A novel approach to control Boophilus microplus is to disrupt the physiological function of an endogenous myokinin receptor of this tick that was previously cloned in our laboratory. To test the hypothesis that this myokinin receptor might be a suitable target for development of a novel acaricide, this target was validated by immunological disruption. A mixture of peptides, corresponding to the sequence of the extracellular loops of this receptor which were synthesized and linked to a carrier protein, was injected into Hereford cattle to induce an immunological response. Immunological tests (ELISA) were developed to test the sera of these animals for antibody titers. The data were analyzed using a randomized block split plot design and were compared between the control (calves numbers 407, 408, 427, 436, and 438) and peptide-injected calves (calves numbers 417, 420, 421, 426, and 435). A gradual increase of antibody production was observed with the peptide-injected calves with bleed 4 showing the highest absorbances. Control calves and peptide-injected calves with high antibody titers were challenged with approximately 20,000 tick larvae at the USDA Cattle Tick Research laboratory. The tick challenge test determined that disruption of the receptor function produces a detrimental effect on tick physiology (development, feeding and reproduction) by looking at percentage of molting, time of survivorship, number of ticks dropped, weight of fed females, weight of egg masses, and blood meal conversion. The results, which were analyzed by a contingency table and a 2 sample T-test, did not support the hypothesis that the sera ingested from the peptide-injected cattle would cause a detrimental effect on tick physiology. There was no statistical significance in the percentage of metanymphs molting from peptide-injected calves versus control calves (p = 0.282) and in the time of adult survivorship. A statistical inference could be made about the number of ticks that dropped since four calves died of bovine babesiosis after the metanymphal collection. There was no statistical significance in the weight of fed females (p = 0.061), weight of egg masses (p = 0.885), and bloodmeal conversion (p = 0.312) from peptide-injected calves versus control calves.

A novel approach to control Boophilus microplus is to disrupt the physiological function of an endogenous myokinin receptor of this tick that was previously cloned in our laboratory. To test the hypothesis that this myokinin receptor might be a suitable target for development of a novel acaricide, this target was validated by immunological disruption. A mixture of peptides, corresponding to the sequence of the extracellular loops of this receptor which were synthesized and linked to a carrier protein, was injected into Hereford cattle to induce an immunological response. Immunological tests (ELISA) were developed to test the sera of these animals for antibody titers. The data were analyzed using a randomized block split plot design and were compared between the control (calves numbers 407, 408, 427, 436, and 438) and peptide-injected calves (calves numbers 417, 420, 421, 426, and 435). A gradual increase of antibody production was observed with the peptide-injected calves with bleed 4 showing the highest absorbances. Control calves and peptide-injected calves with high antibody titers were challenged with approximately 20,000 tick larvae at the USDA Cattle Tick Research laboratory. The tick challenge test determined that disruption of the receptor function produces a detrimental effect on tick physiology (development, feeding and reproduction) by looking at percentage of molting, time of survivorship, number of ticks dropped, weight of fed females, weight of egg masses, and blood meal conversion. The results, which were analyzed by a contingency table and a 2 sample T-test, did not support the hypothesis that the sera ingested from the peptide-injected cattle would cause a detrimental effect on tick physiology. There was no statistical significance in the percentage of metanymphs molting from peptide-injected calves versus control calves (p = 0.282) and in the time of adult survivorship. A statistical inference could be made about the number of ticks that dropped since four calves died of bovine babesiosis after the metanymphal collection. There was no statistical significance in the weight of fed females (p = 0.061), weight of egg masses (p = 0.885), and bloodmeal conversion (p = 0.312) from peptide-injected calves versus control calves.

Thesis (Ph.D.) - University of Queensland, 2004. / Includes bibliography.

Thesis (Ph. D.)--Washington State University, May 2007. / Includes bibliographical references.

Lipases (triacilglicerol acilhidrolases, EC 3.1.1.3) são serino hidrolases de considerável relevância fisiológica e potencial uso industrial. O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é um dos mais importantes e bem estudados agente biológico para o controle de muitos artrópodes-praga incluindo o carrapato bovino Boophilus microplus. Lipases secretadas por M. anisopliae podem estar potencialmente envolvidas no processo de infecção do hospedeiro, porém, estudos sobre estas enzimas vêm sendo negligenciados em fungos. Neste trabalho, desenvolvemos uma estratégia simples objetivando detectar e quantificar a atividade de lipase durante a infecção de B. microplus por M. anisopliae. Além disso, estudamos os efeitos de diferentes fontes de carbono, incluindo componentes do tegumento do hospedeiro, na secreção de lipases por M. anisopliae em sobrenadantes de cultura. Apresentamos, também, a purificação parcial de uma lipase secretada em cultura líquida de M. anisopliae. A atividade de lipase aumentou de 0,03 U para 0,207 ± 0,021 U e de 0,033 ± 0,002 U para 0,358 ± 0,05 U durante a infecção (6 a 96 horas) em carrapatos vivos e mortos, respectivamente, infectados por M. anisopliae. Em culturas líquidas observamos altos níveis de atividade lipolítica principalmente em culturas suplementadas com quitina mais lipídeo animal. Nos zimogramas a atividade de lipase foi detectada em carrapatos infectados mortos e vivos em todos tempos testados como também em todos sobrenadantes de cultura analisados. A purificação parcial foi realizada com dois passos cromatográficos incluindo uma cromatografia de troca aniônica que apresentou somente um pico de atividade no gradiente salino. Esperamos que os resultados apresentados neste trabalho contribuam para elucidar a função desempenhada pelas lipases no processo de infecção do hospedeiro de M. anisopliae. / Lipases (triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.1.1.3) are serine hydrolases of considerable physiological significance and industrial potential. The filamentous fungus Metarhizium anisopliae is one of the most important and best-studied biological agent for control of many arthropod pests including the cattle tick Boophilus microplus. Lipases secreted by M. anisopliae could potentially be involved in the host infection process but studies about these enzymes have been neglected mainly in fungi. In this work, we developed a simple strategy aiming to detect and quantify lipase activity during B. microplus infection by M. anisopliae. Moreover, we studied the effects of different carbon sources, including components of the tegument of host, on lipase secretion by M. anisopliae in culture supernatants. We presented, also, a partial purification of secreted lipolytic enzyme in M. anisopliae liquid culture. Lipase activity increases from 0.03 ± 0 U to 0.207 ± 0.021 U and from 0.033 ± 0.002 U to 0.358 ± 0.05 U during infection (6 to 96 hours) in live and dead ticks, respectively, infected by M. anisopliae. In liquid cultures we observed high levels of lipolytic activity mainly in cultures supplemented of chitin plus animal lipid. In zymograms, lipase activity was detected in infected dead and live ticks in all times tested as well as in all analyzed liquid culture supernatants. A partial purification was achieved with two chromatographic steps including an anionic exchange chromatography that presents only one peak of lipase activity in the saline gradient. We hope that results presented in this work contributes to elucidate the role played by lipases in M. anisopliae host infection process.

O carrapato Boophilus microplus é um ectoparasita hematófago que infesta os rebanhos bovinos de regiões tropicais e subtropicais, causando grande prejuízo à pecuária. O principal método de controle deste parasita baseia-se no uso de acaricidas, entretanto, o uso de vacinas tem sido estudado como um método de controle promissor. A Boophilus Yolk pro-Cathepsin (BYC) é uma aspártico proteinase presente no ovo do carrapato e envolvida na embriogênese que foi anteriormente testada como imunógeno vacinal. Neste estudo, o cDNA da BYC foi amplificado por PCR e clonado em dois vetores de expressão para produção de duas formas da proteína recombinante com cauda de histidina, rBYC e rBYC-Trx (fusionada com tioredoxina). As duas formas foram expressas em Escherichia coli na forma de corpúsculos de inclusão (CI) e comparadas quanto ao nível de expressão, solubilidade e rendimento na purificacão. Três agentes desnaturantes (N-lauroil sarcosina, hidrocloreto de guanidina e uréia) foram testados para solubilização dos CIs. Sarcosina foi o agente mais eficiente, solubilizando mais de 90 % de rBYC-Trx e rBYC. As duas proteínas recombinantes foram purificadas em cromatografia de afinidade por metal (Ni2+), sob condições desnaturantes. O rendimento na purificação da proteína solúvel foi de 84 % para r-BYC-Trx e 6 % para rBYC. As duas formas foram reconhecidas por soro de coelhos, camundongos e bovinos previamente imunizados com BYC nativa, demonstrando a existência de epítopos comuns entre a BYC nativa e as formas recombinantes expressas em E. coli. Para verificar o potencial vacinal da proteína recombinante, um grupo de bovinos Hereford foi imunizado com rBYC e desafiado com 20.000 larvas de B. microplus por animal. Os soros dos bovinos imunizados reconheceram a BYC nativa em ELISA e “Western blot”, com títulos entre 500 e 4.000. Os resultados do desafio mostraram uma proteção parcial contra a infestação, com 25 % de proteção global. O perfil de expressão de citocinas (IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ) foi verificado por RT-PCR, porém os resultados não permitiram identificar a polarização da resposta imune em Th1 ou Th2. Os resultados de imunoproteção obtidos com a BYC recombinante foram similares aos obtidos na imunização de bovinos com BYC nativa, indicando a possibilidade de uso da forma recombinante como imunógeno vacinal.

O carrapato Boophilus microplus, um ectoparasita hematófago, está presente em áreas tropicais e subtropicais no mundo todo. Atualmente, seu controle é baseado no uso de pesticidas. Para auxiliar no desenvolvimento de novas vacinas para este parasita, é importante compreender melhor sua fisiologia. A coronina, uma proteína de citoesqueleto, pertence à Família das Proteínas G. Está localizada no córtex celular e apresenta várias funções, desde locomoção celular, fagocitose, macropinocitose a ligação de microtúbulos, orientação da polaridade de embriões, citocinese, polimerização dos filamentos de actina e regulação da organização do citoesqueleto. No presente trabalho, o cDNA de uma proteína semelhante a coronina foi isolado de uma biblioteca de cDNA de glândulas salivares de partenóginas por triagem imunológica. A análise de seqüência mostrou que o clone SG5 possui identidade entre 15 e 17% com seqüências de proteínas semelhantes a coronina de outras espécies, como as de humanos e de camundongo, e possui um tamanho de 1.938 pb, com uma suposta ORF de 960 nucleotídeos. Na análise da expressão do gene, verificouse que o mRNA deste gene está presente em ovos e larvas de 15 dias e glândulas salivares, intestino e ovário de teleógina e partenógina; em corpo gorduroso sua presença não foi detectada. Um estudo mais detalhado do papel da proteína semelhante a coronina nas glândulas salivares de B. microplus pode auxiliar em uma melhor compreensão da fisiologia deste parasita.

Lipases (triacilglicerol acilhidrolases, EC 3.1.1.3) são serino hidrolases de considerável relevância fisiológica e potencial uso industrial. O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é um dos mais importantes e bem estudados agente biológico para o controle de muitos artrópodes-praga incluindo o carrapato bovino Boophilus microplus. Lipases secretadas por M. anisopliae podem estar potencialmente envolvidas no processo de infecção do hospedeiro, porém, estudos sobre estas enzimas vêm sendo negligenciados em fungos. Neste trabalho, desenvolvemos uma estratégia simples objetivando detectar e quantificar a atividade de lipase durante a infecção de B. microplus por M. anisopliae. Além disso, estudamos os efeitos de diferentes fontes de carbono, incluindo componentes do tegumento do hospedeiro, na secreção de lipases por M. anisopliae em sobrenadantes de cultura. Apresentamos, também, a purificação parcial de uma lipase secretada em cultura líquida de M. anisopliae. A atividade de lipase aumentou de 0,03 U para 0,207 ± 0,021 U e de 0,033 ± 0,002 U para 0,358 ± 0,05 U durante a infecção (6 a 96 horas) em carrapatos vivos e mortos, respectivamente, infectados por M. anisopliae. Em culturas líquidas observamos altos níveis de atividade lipolítica principalmente em culturas suplementadas com quitina mais lipídeo animal. Nos zimogramas a atividade de lipase foi detectada em carrapatos infectados mortos e vivos em todos tempos testados como também em todos sobrenadantes de cultura analisados. A purificação parcial foi realizada com dois passos cromatográficos incluindo uma cromatografia de troca aniônica que apresentou somente um pico de atividade no gradiente salino. Esperamos que os resultados apresentados neste trabalho contribuam para elucidar a função desempenhada pelas lipases no processo de infecção do hospedeiro de M. anisopliae. / Lipases (triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.1.1.3) are serine hydrolases of considerable physiological significance and industrial potential. The filamentous fungus Metarhizium anisopliae is one of the most important and best-studied biological agent for control of many arthropod pests including the cattle tick Boophilus microplus. Lipases secreted by M. anisopliae could potentially be involved in the host infection process but studies about these enzymes have been neglected mainly in fungi. In this work, we developed a simple strategy aiming to detect and quantify lipase activity during B. microplus infection by M. anisopliae. Moreover, we studied the effects of different carbon sources, including components of the tegument of host, on lipase secretion by M. anisopliae in culture supernatants. We presented, also, a partial purification of secreted lipolytic enzyme in M. anisopliae liquid culture. Lipase activity increases from 0.03 ± 0 U to 0.207 ± 0.021 U and from 0.033 ± 0.002 U to 0.358 ± 0.05 U during infection (6 to 96 hours) in live and dead ticks, respectively, infected by M. anisopliae. In liquid cultures we observed high levels of lipolytic activity mainly in cultures supplemented of chitin plus animal lipid. In zymograms, lipase activity was detected in infected dead and live ticks in all times tested as well as in all analyzed liquid culture supernatants. A partial purification was achieved with two chromatographic steps including an anionic exchange chromatography that presents only one peak of lipase activity in the saline gradient. We hope that results presented in this work contributes to elucidate the role played by lipases in M. anisopliae host infection process.

Carrapatos são animais hematófagos transmissores de diversas doenças para animais e seres humanos. O Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um ectoparasito específico de bovinos. É responsável por importantes perdas econômicas na pecuária de países produtores de carne e leite. O aumento de populações de carrapatos resistentes aos principais acaricidas usados e a possível contaminação ambiental e dos produtos derivados como carne e leite impõem estudos para desenvolver novos métodos de controle. O controle imunológico é uma estratégia comprovadamente viável, porém ainda falta encontrar antígenos suficientemente eficientes. Uma das estratégias para atingir esse fim é o estudo de proteínas participantes de processos fisiológicos de grande importância para o carrapato, como é a aquisição e digestão de sangue. Proteínas pertencentes à superfamília das serpinas (serine protease inhibitors) participam do controle de diversos processos fisiológicos em mamíferos, inclusive coagulação sanguínea, fibrinólise e ativação do sistema complemento. Uma vez que carrapatos possuem informação para a síntese de serpinas, supõe-se que algumas têm como função perturbar a homeostase de seus hospedeiros. Analisando banco de sequências de cDNA identificamos 16 sequências que codificam serpinas no carrapato bovino, que foram nomeadas RmS (R. microplus serpin). Análises por RT-PCR mostraram que na maioria dos tecidos e estágios de desenvolvimento do parasito há expressão das RmS. Todas as sequências identificadas mostram conservação com serpinas de outras espécies de carrapatos. Aproximadamente 41% das RmS (7 de 16) provavelmente são secretadas, pois possuem predição para peptídeo-sinal. Assim como em outras serpinas, todas RmS possuem entre 1 e 4 sítios para N-glicosilação. Modelos tridimensionais revelam conservação de estrutura terciária das RmS analisadas com outras serpinas de mamíferos. Devido à presença de peptídeo-sinal, conservação com serpinas de outros carrapatos e presença em saliva, que foi revelada pelo estudo proteômico preliminar da saliva do parasito, RmS-3 foi escolhida para estudos mais pormenorizados. Para isso, a sequência codificadora foi clonada e ela foi obtida em forma recombinante. Anticorpos policlonais produzidos contra a proteína recombinante revelaram a presença da proteína em todos os tecidos analisados, e também na saliva, o que sugere participar na modulação das respostas do hospedeiro. / Ticks are hematophagous animals vectors of several human and animal diseases. Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a bovine-specific ectoparasite. It is causes significant economic losses in livestock-producing countries. Increasing tick acaricide-resistant populations and, possible contamination on the environmental and on bovine-derived products contamination such as meat and milk impel the study of new control methods. Immunological control is a strategy proved to be feasible, but it requires really efficient antigens. A strategy to achieve this purpose is the study of proteins acting in physiological processes of major importance for the tick, as blood intake and digestion. Proteins belonging to the superfamily of serpins (serine protease inhibitors) have a role in several mammalian physiological processes, including blood coagulation, fibrinolysis and complement activation. As ticks encode information for serpins synthesis it is assumed they disrupt homeostasis their hosts. Through analysis of the cDNA sequences database, we identified 16 sequences coding for serpins in cattle tick, which were named RmS (R. microplus serpin). RT-PCR analyses showed RmSs are expressed in most tick tissues and developmental stages. All identified sequences are conserved concerning other tick species serpins. Around 41% of RmS (7 out 16) are probably secreted, since they have sequences predicting for signal peptide. Similarly as other serpin, all RmSs have 1 to 4 N-glycosylation sites. Protein modeling showed all RmSs have a conserved tertiary structure with other mammal serpins. RmS-3 was chosen for further studies due to presence of signal peptide, conservation with serpin inform other ticks and the presence in saliva revealed by an initial a proteomic study of tick saliva. In these studies, its gene was cloned RmS-3 was obtained as a recombinant protein. Polyclonal antibodies were against the recombinant protein showed RmS-3 presence in all analyzed tissues and also in saliva, suggesting it have a role disturbing host responses.

Carrapatos são ectoparasitos hematófagos que causam grandes impactos na saúde pública e na produção animal devido à sua capacidade vetorial e também pelos distúrbios associados diretamente ao parasitismo. O carrapato Rhipicephalus microplus é considerado o parasito mais importante de bovinos na América Latina e Oceania. Os carrapatos permanecem fixados ao hospedeiro por um longo período de tempo, e a saliva representa um fator crucial na relação parasito-hospedeiro. Os carrapatos secretam na saliva um conjunto de moléculas com atividades que modulam as respostas de defesa do hospedeiro frente ao parasitismo, tais como as reações do sistema hemostático e do sistema imune inato e adaptativo. Considerando a importância econômica do carrapato R. microplus, e o papel da saliva no parastismo, pouco se sabe sobre a composição proteica da saliva desse parasito. Os objetivos desse trabalho são caracterizar o proteoma da saliva do carrapato R. microplus em diferentes momentos da fase de alimentação no hospedeiro bovino e caracterizar três serpinas salivares. Neste sentido, este estudo foi organizado em três partes. Primeiramente, fizemos uma análise proteômica da saliva de fêmeas adultas em dois estágios de ingurgitamento, compreendendo fêmeas parcialmente ingurgitadas e fêmeas totalmente ingurgitadas. Num segundo momento, analisamos mais a fundo a variação dos componentes proteicos salivares das fêmeas, expandindo a análise proteômica para nove fases de ingurgitamento do parasito. Esses dados mostraram que a saliva de R. microplus é uma amostra proteica complexa, com variação nos diferentes tempos de alimentação. Entre as classes de proteínas identificadas, podemos citar proteínas relacionadas com metabolismo de heme e ferro; proteínas relacionadas com processos de oxidação e detoxificação; enzimas como as serino-proteases, cisteíno-proteases, metaloproteases; inibidores de proteases da família das serpinas, cistatinas, TIL e Kunitz; peptídeos antimicrobianos; e famílias de proteínas específicas e conservadas em carrapatos. A terceira parte do trabalho objetivou a caracterização de três serpinas que foram identificadas na saliva (RmS-3, RmS-6 e RmS-17). Essas proteínas foram expressas em Pichia pastoris e foram utilizadas em ensaios de caracterização funcional contra um painel de 16 proteases relacionadas com os sistemas de defesa do hospedeiro, revelando um perfil de inibição sobre proteases pró-inflamatórias e prócoagulantes. Os dados apresentados neste trabalho contribuem para o entendimento do papel de proteínas salivares durante o parasitismo pelo carrapato R. microplus. / Ticks are hematophagous ectoparasites with worldwide distribution impacting on public health and animal production due to their vectorial capacity and also for disorders associated directly to parasitism. The tick Rhipicephalus microplus is considered the most important parasite of cattle in Latin America and Oceania. As hematophagous ectoparasites which remain attached to the host for a long period of time, the saliva of ticks represent a crucial factor in host-parasite relationship. The tick saliva comprises an arsenal of molecules with activities modulating the host defense responses trigged against tick feeding, such as the reactions of the hemostatic system, the innate immune system and the adaptive immune system. Considering the economic importance of the tick R. microplus, little is known about the protein composition of the saliva of this parasite. The aims of this study were to characterize the R. microplus tick saliva proteome at different feeding times, and to characterize three salivary serpin that were identified in the saliva of this parasite. Thus, this study was organized into three parts. Firstly, we conducted a proteomic analysis of female saliva in two developmental stages of adult tick feeding, including partially engorged and fully engorged females. Secondly, we analyzed in depth the variation of salivary protein components, expanding proteomics analysis to nine stages of tick feeding. These data showed that the R. microplus saliva is a complex protein sample, with variations in different feeding times. Among the classes of identified proteins, we can mention proteins related to heme and iron metabolism; proteins related to oxidation and detoxification processes; enzymes such as serine proteases, cysteine proteases, metalloproteases; proteases inhibitors belonging to serpin family, cystatins, TIL, and Kunitz; antimicrobial peptides; and families of tick-specific and conserved proteins. The third part of the study aimed to characterize three serpins that have been identified in saliva (RmS-3, RmS-6 and RmS-17). These proteins were expressed in Pichia pastoris and were used for functional characterization against a panel of 16 host proteases related to defense systems. Results revealed an inhibition profile for pro-inflammatory and pro-clotting proteases. The data presented here contributes to understanding the role of salivary proteins into tick-host relationship.