Investigaciones en nuestro y otros laboratorios han demostrado que la hormona 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D3) modula los niveles de Ca2+ intracelular en células de músculo esquelético y tejido óseo por un mecanismo genómico, característico de hormonas esteroideas en el cual la hormona interacciona con un receptor intracelular específico (VDR: vitamin D receptor). Esta molécula exhibe una localización citoplásmica/nuclear, siendo el complejo hormona-receptor el responsable de la regulación de la expresión de genes portadores de elementos de respuesta a VDR. Sin embargo, 1,25(OH)2D3 modula también los niveles de Ca2+ intracelular a través de un mecanismo rápido, no genómico, independiente de la transcripción génica y de la síntesis proteica que implica acciones directas del esteroide sobre la membrana celular. Las acciones rápidas, no nucleares de 1,25(OH)2D3 requieren la activación de varios sistemas de señalización (adenilil ciclasa/AMPc/PKA; PLC/DAG/IP3/Ca2+/PKC), integrados en un mecanismo complejo que involucra proteínas G, interacción positiva entre las vías PKA y PKC e incremento en la fosforilación de proteínas de membrana. En conjunto, estos eventos conducen a una rápida y transitoria liberación de Ca2+ de los depósitos internos y activación de canales de Ca2+ dependientes de voltaje (VDCC) tipo L, con el consecuente influjo sostenido de Ca2+ desde el medio extracelular. En el presente trabajo empleando el indicador fluorescente de Ca2+ Fura-2, se caracterizaron los efectos de la hormona 1,25(OH)2D3 sobre los niveles de Ca2+ citosólico en cultivos de osteoblastos de rata. Estos estudios pusieron de manifiesto que la fase de influjo de Ca2+ inducido por 1,25(OH)2D3 es mediada por los canales VDCC ya caracterizados, indicando además que existe una contribución parcial a la entrada de Ca2+ mediada por canales no dependientes de voltaje operados por el nivel de Ca2+ de los depósitos internos. Se introduce así el novedoso concepto sobre la participación de canales SOC (Store Operated Channels; CCE: Capacitative Ca2+ Entry ) en la respuesta rápida de Ca2+ a la hormona. A partir de este hallazgo, estudiamos y caracterizamos esta entrada capacitativa de cationes en líneas celulares derivadas de epitelio mamario y de cáncer mamario, ambas de origen humano. Estos canales, activados por depleción y/o movilización de Ca2+ de depósitos internos, independientes de voltaje y regulados por múltiples eventos de señalización intracelular, estarían constituídos por proteínas de la familia de genes TRP, originalmente descriptos en células fotoreceptoras de Drosophila (mutantes trp: Transient Receptor Potential). Sus genes han sido clonados, secuenciados y su funcionalidad como canales responsables del influjo de Ca2+ tipo SOC, ha sido demostrada mediante expresión de proteínas TRP en sistemas heterólogos. Además, en el sistema fototransductor de Drosophila, TRP forma parte de un complejo de señalización multiproteico junto con RH1 (rodopsina), NORPA (PLC específica de células fotoreceptoras), INAC (PKC específica de células fotoreceptoras) y una proteína adaptadora (scaffold protein) denominada INAD (Inactivation No After potential D) responsable de asociar todos los componentes en un complejo. INAD posee dominios PDZ, responsables de su función adaptadora mediante interacciones proteína-proteína. Recientes estudios bioquímicos, moleculares y electrofisiológicos, sugieren que INAD representa una subunidad constitutiva del canal TRP con función adaptadora en la formación del complejo supramolecular de señalización. Esta organización multiproteica de los componentes de señalización proporciona las bases estructurales para una eficiente y rápida activación y regulación de la entrada de Ca2+ a través de canales TRP. Se describieron recientemente homólogos de INAD en distintos tipos de células de vertebrados, donde se observó que cumplen función adaptadora en la formación de complejos de señalización integrados por receptores hormonales, canales iónicos y quinasas. En este trabajo mostramos evidencias de una proteína homóloga a INAD en osteoblastos de rata y su participación en el influjo capacitativo. En síntesis, en la presente Tesis Doctoral se muestran evidencias de influjo capacitativo de calcio en distintos tipos celulares, habiendo caracterizado este influjo y estudiado exhaustivamente la modulación de cationes en el interior celular. Particularmente en osteoblastos, un sistema íntimamente relacionado con el metabolismo del calcio, demostramos la única evidencia existente sobre modulación de canales SOC por un esteroide y más precisamente, la participación de proteínas TRP e INAD asociadas a este mecanismo fisiológico vinculado a la homestasis de cationes intracelulares. / Evidences from our laboratory and others have demonstrated that the hormone 1,25-dihydroxyvitamin D3 (1,25(OH)2D3) modulates intracellular Ca2+ levels in skeletal muscle cells and bone tissue through a genomic mechanism, typical for steroidal hormones via specific an intracellular receptor (VDR: Vitamin D Receptor). Such molecule exhibits a cytoplasmatic-nuclear localization and the hormone-receptor complex is responsible for gene expression regulation of VDR responsive elements. Nevertheless, 1,25(OH)2D3 also modulates intracellular Ca2+ levels through a non genomic, rapid mechanism, independent of gene transcription and protein synthesis, implying direct steroid actions on the cellular membrane. Rapid or non genomic actions of 1,25(OH)2D3 requires the activation of diverse signal systems (adenylyl cyclase/cAMP/PKA; PLC/DAG/IP3/Ca2+/PKC), forming a complex mechanism that involves G proteins, positive interaction between PKA and PKC and increased protein phosphorylation. Altogether, these events lead to a rapid and transient Ca2+ release from internal stores and activation of Voltage Dependent Ca2+ Channels (VDCC) type L, followed by a sustained Ca2+ influx from the extracellular medium. In the present work by using the fluorescent Fura-2 Ca2+ dye, the effect of 1,25(OH)2D3 hormone on cytosolic Ca2+ levels in rat osteoblast cells were characterized. We have demonstrated that the 1,25(OH)2D3-induced Ca2+ influx phase is mediated by the well known VDCC channels and also that a Ca2+ partial entry contribution may occur by a non voltage dependent channels and operated by the status of internal Ca2+ stores. In this way we introduce a novel concept of SOC channels (Store Operated Channels; Capacitative Ca2+Entry) in rapid response of Ca2+ for the hormone. Accordingly, we have studied and characterized the capacitative cation entry in other cellular system derived from breast epithelium and breast cancer, both from human origen. These channels, activated by depletion and/or Ca2+ mobilization from internal stores, voltage independent and regulated by multiple intracellular signal events, involve proteins encoded by the trp family genes, first described in photoreceptor cells from Drosophila (mutants in trp: Transient Receptor Potential). Trp genes have been cloned and sequenced, their functionality as channels responsible from Ca2+ influx type SOC has been demonstrated through heterologous expression of TRP proteins. In addition, in Drosophila photoreceptor system, TPR is part of a multiproteic signal complex together with RH1 (rhodopsin), NORPA (PLC specific of photoreceptor cells), INAC (PKC specific of photoreceptor cells) and a scaffold protein named INAD (Inactivation No After potential D) responsible for the association of all components into a complex. INAD exhibits PDZ domains, responsible of its adaptor function through protein-protein interaction. Recently several biochemical, molecular and electrophysiologycal studies, suggests that INAD represents a constitutive subunit of TRP channels with an adaptor function in the supramolecular signaling complex assemble. This multiproteic organization of the signaling components provides the structural basis for an efficient and rapid activation and regulation of Ca2+ entry through TRP channels. INAD homologous sequences have been recently described in different vertebrate cells types, whereas it has been observed that plays scaffolding functions allowing the assembly of a complex composed by hormone receptors, ion channels and kinases. We demonstrated the presence of an INAD homologous protein in rat osteoblasts and its relationship to the capacitative Ca2+ influx. In summary, the present Doctoral Thesis describes the capacitative calcium entry in different cell types. We have characterized this influx and exhaustively studied the intracellular cation modulation. In particular, we have focused our efforts on osteoblast cells, a system closely dependant on calcium metabolism, and present the first evidence of SOC channels modulation by a steroid hormone and more precisely, the involvement of TRP and INAD proteins associated to this physiological mechanism in the control of intracellular Ca2+ homeostasis.

Recientemente ha comenzado a surgir evidencia que relaciona a p300 con el cáncer. Sin embargo, aún no está claro cuál es el rol de la proteína en esta patología ya que hay evidencia que indica que puede funcionar como un supresor tumoral o como una oncoproteína. La información disponible sobre la relación entre p300 y el carcinoma mamario está basada generalmente en estudios en líneas celulares siendo escasos los trabajos en modelos animales o utilizando biopsias humanas. En este trabajo de tesis se pudo demostrar que la inhibición de la actividad acetilasa de p300 disminuye la supervivencia celular de las líneas LM3 y MDA-MB-231 e induce apoptosis en la línea celular LM3. Además se demostró que dicha inhibición disminuye la migración celular de las líneas LM3 y MDA-MB-231 y disminuye la invasión celular y la formación de lamelipodios en la línea celular LM3. En el modelo murino de trasplante singeneico de células LM3 se demostró que la inhibición de p300 reduce la carga tumoral, la invasión a la cavidad abdominal y el número de metástasis pulmonares. La reducción del tamaño tumoral fue acompañada de una disminución del índice mitótico y de los niveles de Ki-67 y de un incremento de la expresión de Bax. Al estudiar la expresión de p300 en el modelo murino transgénico MMTV-PymT y en el de carcinogénesis inducida con DMBA en rata se observó que p300 se encuentra altamente expresado y en una localización citoplasmática en las células del tumor comparado con las de la glándula mamaria normal. Además se observó que parte del p300 citoplasmático se encuentra en estructuras con características de agresomas en las células tumorales de un cultivo primario derivado de este último modelo animal, pero no en las células normales del mismo cultivo. En biopsias humanas de carcinomas mamarios se ha podido demostrar una mayor expresión de p300 en tejidos tumorales que en las zonas histológicamente normales adyacentes al tumor y que en el tejido mamario no maligno. También se detectó la inusual localización citoplasmática de p300 en los tejidos malignos y se pudo demostrar que esta localización se asocia con un menor tamaño tumoral, menor tasa de recaída y mayor sobrevida global de las pacientes y en los tumores triple negativos también con menor estadio tumoral. En conjunto, los resultados de esta tesis sugieren que la acción oncogénica de p300 se realiza en el núcleo a través de su acción sobre la regulación de la transcripción génica y que al ser trasladado al citoplasma esta acción no puede realizarse porque está fuera del núcleo, porque además en el citoplasma es degradado y/o secuestrado en agresomas y posiblemente también por que ejerce nuevas funciones específicas de su ubicación citoplasmática que pueden tener efectos antitumorales. También indican que la localización de p300 puede ser de potencial interés como factor pronóstico y señalan la necesidad de continuar investigando los mecanismos celulares y moleculares que la desregulación de esta proteína podría estar afectando, contribuyendo así al desarrollo del cáncer de mama. / Recently, an increasing body of evidence indicates that p300 could play a role in cancer. Nonetheless, the role of the protein in this disease remains unclear, since there is evidence indicating that it can function both as a tumor suppressor and as an oncoprotein. The available information about the relationship between p300 and breast carcinoma is usually based on studies in cell lines although there have been few studies using animal models or human biopsies. In this thesis we demonstrated that the inhibition of the p300 acetyltransferase activity decreases cellular viability in LM3 and MDA-MB-231 cell lines and induces apoptosis in LM3 cell line. Furthermore, we demonstrated that p300 inhibition reduces cellular invasion in LM3 and MDA-MB-231 cell lines and decreases the invasiveness and lamellipodium formation in LM3 cells. In a syngeneic murine model of subcutaneous transplantation of LM3 cells, we demonstrated that inhibition of p300 reduces tumor burden, tumor invasion into the abdominal cavity and lung metastases. This reduction in tumor burden was accompanied by a decrease in the mitotic index and Ki-67 levels and an increase in Bax expression. When we have studied the expression of p300 in the MMTV-PymT transgenic murine model and in the DMBA-induced rat model, we observed stronger expression and a cytoplasmic localization in the tumor cells in comparison with normal mammary glands. In addition, we have observed that cytoplasmic p300 is partially localized in aggresome-like structures in tumor- but not in normal mammary gland-derived primary cell cultures from the rat animal model. Moreover, the analysis of p300 expression in human breast cancer samples showed that p300 immunoreactivity is significantly higher in the cancerous tissues than in the non-malignant mammary tissues and in the histologically normal adjacent tissues. Interestingly, p300 was observed in the cytoplasm, and María Eugenia Fermento Página 9 the rate of cytoplasmic p300 was higher in breast cancer than in non-tumor tissues. Importantly, we found that cytoplasmic localization of p300 is associated with a reduced tumor size, lower recurrence rates and an increase in the overall survival time of patients. Furthermore, in triple negative breast cancer cytoplasmic p300 is also associated with lower tumor stage. Together, the results obtained in this thesis suggest that p300 acts as an oncogene when localized in the nucleus through its action upon the regulation of gene transcription. When p300 is translocated to the cytoplasm, its oncogenic action cannot be performed because it is outside of the nucleus, because it is degraded and/or sequestered in aggresomes and probably also because it may exert cytoplasmic specific functions which might have antitumor effects. Also, the results obtained in this thesis suggest that p300 localization could be potentially interesting as a prognostic factor and indicate the necessity to continue studying the cellular and molecular mechanisms in which the p300 is involved and whose deregulation could contribute to breast cancer development.