in a physiological way. However, further investigations are necessary to estimate the possible potential of in vitro modified monocytes for cell replacement strategies.

Aufgrund ihrer gut dokumentierten, umfangreichen gesundheitsfördernden biologischen Aktivitäten wird den Flavonoiden eine große Bedeutung zugeordnet. Die Ergebnisse von in vitro- und Tierstudien deuten zudem darauf hin, dass diese Verbindungen bei der Prävention und Therapie von Erkrankungen wie Krebs oder Alzheimer Krankheit (AD) positive Effekte zeigen. Zur besseren Charakterisierung der Interaktion von Flavonoiden mit Krebszellen wurden von uns die Cytotoxizität verschiedener Flavonoide auf T-Lymphoblastomzellen untersucht und Strukturelemente identifiziert, welche für einen Flavonoid-induzierten Zelltod relevant sind. Weitere Studien waren der potentiell neuroprotektiven Wirkung von Flavonoiden gewidmet. Die sowohl in neuronalen Zellkulturen als auch in transgenen Alzheimer-Mäusen (TgAPPsw) festgestellte Erhöhung der sAPPα Produktion und Reduktion von Aβ-Bildung wurden mit Aktivitäts- und Expressionssteigerung der α-Sekretase ADAM-10 assoziiert. Um herauszufinden, ob Flavonoide eine neuroprotektive Wirkung zeigen, wurden erste Vorbereitungen für ein Flavonoid-Screening mit einer sowohl hAPP alsauch ADAM-10 stabil transfizierten HT1080 Zellen getroffen. Dies beinhaltete die Suche nach einer potenten siRNA/shRNA und einem effektiven Flavonoid. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Experimente durchgeführt, um die Rolle von Heparansulfat (HS) bei der foamyviralen Anbindung an die Wirtszelle zu untersuchen. Foamyviren (FV) sind Spumaviren und gehören zur Familie der Retroviren. Bei unseren Studien wurde die Bindung von FV an Heparin, die Korrelation der Suszeptibilität verschiedener Zellen mit zellulärem HS und die Reduktion der Infektion durch lösliches Heparin sowie durch enzymatischen HS-Abbau festgestellt. / Flavonoids have well-documented, beneficial biological effects. Furthermore different in vitro- and animal-experiments indicate that these compounds demonstrate positive effects in prevention and therapy of diseases, like cancer or neurodegenerative diseases. In order to characterize the interactionsbetween flavonoids and cancer cells, we examined the cytotoxicity of different flavonoids on a human leukemia cell line and identified structure elements that could be associated to flavonoid-induced cell death. Our further studies were dedicated to the potentially neuroprotective activity of flavonoids. It has been described that in neuronal cells as well as in transgenic AD mice EGCG increases levels of sAPPα- and reduces Aβ-production. This influence of EGCG was associated with enhanced activity and expression of the α-secretase, ADAM-10. To find out, if flavonoids showed neuroprotective activity, preliminary work for a later flavonoid screening on hAPP and ADAM-10 wit stably-transfected HT1080 cells was done. This includes the determination of flavonoid candidates and research of effective siRNAs towards ADAM-10. Furtherrmore we investigated the role of heparansulfat (HS) in attachment of FV to host cell. Foamyviruses (FV) are retroviruses and belong to the subfamily of spumaretroviruses. In our studies we discovered the binding of FV on heparin, the correlation between susceptibility of different cells and cellular HS and the reduction of infectivity through soluble heparin and through enzymatic HS-degradation.