Das Ziel dieser Studie war es, die Pathomechanismen der Enzepahlopathie, welche während einer akuten Nierenschädigung beobachtet werden kann, zu untersuchen. Wir konzipierten ein Zellkulturmodell, welches aus der cerebralen Endothelzelllinie cEND und der Nierentubuluszelllinie HK-2 bestant. Die Nierenzellen wurden einem Sauerstoff-Glukose-Entzug zugeführt, um eine akute Nierenschädigung zu simulieren. Nach weiterer Behandlung mit zwei urmämischen Toxinen (Indoxylsulfate und Indolessigsäure) und gemeinsamer Inkubation beider Zelllinien für insgesamt 48 Stunden wurden die cEND-Zellen geerntet und die Expression von Tight junction-Proteinen und Glukosetransportern untersucht. / The aim of this study was to examine the pathogenesis of the encephalopathy that is observed during acute kidney injury. We created a cell culture model consisting of a cerebral endothelial cell line (cEND) and a kidney cell line (HK-2). The kidney cells were damaged by an oxygen-glucose deprivation (OGD) to simulate an acute kidney injury. After treatment with two uremic toxins (indoxyl sulfate and indolic acetic acid) and joint incubation of both cell lines for 48 hours the cEND cells were harvested and the expression of tight junction proteins and glucose transporters was investigated.

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide. The blood-brain barrier (BBB) plays an important role in maintaining brain homeostasis by tightly regulating the exchange of substances between circulating blood and brain parenchyma. BBB disruption is a common pathologic feature of stroke and traumatic brain injury. Understanding the cellular and molecular events that affect the BBB after ischaemic brain injury is important to improve patient prognosis. We have previously shown that microRNA-212/132 is elevated in hypoxic brain microvascular endothelial cells and acts through suppressing the expression of direct microRNA-212/132 target genes with function at the BBB: claudin-1, junctional adhesion molecule 3 (Jam3) and tight-junction associated protein 1 (Tjap1). While the role of claudin-1 and Jam3 at the BBB is well known, the role of Tjap1 is still unclear. The aim of this work was therefore to characterize the role of Tjap1 in brain endothelial cells using a knock-down (KD) approach in established murine in vitro BBB models cEND and cerebEND. Tjap1 KD was established by stable transfection of a plasmid expressing shRNA against Tjap1. The successful downregulation of Tjap1 mRNA and protein was demonstrated by qPCR and Western blot. Tjap1 KD resulted in impaired barrier properties of endothelial cells as shown by lower TEER values and higher paracellular permeability. Interestingly, the Tjap1 KD cells showed lower cell viability and proliferation but migrated faster in a wound healing assay. In the tube formation assay, Tjap1 KD cell lines showed a lower angiogenic potential due to a significantly lower tube length and number as well as a lower amount of branching points in formed capillaries. Tjap1 KD cells showed changes in gene and protein expression. The TJ proteins claudin-5, Jam3 and ZO-1 were significantly increased in Tjap1 KD cell lines, while occludin was strongly decreased. In addition, efflux pump P-glycoprotein was downregulated in Tjap1 KD cells. Oxygen-glucose deprivation (OGD) is a method to mimic stroke in vitro. Brain endothelial cell lines treated with OGD showed lower barrier properties compared to cells cultured under normal condition. These effects were more severe in Tjap1 KD cells, indicating active Tjap1 involvement in the OGD response in brain microvascular endothelial cells. We thus have shown that Tjap1 contributes to a tight barrier of the BBB, regulates cell viability and proliferation of endothelial cells, suppresses their migration and promotes new vessel formation. This means that Tjap1 function is important for mature BBB structure in health and disease. / Schlaganfall ist weltweit eine der häufigsten Ursachen für Mortalität und Behinderung. Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gehirnhomöostase, indem sie den Stoffaustausch zwischen dem zirkulierenden Blut und dem Gehirnparenchym streng reguliert. Eine Störung der BHS ist ein gemeinsames pathologisches Merkmal von Schlaganfällen und traumatischen Hirnverletzungen. Um die Prognose der Patientinnen und Patienten zu verbessern, ist es wichtig, die zellulären und molekularen Ereignisse zu verstehen, die sich nach einer ischämischen Hirnverletzung auf die BHS auswirken. Wir haben zuvor gezeigt, dass microRNA-212/132 in hypoxischen mikrovaskulären Endothelzellen erhöht ist und durch die Unterdrückung der Expression direkter Zielgene mit Funktion and der BHS wirkt. Zu den Zielgenen von microRNA-212/132 gehören: Claudin-1, Junctional Adhesion Molecule 3 (Jam3) und Tight Junction Associated Protein 1 (Tjap1). Während die Rolle von Caludin-1 und Jam3 and der BHS gut bekannt ist, ist die Rolle von Tjap1 noch unklar. Ziel dieser Arbeit war es daher, die Rolle von Tjap1 in Endothelzellen mithilfe eines Knock-down (KD)-Ansatzes in etablierten murinen In-vitro-BHS-Modellen zu charakterisieren. Tjap1-KD wurde durch stabile Transfektion eines Plasmids etabliert, das shRNA gegen Tjap1 exprimiert. Die erfolgreiche Herunterregulierung von Tjap1-mRNA und -Protein wurde durch qPCR und Western Blot nachgewiesen. Tjap1-KD führte zu einer Beeinträchtigung der Barriereeigenschaften von Endothelzellen, was sich in niedrigeren TEER-Werten und einer höheren parazellulären Permeabilität wiederspiegelte. Interessanterweise zeigten die Tjap1-KD-Zellen in einem Wundheilungstest eine geringere Zelllebensfähigkeit und Proliferation, wanderten jedoch schneller. Im tube formation assay zeigten Tjap1-KD-Zelllinien ein geringeres Angiogenese-Potential durch eine signifikant geringere Anzahl der gebildeten Kapillaren. Tjap-1-KD-Zellen zeigten Veränderungen in der Gen- und Proteinexpression. Die TJ-Proteinen Claudin-5, Jam3 und ZO-1 waren in Tjap1-KD-Zelllinien signifikant erhöht, während Occludin stark verringert war. Darüber hinaus wurde P-Glykoprotein in Tjap1-KD-Zellen herunterreguliert. Sauerstoff-Glukose-Entzug (eng. oxygen/glucose-deprivation, OGD) ist eine Methode zur Nachahmung eines Schlaganfall in vitro. Mit OGD behandelte Endothelzelllinien zeigten im Vergleich zu unter normalen Bedingungen kultivierten Zellen geringere Barriereeigenschaften. Diese Effekte waren in Tjap1-KD-Zellen schwerwiegender, was auf eine aktive Beteiligung von Tjap1 an der OGD-Antwort in Endothelzellen hinweist. Wir haben gezeigt, dass Tjap1 zu einer dichten Barriere der BHS beiträgt, die Zellviabilität und die Proliferation von Endothelzellen reguliert, deren Migration unterdrückt und die Bildung neuer Gefäße fördert. Dies bedeutet, dass die Tjap1-Funktion für die reife BHS-Struktur unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen wichtig ist.

Multiple Sklerose ist eine chronisch degenerative Erkrankung des ZNS, deren Therapie-möglichkeiten noch immer begrenzt sind. In der vorliegenden Arbeit wurde in vitro der selektive PDE-IV-Inhibitor Mesopram untersucht, welcher bereits in einer Phase II Studie bei Patienten mit klinisch gesicherter MS zum Einsatz kommt. Anhand von HBMEC’s, die als ein Model der menschlichen BHS gelten, konnten TJ’s (ZO-1, Claudin-3, Occludin), Adhäsionsmoleküle (ICAM, VCAM, MCAM), Zytokine und Chemokine (AR, Il-6, MCP-1, Il-8) und MMP-2 nachgewiesen werden. Diese Faktoren sind bei der Zerstörung der BHS in der Pathologie der MS beteiligt. Die Idee dieser Arbeit war es, durch die spezifische PDE-IV-Inhibition mit Mesopram die untersuchten Faktoren der BHS so zu beeinflussen, dass eine weitere Permeabilitätserhöhung verhindert werden könnte. Da es sich bei MS um eine inflammatorische Erkrankung handelt und TNFα in MS-Läsionen gefunden wird, wurde in dieser Arbeit TNFα als inflammatorischer Stimulus verwendet. Unter TNFα-Stimulation wurden die meisten der genannten Faktoren vermehrt exprimiert. Keine Veränderung unter TNFα zeigten Occludin, ZO-1, VCAM und MMP-2. Die HBMEC’s wurden über 24 und 48 h mit TNFα und Mesopram stimuliert. Es konnte in den unterschiedlichen Auswertungen (ELISA, FACS, Western Blot, Zymographie) keine regulatorische Modulation der verschiedenen Faktoren unter Mesopram-induzierter cAMP-Erhöhung nachgewiesen werden. / Multiple Sklerose ist eine chronisch degenerative Erkrankung des ZNS, deren Therapie-möglichkeiten noch immer begrenzt sind. In der vorliegenden Arbeit wurde in vitro der selektive PDE-IV-Inhibitor Mesopram untersucht, welcher bereits in einer Phase II Studie bei Patienten mit klinisch gesicherter MS zum Einsatz kommt. Anhand von HBMEC’s, die als ein Model der menschlichen BHS gelten, konnten TJ’s (ZO-1, Claudin-3, Occludin), Adhäsionsmoleküle (ICAM, VCAM, MCAM), Zytokine und Chemokine (AR, Il-6, MCP-1, Il-8) und MMP-2 nachgewiesen werden. Diese Faktoren sind bei der Zerstörung der BHS in der Pathologie der MS beteiligt. Die Idee dieser Arbeit war es, durch die spezifische PDE-IV-Inhibition mit Mesopram die untersuchten Faktoren der BHS so zu beeinflussen, dass eine weitere Permeabilitätserhöhung verhindert werden könnte. Da es sich bei MS um eine inflammatorische Erkrankung handelt und TNFα in MS-Läsionen gefunden wird, wurde in dieser Arbeit TNFα als inflammatorischer Stimulus verwendet. Unter TNFα-Stimulation wurden die meisten der genannten Faktoren vermehrt exprimiert. Keine Veränderung unter TNFα zeigten Occludin, ZO-1, VCAM und MMP-2. Die HBMEC’s wurden über 24 und 48 h mit TNFα und Mesopram stimuliert. Es konnte in den unterschiedlichen Auswertungen (ELISA, FACS, Western Blot, Zymographie) keine regulatorische Modulation der verschiedenen Faktoren unter Mesopram-induzierter cAMP-Erhöhung nachgewiesen werden.

Neben dem bekannten Tropismus des Masernvirus für CD150-positive aktivierte Zellen des Immunsystems, spielt der Endothelzelltropismus für die akute Masernviruserkrankung einschließlich ihren nachfolgenden Komplikationen eine wichtige pathogene Rolle. Die Infektion der Endothelzellen steht in Zusammenhang mit dem Auftreten des MV-Exanthems. Es ist auch möglich, dass die „Akute Enzephalitits“ und der Viruseintritt ins zentrale Nervensystem wie im Falle der subakuten sklerosierenden Panenzephalitis (SSPE) durch Endothelzellinfektion vermittelt wird. Ziel der Arbeit war herauszufinden, wie und ob das MV Endothelzellbarrieren überwinden kann mittels Transport infizierter Leukozyten oder durch Infektion von EZs mit basolateraler Virusfreisetzung. Es wurde untersucht, ob die Fähigkeit von primären humanen T- Zellen durch polarisierte Zellschichten von „human brain microvascular endothelial cells“ (HBMECs) zu wandern durch die Infektion beeinflusst wird. Die Fähigkeit von infizierten Lymphozyten durch die Poren der Filter zu wandern war teilweise beeinträchtigt, jedoch war das Ergebnis statistisch nicht signifikant. Im Gegensatz dazu war die Fähigkeit der Zellen durch Endothelzellbarrieren zu wandern drastisch reduziert. Nach Infektion adhärierten die Leukozyten stärker auf den Endothelzellen. Bei dieser Adhäsion von PBMCs an Endothelzellen kam es trotz Infektion zur Ausbildung von sogenannten „transmigratory cups“ oder docking- Strukturen. Dieser enge Zell-Zell-Kontakt hatte zur Folge, dass die MV-Infektion vom Lymphozyten auf die Endothelzelle übertragen wurde. Die MV-Hüllproteine wurden auf der apikalen und basolateralen Seite infizierter Endothelzellen exprimiert wie anhand von Aufnahmen mit dem konfokalen Mikroskop am Beispiel des H-Proteins gezeigt werden konnte. Titrationen ergaben, dass das Virus auf beiden Seiten der Zellen freigesetzt wurde. Desweiteren wurde bestätigt, dass auch für polarisierte Endothelzellen die auf Tyrosin basierenden Transportsignale verantwortlich sind für die basolaterale Virusfreisetzung. Die Daten unterstützen die Hypothese, dass das Virus mit Hilfe der Infektion und der bipolaren Virusfreisetzung über Endothelzellbarrieren / In addition to the known tropism of measles virus (MV) for CD150-positive activated cells of the immune system, its endothelial cell tropism plays an important pathogenic role during acute measles and the following complications. The infection of endothelial cells is associated with the rash. It is also possible that endothelial infection mediates the acute encephalitis and viral entry in the central nervous system in cases of subacute sclerosing panencephalitis (SSPE). The aim of this investigation was to find out, how and if at all MV is able to overcome endothelial barriers via transport of infected leukocytes or infection of endothelial cells with basolateral virus release. We analysed if the capacity of primary human T cells to transmigrate through “human brain microvascular endothelial cells” (HBMECs) is influenced by the infection. The capacity of infected lymphocytes to migrated through filter pores was partially reduced but the results were statistacally not significant. In contrast the capacity to migrate through endothelial barriers was drastically reduced. The attachment of PBMCs to the endothelial monolayer was increased once the cells were infected. During this attachment normal so called “transmigratory cups” or docking-structures were formed, although the leukocytes were infected. As a consequence of this close cell-cell-contact the MV-infection was transferred to the endothelial cells. The MV envelope proteins were expressed on the apical and basolateral side as could be shown on pictures taken with the confocal microscope. Titrations showed that the virus was released on both sides of the cells. Moreover it could be demonstrated, that tyrosine-based sorting signals were responsible for basolateral virus release from polarized endothelial cells. These data support the hypothesis, that the virus can cross endothelial barriers by infection of the endothelium and by bipolar virus release.

Die Blut-Hirn-Schranke wird hauptsächlich vom Endothel der Hirngefäße gebildet und stellt die wichtigste Barriere zwischen Blutkompartiment und Hirnparenchym dar. Hauptverantwortlich für die Barrierefunktion der Gehirnkapillaren sind die Tight Junctions, die den Interzellularspalt des Endothels verschließen und dadurch die parazelluläre Permeabilität hydrophiler Moleküle und Ionen regulieren und einen hohen elektrischen Widerstand aufbauen. Das 65 kDa Transmembranprotein Occludin ist ein zentrales Element der Tight Junctions: Eine Induktion von Occludin führt zur Erhöhung der Barriereeigenschaften, während eine Erniedrigung des Occludin-Gehaltes zu einer verstärkten Kapillardurchlässigkeit und potenziell zu einer Schädigung des Hirngewebes führt. Im klinischen Alltag werden bereits seit vierzig Jahren Kortikosteroide bei Erkrankungen mit geschädigter Blut-Hirn-Schranke erfolgreich eingesetzt. Auch experimentell konnte im hiesigen Labor durch die Arbeitsgruppe von Prof. Förster eine Transaktivierung von Occludin durch Glukokortikoide wie Dexamethason nachgewiesen werden. Die zugrunde liegenden regulatorischen Mechanismen der Occludintransaktivierung blieben weitgehend unbekannt, insbesondere die Frage, ob die Geninduktion über direkte Zielgentransaktivierung oder über eine Protein-Protein-Interaktion mit anderen Transkriptionsfaktoren erfolgt. Das Vorhandensein putativer Glukokortikoid-responsiver Elemente innerhalb des Occludin-Promoters war ebenso noch nicht bekannt. In dieser Arbeit konnte dargestellt werden, dass für die erhöhte Occludin-Expression in Endothelzellen von Hirngefäßen durch Glukokortikoide ein funktioneller Glukokortikoid-Rezeptor als Homodimer nötig war. In den Experimenten wurden die jeweiligen Transaktivierungsniveaus des Occludin-Promoters durch einen Luciferase-Promoter-Reporter-Assay verglichen. Es wurden zum einen der Wildtyp-Glukokortikoidrezeptor, zum anderen ein mutagenisierter Rezeptor eingesetzt, dem die entscheidende Dimerisierungseigenschaft fehlt. Ohne die Ausbildung eines Rezeptor-Homodimers kann die Bindung an die Promoter-DNA nicht erfolgen. Im Vergleich zeigte sich, dass nur der Wildtyp-Glukokortikoidrezeptor zu einer erhöhten Genexpression führte, der mutagenisierte Rezeptor zeigte keine Induktion. Zudem konnte im Rahmen dieser Arbeit eine Bindungsstelle des Glukokortikoidrezeptors auf dem Occludin-Promoter identifiziert werden. Die Identifizierung des Glukokortikoid-responsiven Elements erfolgte durch Untersuchung der Glukokortikoid-Responsivität verschiedener Abschnitte des Occludin-Promoters. Auf zwei dieser Abschnitte fanden sich Gensequenzen, die der etablierten kanonischen Konsensussequenz und verschiedenen in der Literatur beschriebenen degenerierten Elementen entsprachen. Im Promoter-Reporter-Assay zeigte sich nur im distalen Promoterabschnitt eine erhöhte Occludin-Expression nach Glukokortikoid-Gabe. Dieses distale Element aus zwei Halbelementen (5’-ACATGTnnnnACAAAT-3’) wurde durch Immunopräzipitationsassays weiter eingegrenzt. Eine Mutagenisierung der Basenabfolge mit anschließend ausbleibender Transaktivierung und Immunopräzipitation bestätigte die Funktionalität des Glukokortikoid-responsiven Elements. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit erstmals die direkte dimerisierungsabhängige Glukokortikoidrezeptor-vermittelte Induktion von Occludin nachgewiesen und ein neues degeneriertes Glukokortikoid-responsives Element identifiziert werden, das für die Transaktivierung des Occludingens essentiell ist. / The blood-brain-barrier mainly consists of endothelial cells and is the most important barrier between blood vessels and brain parenchyme. Occludin represents an important part of the tight junctions, which seal and protect the blood brain barrier against paracellular diffusion of solutes to the brain parenchyme and are therefore responsible for the high resistance and low permeability between cerebral capillary endothelial cells. Induction of occludin leads to increased barrier properties while a decreased occludin-level results in elevated permeability and potential impairment of the brain tissue. In former studies the positive influence of glucocorticoids on the barrier properties because of an induction of the occludin gene could be shown. This doctorial thesis showed that for an elevated occludin expression level in cerebral endothelial cells a functional glucocorticoid receptor as a homodimer is needed. This was proved comparing the transactivation levels of a wild-type glucocorticoid receptor and a mutagenised receptor lacking the ability of dimerization employing the Luciferase-Promoter-Reporter-Assay. Binding to the promoter-DNA is not possible without the formation of the receptor homodimer. Increased transactivation could only be seen using the wild-type receptor, the mutagenised receptor did not show any induction. In addition this thesis identified a glucocorticoid-receptor binding-site in the occludin promoter. This was performed analyzing the responsivity of different parts of the occludin promoter to glucocorticoid treatment. Two sequences could be found which were similar to the canonical consensus sequence and other established degenerated glucocorticoid response elements. Using the promoter-reporter-assay an elevated occludin expression could be detected after glucocorticoid treatment within the distal segment of the promoter. This distal element consisting of two half sites (5’-ACATGTnnnnACAAAT-3’) was confirmed using immunoprecipitation assays. After site directed mutagenesis of the putative glucocorticoid response element Luciferase promoter reporter assay and chromatin immunoprecipitation assays revealed that disruption of the candidate binding site abolished glucocorticoid-induced reporter gene expression and binding of the glucocorticoid receptor in response to dexamethasone treatment. The fact that glucocorticoid stimulation did not affect gene expression in the mutant vector verified that the glucocorticoid response element is functional and that hormone binding is not possible after alteration of the sequence.

Listeria monocytogenes überwindet endotheliale Barrieren, um eine Meningitis oder Encephalitis auszulösen. Das Hindurchtreten durch diese Barriere könnte über die Invasion von Endothelzellen durch Listerien aus dem Blut und anschließender Freisetzung der Bakterien ins Gehirn erfolgen. In den ersten Infektionsmodellen, in denen gezeigt wurde, daß Listerien in der Lage sind Endothelzellen zu invadieren, wurden humane, makrovaskuläre Nabelschnurendothelzellen (HUVEC) verwendet. Die für die Ausbildung der Blut-Hirn-Schranke verantwortlichen mikrovaskulären Hirnendothelzellen (BMEC) unterscheiden sich aber deutlich von den makrovaskulären HUVEC. In der vorliegenden Arbeit wurde die Interaktion von L. monocytogenes mit HUVEC und mit humanen BMEC (HBMEC) untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß L. monocytogenes HBMEC effizient invadieren kann. Nach der Aufnahme und dem Entkommen der Bakterien aus dem Phagosom bilden sie Aktinschweife aus, mit deren Hilfe sie sich im Zytoplasma frei bewegen können. Listerien sind in der Lage, sich in HBMEC über einen Zeitraum von 20 Stunden zu vermehren und über eine Ausbreitung von Zelle zu Zelle in benachbarte Zellen zu gelangen. Mit einem Listerien-Stamm, der das grün-fluoreszierende Protein (GFP) exprimiert, konnte der Infektionsverlauf in HBMEC über einen Zeitraum von 20 Stunden in Echtzeit verfolgt werden. Hierbei zeigte sich, daß auch stark infizierte HBMEC sich nicht vom Untergrund ablösen oder lysieren und somit gegenüber intrazellulären Listerien sehr widerstandsfähig sind. Wie rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von HBMEC-Monolayern nach einer Infektion mit L. monocytogenes erkennen ließen, adhärieren Listerien an HBMEC, indem sie einen engen Kontakt mit Mikrovilli auf HBMEC eingehen. Mit Listerien infizierte HBMEC bilden wenige Stunden nach der Infektion Membranausstülpungen aus, in denen sich Listerien befinden. Diese Ausstülpungen sind mit der Zelle nur noch über sehr dünne Membranschläuche verbunden. Um herauszufinden, welche Listerienproteine an der Aufnahme von L. monocytogenes in HUVEC und HBMEC beteiligt sind, wurden verschiedene Deletionsmutanten auf ihre Invasivität in HUVEC und HBMEC getestet. In Gegenwart von 20 Prozent Humanserum wurden HUVEC in einer von den Oberflächenproteinen InlA, InlB und ActA unabhängigen Weise von L. monocytogenes invadiert. Wurde das Gen, welches für den positiven Regulationsfaktor PrfA kodiert, deletiert, reduzierte dies die Invasionsrate beträchtlich. Listerienstämme mit einer Deletion im für InlB kodierenden Gen sind unfähig, HBMEC zu invadieren. Neben InlG und ActA spielt auch PrfA eine entscheidende Rolle bei der Invasion von L. monocytogenes in HBMEC. Die Adhäsion von L. monocytogenes an HBMEC ist von InlB unabhängig. Auch die apathogene und nicht-invasive Art L. innocua bindet an HBMEC. Humanserum hemmt die Invasion von L. monocytogenes in HBMEC, nicht aber in HUVEC. Während sich die Invasionsraten von L. monocytogenes in HUVEC durch Zentrifugation bei der Infektion erhöhen ließen, hatte die Zentrifugation keine Auswirkung auf die Invasivität von L. monocytogenes in HBMEC. Neben diesen konnten in dieser Arbeit noch weitere Infektionsparameter gefunden werden, die unterschiedliche Auswirkungen auf die Invasion von L. monocytogenes in HUVEC und HBMEC haben. Im Zellüberstand von HUVEC konnten bis zu 6 Stunden nach einer Infektion mit L. monocytogenes große Mengen an IL-8 nachgewiesen werden. Während eine Infektion von HUVEC mit L. monocytogenes die Expression von IL-6-spezifischer mRNA schwach induzierte, war keine vermehrte Expression von MCP-1- und VCAM-1-spezifischer mRNA feststellbar. Indem Caco-2-Zellen und HBMEC auf gegenüberliegenden Seiten eines Filters bis zur Konfluenz kultiviert wurden, konnte ein in-vitro-Modell des choroid plexus etabliert werden. Wenige Stunden nach der Infektion von HBMEC mit L. monocytogenes befanden sich auch in den Caco-2-Zellen Listerien. Wie elektronenmikroskopisch nachgewiesen werden konnte, waren diese Listerien durch die Filterporen in die Epithelzellen gelangt. Der Mechanismus, dem diese Ausbreitung zugrunde liegt, ist noch unbekannt. / Listeria monocytogenes cross endothelial barriers to cause meningitis or encephalitis. Passage through the barrier may be achieved by invasion of endothelial cells by Listeria from the blood stream followed by release of the bacteria into the brain. Internalization of L. monocytogenes by endothelial cells has been previously demonstrated using macrovascular human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) as a model system. However, brain microvascular endothelial cells (BMEC) which form the blood brain barrier, are strikingly different from the macrovascular HUVEC. Therefore, in this investigation, the interaction of L. monocytogenes with HUVEC and human BMEC (HBMEC) was studied. It was found that L. monocytogenes efficiently invades HBMEC. After invasion and escape from the phagosome the bacteria induce the formation of actin tails which allows them to move intracellularly. Once within the HBMEC, L. monocytogenes are able to multiply over a period of at least 20 hours and enter neighbouring cells by cell-to-cell spread. Using a green fluorescent protein-expressing L. monocytogenes strain, this process of infection was followed in real time. It was shown that heavily infected HBMEC do not detach from the tissue culture dish and do not lyse, indicating that they are highly resistant to intracellular L. monocytogenes. Scanning electron microscopy studies of infected HBMEC-monolayers showed adherent Listeria in close contact with surface microvilli. Listeria-infected HBMEC shows bacteria-containing membrane protrusions within a few hours after infection. These protrusions are connected with the cell suface via thin stalk-shaped membrane connections. To determine which listerial proteins are responsible for the uptake of L. monocytogenes in HUVEC and HBMEC, different deletion mutants of L. monocytogenes were tested with respect to their effect on the efficiency of invasion. It was found that L. monocytogenes invades HUVEC in the presence of 20 per cent human serum independently of InlA, InlB, and ActA. However, deletion of the gene encoding the positive virulence regulatory factor PrfA results in a strong inhibition of invasion. Listeria-strains with a deletion in the InlB encoding gene are unable to invade HBMEC. Moreover, InlG, ActA, and also PrfA play important roles in invasion of HBMEC by L. monocytogenes. Adherence of L monocytogenes to HBMEC is independent of InlB. Even the nonpathogenic and noninvasive species L. innocua adheres to HBMEC. Human serum was shown to inhibit the uptake of L. monocytogenes by HBMEC but not by HUVEC. Centrifugation of Listeria onto the cells enhanced the invasion of HUVEC, but had no effect on invasion of HBMEC. In addition to these differences, other parameters were identified which have different effects on the invasiveness of L. monocytogenes for HUVEC and HBMEC. High amounts of IL-8 could be detected in the supernatants of Listeria-infected HUVEC within 6 hours. Additionally, a weak induction of IL-6 specific mRNA could be detected during infection of HUVEC, but mRNA-expression specific for MCP-1 and VCAM-1 was not altered. Using HBMEC and Caco-2 cells, an in-vitro-model of the choroid plexus was developed by growing each cell type on either side of porous membrane filters. A few hours after infection of HBMEC with L. monocytogenes, bacteria were found in the underlying Caco-2 cells. In transmission electron microscopic studies it could be shown that Listeria reached the epithelial cells via the filter pores. The mechanism for this spreading is so far unknown.

In einem experimentellen Schädel-Hirn-Trauma-Modell der fokalen Kälteläsion bei der Maus wurde die Effektivität der B1R-Blockade untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchung dokumentierten auf der Suche nach einer grundlegenden spezifischen Therapie des vasogenen traumatischen Hirnödems die B1R-Blockade als einen potentiellen Ansatz zu Reduktion der sekundären Hirn-schäden. Zum Einen konnte durch die selektive Blockade von B1R mit dem Präparat R-715 nach einer fokalen Kälteläsion im Mausmodell die Hirnschädigung um etwa 75 % gegenüber den Tieren der Kontrollgruppen reduziert werden. Zum Anderen lässt sich nach der B1R-Blockade u. a. eine signifikante Abschwächung des vasogenen Hirnödems um etwa 50 % im Vergleich zu den Tieren der Kontrollgruppen feststellen. Die Reduktion der sekundären Hirnschädigung durch die B1R-Blockade 24 Stunden nach der Läsionsinduktion macht die selektive B1R-Blockade als kausaler Therapie-ansatz eine interessante Behandlungsoption des posttraumatischen vasogenen Hirnödems. / B1R knockout mice showed less neuronal damage and developed significantly smaller brain lesions compared to wild-type controls (2.5±2.6 mm3 vs 11.5±3.9 mm3, mean±SD respectively; n=7; p=0.0008). Pharmacological blockade of B1R with the selective antagonist R-175 likewise salvaged lesioned tissue (2.6±1.4 mm3 vs 12.2±6.1 mm3, mean±SD respectively; n=7; p=0.0034), reduced vasogenic edema and gene expression of vasoactive and proinflammatory cytokines in the lesioned cortex. In contrast, B2R inhibition with Hoe-140 was less effective (p=0.0667). Inhibition of B1R attenuates brain damage in mice and may open new avenues for the management of clinical head injuries.

Neisseria meningitidis ist mit jahrlich etwa 700.000 Erkrankungsfallen weltweit und einer Mortalitat von circa 7% einer der häufigsten Ausloser der bakteriellen Hirnhautentzündung. Der entscheidende Schritt zur Auslosung einer Meningitis ist die Uberwindung der Blut-Hirn-Schranke. Diese im menschlichen Korper einmalig dichte Barriere wird maßgeblich durch Tight-Junctions spezialisierter Endothelzellen der Hirnkapillaren aufrecht erhalten. Ob N. Meningitidis diese Barriere auf einem parazellulären oder transzellulärem Weg uberwindet, ist nicht vollstandig geklart. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von N. meningitidis auf die Tight-Junction Proteine Occludin und ZO-1 unter Nutzung des HBMEC Zellkulurmodelles untersucht. Neben einer verminderten Genexpression von Occludin zeigte sich dabei eine Abspaltung eines 50 kDa Fragmentes von Occludin. Gleichzeitig konnte eine Umverteilung von Occludin von den Zellgrenzen in das Zytoplasma beobachtet werden. ZO-1 hingegen wurde weder in seiner Exprimierung, noch in seiner intrazellularen Verteilung beeinflusst. Mittels eines in dieser Arbeit etablierten Assays zur Bestimmung der Permeabilitat eines HBMEC-Monolayer als vereinfachtes in-vitro Modell der Blut-Hirn-Schranke konnte bestatigt werden, dass durch die Beeinflussung von Tight-Junction Proteinen die parazellulare Permeabilitat steigt. In weiteren Analysen konnten diese Prozesse auf eine gesteigerte Aktivitat von Matrixmetalloproteinase 8 zurückgefuhrt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen einen neuen Mechanismus auf, durch den N. meningitidis im Stande ist, die-Hinr-Schranke auf einem parazellulärem Weg zu überwinden. / Neisseria meningitidis is a leading cause of bacterial meningitis with about 700.000 cases per year and a mortality of approximately 7%. A crucial step in the pathogenesis of meningococcal meningitis is the crossing of the blood-brain barrier (BBB). This barrier mainly consists of tight junctions of the microvascular endothelial cells. It remains unclear whether N. meningitidis passes the BBB by a paracellular or transcellular route. In this work the influence of N. meningitidis on the tight junction proteins occludin and ZO-1 was investigated by using the HBMEC cell-culture model. Using QRT-PCR a reduced expression of occludin was seen, western-blot analyses showed a cleavage of occludin into a fragment of 50 kDA. Immonulourescence further showed a complete dissociation of occludin from the cell membrane, whereas ZO-1 was not influenced. By establishing a permeability-assay an increased permeability of the HBMEC monolayer after infection with N. meningitidis was demonstrated. Further work showed, that these effects are dependent of an increased activity of matrix metalloproteinase-8. These results reveal a new mechanism that could enable N. meningitidis to cross the BBB by a paracellular route.

Thrombus formation at sites of vascular lesions is a dynamic process that requires a defined series of molecular events including the action of platelet adhesion/activation receptors, intracellular signal transduction, cytoskeletal rearrangements and activation of plasma coagulation factors. This process is essential to limit post-traumatic blood loss but may also contribute to acute thrombotic diseases such as myocardial infarction and stroke. With the help of genetically modified mice and the use of specific protein inhibitors and receptordepleting antibodies, the work presented in this thesis identified novel mechanisms underlying thrombus formation in hemostasis and thrombosis. In the first part of the study, it was shown that von Willebrand Factor (vWF) binding to glycoprotein (GP)Iba is critical for the formation of stable pathological thrombi at high shear rates, suggesting GPIba as an attractive pharmacological target for antithrombotic therapy. The subsequent analysis of recently generated phospholipase (PL)D1-deficient mice identified this enzyme, whose role in platelet function had been largely unknown, as a potential target protein downstream of GPIba. This was based on the finding that PLD1- deficient mice displayed severely defective GPIba-dependent thrombus stabilization under high shear conditions in vitro and in vivo without affecting normal hemostasis. The second part of the thesis characterizes the functional relevance of the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-bearing collagen receptor GPVI and the recently identified hemITAM-coupled C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) for in vivo thrombus formation. Genetic- and antibody-induced GPVI deficiency was found to similarly protect mice from arterial vessel occlusion in three different thrombosis models. These results confirmed GPVI as a promising antithrombotic target and revealed that antibody-treatment had no obvious off-target effects on platelet function. Similarly, immunodepletion of CLEC-2 by treating mice with the specific antibody INU1 resulted in markedly impaired thrombus growth and stabilization under flow in vitro and in vivo. Furthermore, it could be demonstrated that double-immunodepletion of GPVI and CLEC-2 resulted in severely decreased arterial thrombus formation accompanied by dramatically prolonged bleeding times. These data revealed an unexpected redundant function of the two receptors for in vivo thrombus formation and might have important implications for the potential development of anti-GPVI and anti-CLEC-2 antithrombotic agents. The third part of the thesis provides the first functional analysis of megakaryocyte- and platelet-specific RhoA knockout mice. RhoA-deficient mice displayed a defined signaling defect in platelet activation, leading to a profound protection from arterial thrombosis andand ischemic brain infarction, but at the same time also strongly increased bleeding times. These findings identified the GTPase as an important player for thrombus formation in hemostasis and thrombosis. Based on the previous proposal that the coagulation factor (F)XII might represent an ideal target for safe antithrombotic therapy without causing bleeding side effects, the last part of this thesis assesses the antithrombotic potential of the newly generated FXIIa inhibitor rHAInfestin- 4. It was found that rHA-Infestin-4 injection into mice resulted in virtually abolished arterial thrombus formation but no change in bleeding times. Moreover, rHA-Infestin-4 was similarly efficient in a murine model of ischemic stroke, suggesting that the inhibitor might be a promising agent for effective and safe therapy of cardio- and cerebrovascular diseases. / Thrombusbildung an einer verletzten Gefäßstelle ist ein dynamischer Prozess, der ein definiertes Zusammenspiel von Thrombozytenadhäsions-/aktivierungsrezeptoren, intrazellulären Signalen, Zytoskelettumstrukturierungen sowie die Aktivierung von Plasma Koagulationsfaktoren benötigt. Dieser Prozess ist essenziell um Blutungen nach einer Gefäßverletzung zu stoppen, kann aber auch zu akuten thrombotischen Erkrankungen wie Herzinfarkt und Schlaganfall führen. Mit Hilfe von genetisch veränderten Mäusen und der Verwendung von spezifischen Proteininhibitoren und Rezeptor-depletierenden Antikörpern wurden in der hier vorliegenden Dissertation neue Mechanismen der Thrombusbildung in Hämostase und Thrombose identifiziert. In dem ersten Teil der Studie konnte gezeigt werden, dass die Interaktion zwischen von Willebrand Faktor (vWF) und Glykoprotein (GP)Iba entscheidend für die Bildung von pathologischen Thromben bei hohen Scherraten ist, was auf die Eignung von GPIba als eine attraktive pharmakologische Zielstruktur (Target) für eine antithrombotische Therapie hindeutet. Die anschließende Analyse von vor kurzem generierten Phospholipase (PL)D1- defizienten Mäusen identifizierte dieses Enzym, dessen Rolle in der Thrombozytenfunktion bislang unbekannt war, als eine mögliches Targetprotein im Signalweg von GPIba. Dies basierte vor allem auf der Erkenntnis, dass PLD1-defiziente Mäuse eine stark gestörte GPIba-abhängige Thrombusstabilisierung unter hohen Scherbedingungen aufwiesen, ohne jedoch dabei die normale Hämostase zu beeinflussen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die funktionelle Relevanz des immunoreceptor tyrosinebased activation motif (ITAM)-gekoppelten Kollagenrezeptors GPVI und des vor kurzem entdeckten hemITAM-gekoppelten C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) für die in vivo Thrombusbildung charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass genetisch- und durch Antikörperinduzierte GPVI-Defizienz Mäuse gleichermaßen vor arteriellem Gefäßverschluss in drei verschiedenen Thrombosemodellen schützt. Diese Ergebnisse bestätigten GPVI als ein viel versprechendes antithrombotisches Target und zeigten, dass eine Antikörperbehandlung in Mäusen keine offensichtlichen unspezifischen Effekte auf die Thrombozytenfunktion hatte. Eine gleichermaßen induzierte Immunodepletion von CLEC-2 durch die Behandlung von Mäusen mit dem spezifischen Antikörper INU1 führte zu deutlich vermindertem Thrombuswachstum und reduzierter Thrombusstabilisierung unter Flussbedingungen in vitro und in vivo. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass eine Doppel-Immunodepletion von GPVI und CLEC-2 zu einer stark reduzierten arteriellen Thrombusbildung führte, die mit dramatisch verlängerten Blutungszeiten einherging. Diese Ergebnisse machten eineunerwartete funktionelle Redundanz der beiden Rezeptoren deutlich und könnten möglicherweise einen wichtigen Einfluss auf eine eventuelle Entwicklung von anti-GPVI und anti-CLEC-2 antithrombotischen Wirkstoffen haben. Der dritte Teil der Arbeit liefert die erste funktionelle Analyse von Megakaryozyten- und Thrombozyten-spezifischen RhoA-Knockout Mäusen. RhoA-defiziente Mäuse zeigten einen definierten Signaldefekt in der Thrombozytenaktivierung, der zu einem deutlichen Schutz vor arterieller Thrombose und ischämischen Hirninfarkt aber gleichzeitig auch zu stark erhöhten Blutungszeiten führte. Dieses Ergebnis identifizierte die GTPase als einen wichtigen Spieler für die Thrombusbildung in Hämostase und Thrombose. Basierend auf dem vorausgegangenen Vorschlag, dass der Koagulationsfaktor XII (FXII) ein ideales Target für eine sichere antithrombotische Therapie darstellen könnte, ohne Blutungsnebenwirkungen zu verursachen, untersucht der letzte Teil der Arbeit das antithrombotische Potential des neu generierten FXIIa Inhibitors rHA-Infestin-4. Es konnte gezeigt werden, dass eine Injektion von rHA-Infestin-4 in Mäuse die arterielle Thrombusbildung nahezu aufhob aber Blutungszeiten nicht veränderte. Außerdem war rHAInfestin- 4 gleichermaßen effizient in einem Mausmodell des ischämischen Schlaganfalls, was darauf schließen lässt, dass der Inhibitor ein vielversprechender Wirkstoff für eine effektive und sichere Therapie von kardio- und zerebrovaskulären Erkrankungen sein können

Traditionally, ischemic stroke has been regarded as the mere consequence of cessation of cerebral blood flow, e.g. due to the thromboembolic occlusion of a major brain supplying vessel. However, the simple restoration of blood flow via thrombolysis and/or mechanical recanalization alone often does not guarantee a good functional outcome. It appears that secondary detrimental processes are triggered by hypoxia and reoxygenation, which are referred to as ischemia/reperfusion (I/R) injury. During recent years it became evident that, beside thrombosis inflammation and edema formation are key players in the pathophysiology of cerebral ischemia. The contact-kinin system represents an interface between thrombotic, inflammatory and edematous circuits. It connects the intrinsic coagulation pathway with the plasma kallikrein-kinin system (KKS) via coagulation factor FXII. The serine protease inhibitor C1-inhibitor (C1-INH) has a wide spectrum of inhibitory activities and counteracts activation of the contact-kinin system at multiple levels. The first part of the thesis aimed to multimodally interfere with infarct development by C1-INH and to analyze modes of actions of human plasma derived C1-INH Berinert® P in a murine model of focal cerebral ischemia. It was shown that C57BL/6 mice following early application of 15.0 units (U) C1-INH, but not 7.5 U developed reduced brain infarctions by ~60% and less neurological deficits in the model of transient occlusion of the middle cerebral artery (tMCAO). This protective effect was preserved at more advanced stages of infarction (day 7), without increasing the risk of intracerebral bleeding or affecting normal hemostasis. Less neurological deficits could also be observed with delayed C1-INH treatment, whereas no improvement was achieved in the model of permanent MCAO (pMCAO). Blood-brain-barrier (BBB) damage, inflammation and thrombosis were significantly improved following 15.0 U C1-INH application early after onset of ischemia. Based on its strong antiedematous, antiinflammatory and antithrombotic properties C1-INH constitutes a multifaceted therapeutic compound that protects from ischemic neurodegeneration in ‘clinically meaningful’ settings. The second part of the thesis addresses the still elusive functional role of macrophages in the early phase of stroke, especially the role of the macrophage-specific adhesion molecule sialoadhesin (Sn). For the first time, sialoadhesin null (Sn-/-) mice, homozygous deficient for Sn on macrophages were subjected to tMCAO to assess the clinical outcome. Neurological and motor function was significantly improved in Sn-/- mice on day 1 after ischemic stroke compared with wildtype (Sn+/+) animals. These clinical improvements were clearly detectable even on day 3 following tMCAO. Infarctions on day 1 were roughly the same size as in Sn+/+ mice and did not grow until day 3. No intracerebral bleeding could be detected at any time point of data acquisition. Twenty four hours after ischemia a strong induction of Sn was detectable in Sn+/+ mice, which was previously observed only on perivascular macrophages in the normal brain. Deletion of Sn on macrophages resulted in less disturbance of the BBB and a reduced number of CD11b+ (specific marker for macrophages/microglia) cells, which, however, was not associated with altered expression levels of inflammatory cytokines. To further analyze the function of macrophages following stroke this thesis took advantage of LysM-Cre+/-/IKK2-/- mice bearing a nuclear factor (NF)-ϰB activation defect in the myeloid lineage, including macrophages. Consequently, macrophages were not able to synthesize inflammatory cytokines under the control of NF-ϰB. Surprisingly, infarct sizes and neurological deficits upon tMCAO were roughly the same in conditional knockout mice and respective wildtype littermates. These findings provide evidence that macrophages do not contribute to tissue damage and neurological deficits, at least, not by release of inflammatory cytokines in the early phase of cerebral ischemia. In contrast, Sn which is initially expressed on perivascular macrophages and upregulated on macrophages/microglia within the parenchyma following stroke, influenced functional outcome. / Der ischämische Schlaganfall wird traditionell als unmittelbare und „einfache“ Folge der Unterbrechung des Blutflusses zum Gehirn z.B. durch thromboembolische Gefäßverschlüsse gesehen. Häufig führt die alleinige Wiederherstellung des Blutflusses durch Lysetherapie bzw. mechanische Rekanalisation jedoch nicht zu einer Funktionserholung. Dies rückt sekundäre pathophysiologische Prozesse in den Fokus, die durch die Hypoxie und anschließende Wiederversorgung mit Sauerstoff angestoßen werden und zu einem sogenannten Reperfusionsschaden führen. In den letzten Jahren wurde klar, dass neben der Thrombenbildung Entzündungsprozesse und Hirnschwellung zentrale Bestandteile der Pathophysiologie von ischämischen Schlaganfällen sind, die über ein komplexes Netzwerk von Signalwegen eng miteinander verknüpft sind. An dieser Schnittstelle setzt die vorliegende Dissertation an. Das Kontakt-Kinin-System verbindet das plasmatische Kallikrein-Kinin-System (KKS), welches entzündliche und ödematöse Prozesse anstößt, über den Blutgerinnungsfaktor FXII mit dem intrinsischen Blutgerinnungsweg, der letztlich für die Thrombenbildung verantwortlich ist. Der endogene Serinprotease-Inhibitor C1-Inhibitor (C1-INH) besitzt ein breites Wirkungsspektrum und wirkt der Aktivierung des Kontakt-Kinin-Systems auf verschiedenen Ebenen entgegen. Ziel des ersten Teils der vorliegenden Dissertation war es, mittels C1-INH auf multimodale Weise ins Infarktgeschehen einzugreifen und die Wirkmechanismen des humanen C1-INH Berinert® P im Mausmodell nach fokaler zerebraler Ischämie zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass die frühe Behandlung von C57BL/6 Mäusen mit 15.0 Units (U) C1-INH im Modell der transienten Okklusion der Arteria cerebri media (tMCAO) eine drastische Reduzierung der Infarktvolumina um annähernd 60%, sowie deutlich weniger neurologische und funktionelle Defizite zur Folge hatte. Diese Schutzwirkung war auch im fortgeschrittenen Stadium (Tag 7) der Schlaganfallentwicklung zu beobachten, ohne das Risiko einer intrazerebralen Blutung zu erhöhen oder die normale Hämostase zu beeinflussen. Die Applikation von 7.5 U C1-INH hatte dagegen keinen Effekt. Ein wesentlich verbessertes neurologisches Verhalten konnte auch nach verzögerter Injektion von 15.0 U C1-INH erzielt werden. Im Gegensatz dazu bewirkte die Behandlung im Modell der permanenten MCAO (pMCAO) keine Verbesserung. Mechanistisch führte die Gabe von 15.0 U C1-INH zu einer deutlichen Stabilisierung der Bluthirnschranke und weniger Ödembildung. Darüber hinaus war die lokale Entzündungsreaktion nach C1-INH-Applikation abgeschwächt und es bildeten sich weniger Thromben in der zerebralen Mikrozirkulation. Basierend auf seiner vielfältigen antithrombotischen, antientzündlichen und antiödematösen Potenz stellt C1-INH einen vielversprechenden Ansatz zum Schutz vor ischämischer Neurodegeneration nach Schlaganfall unter ‚klinisch relevanten‘ Bedingungen dar. Der zweite Teil der Dissertation beschäftigt sich mit der bislang ungeklärten funktionellen Rolle von Makrophagen in der Frühphase nach Schlaganfall, speziell der Rolle des Makrophagen-spezifischen Signalmoleküls Sialoadhesin (Sn). Hierzu wurden erstmals Sialoadhesin-defiziente (Sn-/-) Mäuse, deren Makrophagen kein Sn exprimieren, der tMCAO unterzogen und die klinischen Folgen bewertet. Sn-/- Tiere zeigten verglichen mit Wildtypen (Sn+/+) verbesserte neurologische und motorische Funktionen an Tag 1 nach Schlaganfall. Diese Verbesserung war auch an Tag 3 nach Schlaganfall eindeutig nachweisbar. Die Infarkte an Tag 1 waren größenmäßig vergleichbar mit Sn+/+ Mäusen und nahmen bis Tag 3 nicht an Größe zu. Zu keinem Zeitpunkt wurde eine intrazerebrale Blutung beobachtet. 24 Stunden nach Schlaganfall kam es bei Sn+/+ Mäusen zu einer starken Induktion von Sn, welches im normalen Gehirn nur auf perivaskulären Makrophagen exprimiert wurde. Die Deletion von Sn auf Makrophagen wirkte einer Bluthirnschrankenstörung entgegen und hatte eine deutlich geringere Infiltration von CD11b+ (spezifischer Marker für Makrophagen/Mikroglia) Zellen ins ischämische Gewebe zur Folge. Dies war interessanterweise nicht mit einer Veränderung der Zytokinexpression verknüpft. Zur weiteren Untersuchung der Makrophagenrolle nach Schlaganfall wurde die Dissertation auf LysM-Cre+/-/IKK2-/- Mäuse ausgedehnt. Diese wiesen einen Makrophagen-spezifischen Defekt in der Aktivierung des Transkriptionsfaktors Nuklearfaktor (NF)-ϰB auf, und konnten folglich inflammatorische Zytokine unter der Transkriptionskontrolle von NF-ϰB nicht synthetisieren. Die Infarktgrößen und neurologischen Defizite der transgenen Tiere waren überraschenderweise vergleichbar mit wildtypischen Wurfgeschwistern. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Makrophagen zumindest nicht durch die Synthese von inflammatorischen Zytokinen zum Gewebeschaden und zu neurologischen Defiziten in der Frühphase nach Schlaganfall beitragen, während Sn, das initial nur auf perivaskulären Makrophagen exprimiert und später im ischämischen Parenchym auf Makrophagen/Mikroglia hochreguliert wird, Einfluss auf das funktionelle Outcome hatte.