BEZERRA, Daniela da Silva. “Análise da viabilidade e expressão de genes de virulência de Streptococcus mutans em lesões dentinárias de crianças com cárie precoce da infância”. 2014. 74 f. Tese (Doutorado em Odontologia) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-05-26T15:07:47Z No. of bitstreams: 1 2014_tese_dsbezerra.pdf: 8252613 bytes, checksum: 8661237a83bb54c5fcb6ed84904a2523 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-05-26T15:10:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_tese_dsbezerra.pdf: 8252613 bytes, checksum: 8661237a83bb54c5fcb6ed84904a2523 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-26T15:10:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_tese_dsbezerra.pdf: 8252613 bytes, checksum: 8661237a83bb54c5fcb6ed84904a2523 (MD5) Previous issue date: 2014 / Early childhood caries (ECC) is characterized by the presence of one or more lesions on dental surface of children under 6 years old, being considered a public health issue. Streptococcus mutans (SM) is considered the main etiologic agent of the disease and has several virulence features that allow its survival in the oral cavity and, therefore, its selection under environmental stress situations. In this context, this research had as objectives; (a) to describe a method of total RNA extraction and purification to conduct studies on bacterial gene expression from in vivo dentine caries lesions (Chapter 01); (b) to identify and quantify the metabolically active SM and analyze the expression of its virulence genes atpD, fabM, nox, pdhA and aguD on active and arrested dentin lesions (Chapter 02). Twenty-nine samples of active dentin caries and 16 samples of arrested dentin lesions were collected from children with ECC. The samples were submitted to extraction and purification of total RNA through a customized method, based on the use of a mechanical lysis and a commercial extraction kit and submitted to reverse transcriptase (RT) reaction to obtain complementary DNA (cDNA). Next, to demonstrate the primers specificity for the virulence genes on in vivo samples, 06 cDNA samples were submitted to Sanger’s sequencing for each primer. After verifying the specificity, RT-qPCR (quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction) were executed for all the samples. The results showed that the bacterial RNA could be extracted in appropriate quantity and quality through the customized protocol, making its use on gene expression studies on dentin affected by caries (Chapter 01). The RT-qPCR results showed that, despite the low quantification, if compared to total streptococci and total bacteria, SM was detected as metabolically active with similar quantification on active and arrested lesions (p>0.05). Despite that, a higher expression of the virulence genes pdhA and aguD was detected on arrested lesions (p≤0,05) (Chapter 02). It was concluded that after standardization of an effective RNA extraction technique, reactions of RT-qPCR were efficiently executed for SM identification, quantification, and gene expression on samples of human dentin affected by caries. This bacterium proved to be viable, however, only inactive lesions showed larger expression of the genes pdhA and aguD, probably to make its metabolic activity viable, even in unfavorable survival conditions. / A cárie precoce da infância (CPI) é caracterizada pela presença de uma ou mais lesões em superfície dentária de crianças menores de 6 anos de idade, sendo considerada um problema de saúde pública. Streptococcus mutans (SM) é considerado o principal agente etiológico da doença e possui vários atributos de virulência que permitem sua sobrevivência na cavidade oral e, portanto, sua seleção em situações de estresse nesse ambiente. Neste contexto, este trabalho teve por objetivos: (a) padronizar um método de extração e purificação de RNA total para viabilizar estudos de expressão gênica bacteriana de lesões de cárie dentinária in vivo (capítulo 1); (b) identificar e quantificar SM metabolicamente ativo e analisar a expressão dos genes de virulência atpD, fabM, nox, pdhA e aguD em lesões dentinárias ativas e inativas (capítulo 2). Foi realizada a coleta de 29 amostras de dentina cariada ativa e de 16 amostras de lesões dentinárias inativas de crianças com CPI. As amostras foram submetidas à extração e purificação do RNA total por um método padronizado, com base no uso de lise mecânica e kit de extração comercial e, em seguida, submetidas às reações de transcrição reversa (RT) para obtenção do DNA complementar (cDNA). Com o intuito de comprovação da especificidade dos primers para os genes de virulência de SM em amostras in vivo, 06 amostras de cDNA foram amplificadas e submetidas ao sequenciamento de Sanger para cada primer. Após verificação da especificidade, reações em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real da transcrição reversa (RT-qPCR) foram executadas para todas as amostras. Os resultados obtidos mostraram que o RNA bacteriano pôde ser extraído em adequada quantidade e qualidade pelo protocolo padronizado, viabilizando seu uso em estudos de expressão de genes bacterianos em dentina cariada (Capítulo 01). Os resultados da RT-qPCR mostraram que, apesar da baixa quantificação em relação aos estreptococos e bactérias totais, SM viáveis foram detectados com quantificação semelhante em lesões ativas e inativas (p>0.05). Apesar disso, maior expressão dos genes de virulência pdhA e aguD foi detectada nas lesões inativas (p≤0,05) (Capítulo 02). Concluiu-se que, após padronização de uma técnica eficaz de extração de RNA, reações de RT-qPCR foram executadas com eficiência para identificação, quantificação e expressão gênica de SM em amostras de dentina humana cariada. SM estavam viáveis nos dois grupos de lesões, porém só nas lesões dentinárias inativas mostraram maior expressão dos genes pdhA e aguD, provavelmente para viabilizar sua atividade metabólica nas condições menos favoráveis à sua sobrevivência, inerentes a este substrato.

Na literatura não existe consenso em relação à quantidade de dentina cariada que deve ser removida durante o preparo cavitário. Desta forma, este estudo teve como objetivo comparar os microorganismos remanescentes após a remoção total de tecido cariado e selamento e a remoção parcial de tecido cariado e selamento. Molares permanentes com lesões de cárie primárias ativas localizadas no terço médio da dentina e apresentando polpa vital foram divididos aleatoriamente em dois grupos: grupo teste - remoção parcial de tecido cariado (n=18), ou grupo de controle - remoção total de tecido cariado (tratamento restaurador convencional) (n=18). Os desfechos analisados foram a quantificação microbiana e a freqüência de isolamento microbiano. Amostras de dentina foram obtidas com duas brocas de baixa rotação estéreis n º 4, após a remoção da cárie e após 3 meses de proteção com cimento de hidróxido de cálcio e selamento das cavidades com cimento de ionômero de vidro. As amostras foram armazenadas em um recipiente estéril contendo 1,2 ml de RTF e submetidas a diluições decimais. Análises microbiológicas foram realizadas para Streptococcus spp., estreptococos do grupo mutans, Lactobacillus spp. e contagem total de anaeróbios.Antes do selamento, uma maior contagem de microrganismos foi detectada no grupo teste, em comparação ao grupo controle. No grupo de teste, uma redução significativa foi encontrada, após o selamento, na contagem de anaeróbios totais, Streptococcus spp. e Lactobacillus spp. Após 3 meses de selamento, não foi detectada diferença no crescimento microbiano entre os grupos para qualquer um dos microrganismos estudados. Portanto, a semelhança observada entre a infecção microbiana após a escavação convencional e remoção parcial de tecido cariado sugere que não há necessidade de realizar a remoção total do tecido cariado baseada em critérios clínicos convencionais de dureza. / In the literature there is no consensus on the amount of carious dentin to be removed during the cavity preparation. Thus, this study aimed to compare the remaining microorganisms after complete caries removal and sealing to partial caries removal and sealing. Permanent molars with active primary carious lesions located in the middle third of dentin and vital pulp were randomly divided into two groups of 18: test group - partial caries removal, or control group – complete caries removal (conventional restorative treatment). The outcomes analyzed were microbial quantification and frequency of microbial isolation. Dentin samples were obtained with two sterile n° 4 round burs after caries removal and after 3 months of protection with calcium hydroxide cement and sealing of the cavities with glass ionomer cement. The samples were stored in a sterile container with 1.2 ml of RTF and submitted to decimal dilutions. Microbiological analyses were performed to the Streptococcus spp., Mutans streptococci, Lactobacillus spp. and total anaerobes counts. Before sealing, a higher microorganism counts were detected in the test group compared to the control group. In the test group, significant reduction was found after sealing in the total anaerobes count, Streptococcus spp. and Lactobacillus spp. After 3 months of sealing, no difference was detected in microbial growth between groups for any of the microorganisms studied. Therefore, the observed similarity between the microbial infection after conventional excavation and partial caries removal suggests that there is no need to perform complete caries removal based on conventional clinical criteria of hardness.

As evidências, até então disponíveis, revelam o sucesso de tipos diferentes de abordagem conservadora de lesões de cárie profundas e as reações do complexo dentino-pulpar, entre elas a formação de dentina reacional. O objetivo do presente estudo foi avaliar histologicamente o tecido pulpar de dentes decíduos humanos submetidos a diferentes abordagens conservadora. A amostra foi composta por 25 molares decíduos, divididos em 5 grupos, sendo os primeiros tratados com remoção total de tecido cariado sem exposição pulpar (RTTC), remoção parcial de tecido cariado em sessão única (RPTC) e tratamento expectante (TE), além dos controles positivo (molares hígidos) e negativo (molares com lesão de cárie ativa profunda em dentina sem tratamento restaurador). Foi realizada a quantificação de dentina reacional, da presença ou não de inflamação e reabsorção pulpar e uma análise descritiva da morfologia pulpar através da observação de cada lâmina ao microscópio. Não foi encontrada diferença estatisticamente significativa entre os grupos, entretanto houve maior formação de dentina reacional no grupo de RPTC, nos levando a entender que o tratamento menos invasivo pode ser uma alternativa terapêutica definitiva para o tratamento das lesões profundas de cárie em dentina de dentes decíduos. / The evidence available so far shows the success of the conservative approach of deep carious lesions and the reactions of the pulp-dentin complex, including the formation of reactionary dentin. The aim of this study was to evaluate histologically the pulp tissue of human deciduous teeth undergoing different conservative treatments. The sample was composed of 25 primary molars, divided into 5 groups, the first being treated with total caries removal without pulp exposure (TCR), partial caries removal in one session (PCR) and stepwise excavation (SW), and positive controls (sound molars) and negative (molars with active deep caries lesion without restorative treatment). Quantification of reactive dentin was performed, the presence or absence of resorption and inflammation and pulp descriptive analysis of the morphology of pulp through observation of each slide under a microscope. There was no statistically significant difference between the groups, but there was more reactionary dentin formation in PCR group, leading us to understand that the less invasive treatment may be an alternative therapy for the definitive treatment of deep caries lesions in dentin of deciduous teeth.

O objetivo geral desta pesquisa foi avaliar estratégias de treinamento para a utilização do ICDAS, bem como, as técnicas de padrão-ouro utilizadas para validação dos métodos de detecção de lesões de cárie em superfícies oclusais. Para isso, dois estudos foram conduzidos. O primeiro estudo teve como objetivos: (1) avaliar o desempenho de estudantes de odontologia na detecção in vitro de lesões de cárie em superfícies oclusais utilizando o ICDAS após diferentes estratégias de treinamento e (2) avaliar a influência do treinamento de estudantes de odontologia através de um objeto digital de aprendizagem no desempenho em detectar in vitro lesões de cárie em superfícies oclusais utilizando o ICDAS. Já o segundo estudo teve como objetivo avaliar a influência do treinamento do examinador na reprodutibilidade de duas técnicas de padrão-ouro utilizadas para validação de cárie oclusal de acordo com três critérios de classificação histológica. Para o primeiro estudo, sessenta e quatro estudantes de odontologia que não tinham experiência em detecção de cárie através do ICDAS foram selecionados. Inicialmente, estes estudantes realizaram exames in vitro de 80 dentes permanentes para detecção de lesões de cárie em superfícies oclusais de acordo com o ICDAS utilizando apenas uma tabela com a descrição dos sete escores deste sistema. Todos os participantes foram aleatoriamente alocados em três grupos de acordo com a estratégia de treinamento para detecção de lesões de cárie utilizando o ICDAS: G1 (n= 21): e-learning do ICDAS; G2 (n= 22): e-learning do ICDAS + objeto digital de aprendizagem (ODA) sobre o ICDAS; G3 (n=21): nenhuma estratégia de treinamento (controle). Duas semanas depois, os alunos pertencentes ao G1 e G2 foram treinados de acordo com o grupo alocado. Transcorridas duas semanas deste treinamento, todos os participantes reavaliaram os dentes de acordo com o ICDAS. Os dentes foram preparados para validação histológica, na qual foi realizada a avaliação da extensão das lesões de cárie. Os resultados mostraram que na comparação nos grupos entre antes e depois da estratégia de treinamento foram encontrados valores significantemente maiores de sensibilidade e especificidade para G1 e G2, de sensibilidade para o G3 (no ponto de corte D2) e na área abaixo da curva ROC para G2. Na comparação entre os grupos em cada ponto de corte, o G1 apresentou especificidade maior no ponto de corte D3 que os outros dois grupos. Já a sensibilidade do G1 no ponto de corte D2 foi inferior ao G2 e G3. No segundo estudo foi selecionada uma amostra de 210 imagens digitais (105 de hemissecções dentárias sem corante e 105 com corante) de 105 dentes permanentes, além de uma amostra de seis cirurgiões-dentistas (três examinadores treinados para avaliação histológica de hemissecções dentárias e três examinadores da área odontológica, porém sem treinamento para avaliação histológica). Cada uma das 105 imagens digitais com corante e 105 sem corante foi avaliada em um monitor de computador pelos seis examinadores e classificadas de acordo com três critérios de classificação histológica. Cada uma das avaliações foi repetida pelos participantes para que a reprodutibilidade pudesse ser calculada. Assim, 12 exames independentes foram realizados, com um intervalo de 24 horas entre cada um. Para a análise dos dados, os seis participantes foram divididos em dois grupos: G1: examinadores treinados para avaliação histológica e G2: examinadores sem treinamento para avaliação histológica. Nos resultados, a média dos valores de reprodutibilidade intraexaminador no G1 foram superiores ao G2 em todas as variáveis. A reprodutibilidade intraexaminador foi menor para a técnica sem corante em ambos os grupos. Os valores médios de reprodutibilidade interexaminador no G1 variaram de 0,60 a 0,68 e no G2, os valores variaram de 0,34 a 0,69. Os resultados mostraram diferença estatisticamente significante entre as avaliações dos examinadores treinados e sem treinamento em 29,6% dos casos. Com base nos resultados obtidos no primeiro estudo, pode-se concluir que houve uma melhora no desempenho dos estudantes em detectar in vitro lesões de cárie em superfícies oclusais após ambas as estratégias de treinamento, em especial, quando o elearning foi associado ao ODA, visto que melhorou a relação entre sensibilidade e especificidade, além de contribuir no desempenho dos estudantes na detecção de lesões de cárie em todos os pontos de corte avaliados. A partir dos resultados do segundo estudo, concluiu-se que: (1) o treinamento do examinador parece influenciar na reprodutibilidade das duas técnicas de padrão- ouro estudadas; (2) a reprodutibilidade tende a ser menor quando se faz uso da técnica de padrão-ouro sem corante, independentemente do treinamento do examinador e (3) o critério de classificação histológica não parece ter influência na reprodutibilidade. / The aim of this study was to evaluate learning strategies for the use of ICDAS, as well as gold standard techniques used to validate occlusal caries detection methods. Therefore, two studies were carried out. The aims of the first study were: (1) to evaluate the performance of undergraduate dental students on ICDAS in vitro occlusal caries detection after different learning strategies; and (2) to evaluate the influence of undergraduate dental students training through a digital learning tool on the performance in detecting in vitro occlusal caries lesions using ICDAS. The second study aimed to evaluate the influence of the examiner's training on the reproducibility of two gold standard techniques used for validation of occlusal caries detection methods according to three histological classification criteria. For the first study, sixty-four undergraduate dental students who had no experience in caries detection using ICDAS were selected. Initially, the students performed in vitro examinations of 80 permanent teeth for the occlusal caries detection according to ICDAS using as guide a table describing all the seven scores of this system. All participants were randomly allocated into three groups according to the learning strategy for caries detection using ICDAS: G1 (n = 21): ICDAS e-learning program; G2 (n = 22): ICDAS e-learning program + digital learning tool (DLT); G3 (n = 21): no learning strategy (control). Two weeks later, students from G1 and G2 were trained according their group. After two weeks, all participants reassessed the teeth according to ICDAS. The teeth were prepared for histological validation, in which the evaluation of caries lesions depth was carried out. The results showed that, in the comparison in the groups between before and after the learning strategy, significant higher values of sensitivity and specificity for G1 and G2, of sensitivity for G3 (at D2 thresholds) and in the area under the ROC curve to G2 were observed. The comparison among the groups at each threshold showed that G1 presented higher specificity at the D3 threshold than the other two groups. The sensitivity of G1 at the D2 threshold was lower than G2 and G3. In the second study, a sample of 210 digital images (105 without coloring and 105 with dye enhancing) were selected from 105 permanent teeth, as well as a sample of six dentists (three trained examiners for the histological evaluation of teeth sections and three examiners of the dental area, but without training for histological evaluation). Each of the 105 digital images with dye enhancing e 105 without coloring was evaluated on a computer screen by the six examiners and classified according to three histological classification criteria. Each evaluation was repeated by the participants so that reproducibility could be calculated. Thus, 12 independent exams were performed, with a 24-hour interval. For data analysis, the six examiners were divided into two groups: G1: examiners trained for histological evaluation and G2: examiners without training for histological evaluation. In the results, mean values of intra-examiner reproducibility in G1 were higher than G2 in all variables. Intra-examiner reproducibility was lower for the dyefree technique in both groups. Mean values of inter-examiner reproducibility in G1 ranged from 0.60 to 0.68 and in G2, values ranged from 0.34 to 0.69. The results showed a statistically significant difference between the evaluations of the trained and untrained examiners in 29,6% of the cases. Based on the results obtained in the first study, it can be concluded that there was an improvement in the students' performance in detecting in vitro occlusal caries lesions after both learning strategies, especially when e-learning was associated with a DLT, since it improves the relation between sensitivity and specificity, besides contributing to the students' performance in the caries detection in all the thresholds studied. From the results of the second study, it was concluded that: (1) the training of the examiner seems to influence the reproducibility of both gold standard techniques studied; (2) reproducibility tends to be lower when using the gold standard technique without coloring, regardless of examiner training, and (3) the histological classification criterion does not seems to influence reproducibility.

O objetivo deste estudo foi comparar a concentração de flúor do biofilme dental de indivíduos residenteste em áreas com água fluoretada (AF) ou sal fluoretado (SF) e determinar o efeito do dentifrício fluoretado na concentração de flúor [F] do biofilme dental destes indivíduos. Dezesseis indivíduos resendentes em Montevidéu (SF) e dezesseis indivíduos residentes em Porto Alegre (AF) participaram deste estudo randomizado, cruzado e duplo-cego. Profilaxia dental e raspagem supragengivel foram realizaras antes de cada fase experimental. Durante as fases experimentais (14 dias/cada), os indivíduos escovaram os dentes, 2x/dia, com dentifrício fluoretado (DF) ou dentifrício não-fluoretado (DNF). As amostras de biofilme dental foram coletadas 8 horas após a última escovação. As análises de [F] no biofilme dental foram realizadas com um íon epecífico e as leituras foram convertidas em μgF¯/g de biofilme. Equações de estimativas generalizadas foram aplicadas para analisar a variância de medidas repetidas e as diferenças em cada desfecho. Uma maior [F] no biofilme foi observada na área com SF(2.69±0.10 IC 2.48–2.89) em comparação a área com AF (2.44±0.06 IC 2.32-2.57) quando do uso regular de DNF (p = 0.047). Entretanto, não houve diferença significativa na [F] no biofilme entre as áreas com SF (2.60±0.12 IC 2.37-2.83) e AF (2.81±0.10 CI 2.62-3.01) quando do uso de FD (p = 0.153). Adicionalmente, não foi observada diferença siginifcativa na [F] do biofilme quando DF e DNF foram usados nas áreas com SF (p = 0.294) e AF (p = 0.320). A maior [F] no biofilme observada na área com SF, sob uso regular DNF, pode não ter significância clínica, uma vez que ela desapareceu quando o DF foi usado. / The aim of this study was to compare the fluoride concentration in dental biofilm of subjects living in fluoridated- salt (FS) or water (FW) areas and to determine the effect of fluoride dentifrice on the fluoride concentration [F] in dental biofilm of these subjects. Sixteen individuals residing in Montevideo (FS) and sixteen individuals living in Porto Alegre (FW) participated in this randomized, double-blind, crossover study. Dental prophylaxis and scaling were performed prior to each experimental phase. During the experimental phases (14d/each) subjects brushed their teeth, 2x/day, with fluoridated dentifrice (FD) or non-fluoridated fluoride (NFD). Dental biofilm samples were collected 8 hours after the last toothbrushing. Analyses were performed with a fluoride ion-specific electrode and the reading was transformed into μgF¯/g biofilm. Generalized estimating equations were used to analyze the variance for repeated measures and the differences in each outcome. Higher biofilm [F] was found in FS (2.69±0.10 CI 2.48–2.89) compared to FW (2.44±0.06 CI 2.32-2.57) areas under regular use of NFD (p = 0.047). However, no significant differences were found on dental biofilm [F] between FW (2.60±0.12 CI 2.37-2.83) and FS (2.81±0.10 CI 2.62-3.01) areas under FD use (p = 0.153). Furthermore, no significant difference was observed in the biofilm [F] when FD or NFD were used in the FS (p = 0.294) and FW (p = 0.320) areas. The higher dental biofilm [F] was found in FS areas under NFD use may not have clinical significance once it disappeared when FD was used.

Objetivos: avaliar o papel da Candida albicans (ATCC 90028) no potencial cariogênico e acidogênico de biofilmes in vitro de Streptococcus mutans (UA159). Métodos: biofilmes de dupla-espécie (C. albicans + S. mutans) e de espécie única (S. mutans ou C. albicans) foram cultivados sobre a superfície hígida de blocos de esmalte bovino com dureza inicial conhecida na presença de meio de cultura suplementado com glicose 20 mM e sacarose 3 mM por 24, 48 e 72 horas. O meio foi substituído diariamente e seu pH foi registrado. Blocos de esmalte foram então coletados ao final de cada período experimental e contagens de células viáveis foram realizadas. A desmineralização foi avaliada através da porcentagem de alteração de microdureza superficial (% SMC) e análise de microradiografia transversal (perda mineral integrada e profundidade de lesão). Resultados: o pH do meio de cultura permaneceu constante nos biofilmes de espécie única de C. albicans causando quase nenhuma desmineralização no esmalte. Não houve diferença no potencial acidogênico dos biofilmes de espécie única de S. mutans ao longo dos períodos experimentais sendo estes valores de pH sempre menores quando comparados ao pH relacionado aos demais biofilmes (p < 0.01) A % SMC dos biofilmes de espécie única de S. mutans aumentou significativamente com o tempo. Além disso, lesões de cárie após 72 horas de crescimento de biofilme bacteriano apresentaram maior perda mineral integrada e foram mais profundas do que lesões de cárie relacionadas a biofilmes de dupla-espécie (p < 0.01). O pH do meio de cultura relacionado a biofilmes de dupla-espécie foi baixo no primeiro dia, mas aumentou no decorrer do tempo para valores acima do pH crítico para desmineralização do esmalte. Em consequência, a % SMC permaneceu a mesma depois de 48 horas de crescimento de biofilmes de dupla-espécie e foi significantemente menor do que os valores relacionados a S. mutans em espécie única (p < 0.01). Conclusões: os presentes dados sugerem que a C. albicans apresenta um baixo potencial de desmineralização de esmalte e esse micro-organismo parece reduzir tanto o potencial cariogênico quanto acidogênico de biofilmes de S. mutans pela modulação do pH extracelular durante o crescimento in vitro de biofilmes de dupla-espécie. / Aim: evaluate the role of Candida albicans (ATCC 90028) on the cariogenic and acidogenic potentials of Streptococcus mutans (UA159) in vitro biofilms. Methods: dual-species (C. albicans + S. mutans) and single-species (S. mutans or C. albicans) biofilms were grown on the surface of sound bovine enamel slabs with known baseline hardness in the presence of culture medium supplemented with 20 mM glucose and 3 mM sucrose for 24, 48 and 72 hours. The medium was replaced daily and its pH was recorded. Enamel slabs were collected at the end of each experimental period and counts of viable cells were performed. Demineralization was evaluated through percentage of surface microhardness change (% SMC) and transversal microradiography analysis (integrated mineral loss and lesion depth). Results: spent medium pH remained neutral in C. albicans single-species biofilms causing almost no enamel demineralization. No difference in acidogenic potential of S. mutans single-species biofilms was found among experimental periods and its pH was always lower than pH related to other biofilms (p < 0.01). The % SMC in S. mutans single-species biofilms significantly increased with time. In addition, caries lesions after 72 hours of S. mutans biofilm growth had higher integrated mineral loss and were deeper than caries lesions related to dual-species biofilms (p < 0.01). Spent medium pH related to dual-species biofilms was low in the first day, but increased with time to values above critical pH for enamel demineralization. As a consequence, the % SMC remained the same after 48 hours of dual-species biofilm growth and was significantly lower than S. mutans single-species related values (p < 0.01). Conclusions: the present data suggest that C. albicans has low enamel demineralization potential and may decrease both the cariogenic and acidogenic potentials of S. mutans by modulating extracellular pH during in vitro dual-species biofilm growth.

Este ensaio clinico randomizado controlado avaliou a eficácia do uso da proteção pulpar indireta com cimento de hidróxido de cálcio (HC) ou sistema adesivo universal (AU) num período de seis meses de acompanhamento em lesões profundas de cáries em dentes permanentes após a remoção seletiva de tecido cariado (RSTC). Métodos: Participaram do estudo 48 pacientes, (mediana de idade de 27 anos [distribuição 7-54 anos]), com 41 molares e 15 premolares com lesões profundas de cárie (envolvimento radiográfico ≥50% de profundidade de dentina), sensibilidade pulpar positiva ao teste frio (gás refrigerado, -50°C, Maquira, PR, Brasil), ausência de dor espontânea, sensibilidade negativa aos testes de percussão, ausência de perda cuspídea e ausência de imagem radiográfica sugestiva de lesão periapical (radiografia periapical - VistaScan®). Após a remoção seletiva de tecido cariado para dentina amolecida, o grupo teste do ensaio recebeu um sistema adesivo universal (Universal single bond, 3M Espe, Brasil), enquanto o grupo controle recebeu a proteção pulpar indireta com cimento de hidróxido de cálcio (Dycal, Dentisply, Rj, Brasil). Todos os dentes foram imediatamente restaurados seguindo o condicionamento ácido seletivo em esmalte, aplicação de um sistema adesivo universal (AU) e resina composta nanoparticulada (Filtek Z350, 3M Espe, SP, Brasil). O desfecho de sucesso para vitalidade pulpar avaliou após seis meses: sensibilidade pulpar positiva ao teste frio, ausência de imagem sugestiva de lesão periapical (radiografia periapical - VistaScan®), ausência de dor espontânea e sensibilidade negativa à percussão vertical. Os dados foram submetidos à análise de sobrevida de Kaplan-Meier e teste Log Rank, e as variáveis idade (mediana), gênero, escolaridade, IPV, ISG, CPO-D, CPO-S, número de faces da restauração, tipo do dente, proteção pulpar indireta, profundidade da lesão (≥50% da profundidade da dentina ou ≥75% da profundidade da dentina) e presença de antagonista, quanto as suas distribuições nos dois grupos de tratamento pelos testes qui-quadrado e de Mann-Whitney. Resultados: As taxas de sucesso foram de 93.3% para o grupo controle (HC) e de 95.8% para o grupo teste (AU) (P=0.976). Dois casos de insucesso foram registrados, sendo necrose pulpar (grupo controle) e pulpite (grupo teste). As variáveis analisadas no início do estudo mostram uma amostra igualmente distribuída entre os grupos de tratamento. Nenhuma das variáveis foi relacionada ao insucesso. Os resultados sugerem que não há diferença entre o uso ou não de HC na proteção pulpar indireta após remoção 7 seletiva de tecido cariado em seis meses de acompanhamento, apresentando uma taxa de sucesso alta independente do tratamento. / This randomized controlled clinical trial evaluated the effectiveness of using indirect pulp protection with calcium hydroxide liner (CH) or universal adhesive (UA) over a period of 6 months in deep caries lesions on permanent teeth after selective removal to soft dentin (SCRSD). Methods: The sample consisted of 41 molars and 15 premolars (with radiographic involvement of the inner half of the dentin), from 48 patients, (median age 27 [distribution 7-54 years]), with positive response to cold test (refrigerated gas, -50 °C, Maquira, PR, Brazil), absence of spontaneous pain, negative sensitivity to percussion tests, absence of cuspid loss and absence of radiographic imaging suggestive of periapical lesion (periapical radiography). After the selective removal to soft dentin, the test group received a universal adhesive system (Universal Single Bond, 3M Espe, Brazil) whereas the control group received indirect pulp protection with calcium hydroxide liner (Dycal, Dentisply, Rj, Brazil). All teeth were restored following selective acid condition for enamel, adhesive system (UA) and nanoparticulate composite resin (Filtek Z350, 3M Espe, SP, Brazil). The successful outcome for pulp vitality assessed after six months: positive pulpal sensitivity to the cold test, absence of image suggestive of periapical lesion (periapical radiography - VistaScan®), absence of spontaneous pain and negative response to vertical percussion test. The results were submitted to the Kaplan-Meier survival analysis and the Log Rank test and the variables: age of subjects, gender, schooling, plaque index, gingival bleeding index, DMF-T, DMF-S, number of surfaces involved in the filling, type of the tooth, indirect pulp material, size of lesion (≥50% of dentine or ≥75% of dentine) and antagonist, analyzed for their distribution in the two treatment groups by the tests chi-square and Mann-Whitney. Results: The success rates were 93.3% for the control group (CH) and 95.8% for the test group (UA) (P=0,976). Only two cases of failure were recorded, one pulp necrosis (control group) and pulpitis (test group). The variables analyzed at the beginning of the study show a similarly distributed sample between treatment groups. The results suggest that there is no difference between the use of CH or UA in indirect pulp protection after SCRSD followed by composite restoration at six months of follow-up, showing a high rate of success for both treatments.

Após a exposição da raiz do dente na cavidade bucal, causada por recessão gengival, há uma mudança na microflora existente na região. Micro-organismos se depositam nessa região e formam um biofilme, que se exposto a carboidratos fermentáveis pode levar a uma queda de pH do meio, selecionando micro-organismos ácido-tolerantes e causando uma dissolução dos tecidos minerais e ativação de mecanismos de degradação da matriz orgânica da dentina. A presença de Candida albicans em lesões radiculares vem sendo relatada na literatura de forma controversa, alguns estudos sugerem que a cariogenicidade do biofilme aumenta na presença desse fungo, embora outros sugerem que o fungo levaria a uma neutralização do pH do biofilme por meio de secreção de metabólitos e consumo de ácido lático liberado na matriz do biofilme como resultado da metabolização de carboidratos. Frente ao exposto, o objetivo desse estudo foi avaliar o potencial cariogênico de biofilmes contendo Candida albicans em relação à dentina radicular. Discos de dentina radicular foram obtidos de raízes de dentes bovinos e tiveram sua microdureza de superfície inicial determinada. Foi realizado então um experimento in vitro nos quais os blocos de dentina foram aleatorizados em 3 grupos para cultivo de biofilme como se segue: Grupo 1 – biofilme monoespécie de S. mutans (SM); Grupo 2 – biofilme monoespécie de C. albicans (CA); e Grupo 3 – biofilme dualespécies de S. mutans + C. albicans (MIX). Os biofilmes foram cultivados na superfície dos blocos de dentina durante 24, 48 e 72 horas. pH do meio de cultura dos biofilmes foi aferido a cada 24 horas. Biofilmes foram coletados da superfície de seis blocos de dentina após cada um dos tempos acima descritos e a contagem de células viáveis foi determinada. Além disso, após cada período de formação de biofilme, os mesmos blocos de dentina tiveram sua microdureza de superfície medida novamente para determinação da porcentagem de perda de dureza de superfície (%PDS) e duas amostras de cada grupo/tempo foram submetidas a coloração histológica PicroSirius Red para determinação da porcentagem de colágeno estruturado na matriz orgânica da dentina desmineralizada. Os experimentos foram realizados em triplicata e os dados foram analisados por ANOVA de duas vias seguido de teste de Bonferroni ao nível de significância de 5%. Em relação aos resultados, independentemente da composição microbiana do biofilme, houve maior %PDS em biofilmes formados durante 48 e 72h em comparação aos biofilmes formados por 24 horas. Em relação à composição microbiana do biofilme, observou-se que a %PDS no biofilme de SM foi estatisticamente maior que na presença do biofilme MIX, que por sua vez foi maior que aquela encontrada na presença de biofilme CA. Os resultados mostraram ainda que os valores de pH do meio de cultivo dos biofilmes MIX foram estatisticamente maiores do que os valores encontrados na presença de biofilme SM nos tempos de 48 e 72 horas (p<0,05). Em relação à análise orgânica da dentina, os resultados sugerem que há uma maior tendência para manutenção de colágeno estruturado em biofilmes contendo CA do que em relação aos biofilmes de SM e de MIX. Nossos resultados sugerem que embora a C. albicans apresente potencial cariogênico para dentina radicular, o biofilme contendo C. albicans associada ao S. mutans parece apresentar um menor potencial cariogênico quando comparado aos biofilmes cultivados na ausência deste fungo. / After root exposure on the oral cavity, caused by gingival recession, a shift in the site microflora occurs. Deposits of microorganisms turn in to a biofilm in the root surface, which if exposed frequently to fermentable carbohydrates may lead to a pH drop on the biofilm matrix, selecting acid tolerant microorganisms causing solubilization of the mineralized tissues and the activation of dentin organic matrix degrading system. Candida albicans presence in root caries has been debated on the literature, some studies suggest that the cariogenicity of the biofilm increases on the fungus presence, although some others have said that the fungus would lead to a biofilm pH neutralization by releasing some metabolites and lactic acid consumption, the acid released on the biofilm matrix as a product of the carbohydrates metabolization. Therefore, the aim of this present study was to evaluate the cariogenic potential of biofilms containing C. albicans in relation to root dentin. Dentin root slabs were obtained from root of bovine teeth and its surface microhardness was accessed. An in vitro trial was performed, by randomizing the slabs in 3 groups: Group 1 – mono-species S. mutans biofilm (SM), Group 2 – monospecies C. albicans biofilm (CA) and Group 3 - dual-species S. mutans and C. albicans biofilm (MIX). The biofilms were grown at the dentin slab surface in 24, 48 and 72. The pH of the culture medium was checked every 24 hours. Biofilms were collected from the surface of six dentin slabs after each time as described above and the CFU/mL counts were determined. Additionally, after each time of biofilm growth, the surface microhardness of the samples was measured again to calculate the surface hardness loss percentage (%SHL) and, also, two samples of each group/time were sent to histological stain by PicroSirius Red to determine the percentage of structured collagen on the organic demineralized dentin. Each trial was performed three times and the data was analysed by Two-Way ANOVA, followed by Bonferroni test, with a significance level of 5%. As related to the results, irrespective from the microbial composition of the biofilm, a higher %SHL was observed in biofilms growth in 48 and 72 hours when compared to the biofilms growth in 24 hours. Regarding the microbial composition of the biofilm, it was observed that the %SHL at the SM biofilm was statistically higher than in the presence of the MIX biofilm, which was also higher than the one found at the CA biofilm. The results also show that the pH values of the culture medium in MIX biofilms were statistically higher than those found in the presence of SM biofilms at 48 and 72 hours (p<0,05). Related to the organic analysis of the dentin, the results suggest that there is a higher tendency to structured collagen maintenance in CA biofilms when compared to the SM and MIX biofilms. Our results suggest that, although C. albicans has a cariogenic potential related to root dentin, the biofilm containing C.albicans associated to S. mutans seems to present a lower cariogenic potential when compared to biofilms growth without this fungus.

Objetivos: O objetivo geral desta tese foi estudar o comportamento clínico da cárie dentária em superfícies oclusais de molares permanentes. Ela é composta por três estudos cujos objetivos específicos foram: (1) Avaliar a acurácia e reprodutibilidade de um índice visual para o registro do acúmulo de biofilme em superfícies oclusais; (2) Avaliar o efeito independente do acúmulo de biofilme e do estágio eruptivo na atividade de cárie em superfícies oclusais de molares permanentes; e (3) Comparar as taxas de incidência/progressão de cárie em superfícies oclusais hígidas e lesões cariosas inativas bem como avaliar o risco de progressão de cárie nestas superfícies. Metodologia: Avaliou-se visualmente o acúmulo de biofilme nas superfícies oclusais de 80 molares permanentes de acordo com os escores a seguir: 0 = sem biofilme visível; 1 = biofilme dificilmente detectável nas fossas e fissuras; 2 = biofilme facilmente detectável nas fossas e fissuras; 3 = superfície oclusal parcialmente ou totalmente coberta por biofilme espesso. As avaliações clínicas foram executadas três vezes, sem uso de evidenciador no primeiro e no segundo exames e usando fucsina a 7% na terceira observação. Reprodutibilidade intra-examinador, sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivo e negativo e acurácia foram calculados, utilizando o exame com fucsina como o padrão ouro. Estas medidas diagnósticas foram calculadas para cada escore do índice original e para o índice dicotomizado de acordo com a presença de biofilme espesso (0 + 1 versus 2 + 3). Na linha de base, 298 escolares entre 6 e 15 anos tiveram seus molares permanentes examinados com relação ao estágio de erupção (1 = superfície oclusal parcialmente erupcionada; 2 = superfície oclusal totalmente erupcionada e mais da metade da superfície vestibular coberta por tecido gengival; 3 = superfície oclusal totalmente erupcionada e menos da metade da superfície vestibular coberta por tecido gengival; 4 = dente em oclusão funcional), acúmulo e localização de biofilme, conforme o critério descrito anteriormente e presença e localização de lesões cariosas ativas nas superfícies oclusais. Para ser incluído no estudo longitudinal, os escolares deveriam ser classificados como cárie-inativos e apresentar pelo menos um molar permanente hígido e um molar permanente com lesão cariosa inativa (n=258). Após 12 meses, novo exame clínico foi realizado conforme o exame inicial (estágio de erupção, acúmulo de biofilme, presença de cárie ativa). Em ambos os exames, a exata localização das lesões cariosas foram registradas em esquemas das superfícies oclusais a fim de garantir o monitoramento da mesma lesão ao longo do tempo. A análise estatística utilizou equações de estimativas generalizadas com ligação logística tendo em vista a presença de dados aglomerados. Odds ratio (OR) e seus respectivos intervalos de confiança de 95% (IC 95%) foram estimados. As taxas de incidência/progressão de cárie em superfícies oclusais hígidas e lesões cariosas inativas foram comparadas através do teste do qui-quadrado. Resultados: As análises repetidas demonstraram que o índice avaliado é reprodutível (k=0.8). A dicotomização a partir da presença ou ausência de biofilme espesso obteve sensibilidade, especificidade, acurácia e valores preditivos positivo e negativo ≥ 0.95. Foi observada uma associação significativa entre atividade de cárie e estágio eruptivo de molares permanentes. Ajustado para o acúmulo de biofilme, os molares em erupção apresentaram um risco de apresentar lesões cariosas ativas significativamente maior do que os molares em oclusão funcional (estágio eruptivo 1, OR=63,3, IC 95%=22-183,7; estágio eruptivo eruptivo 2, OR=14,9, IC 95%=7,1-31,2; estágio eruptivo 3, OR=4,1, IC 95%=2-8,4). Ajustado para o estágio eruptivo, os dentes com biofilme facilmente detectável foram mais suscetíveis à atividade de cárie do que os dentes sem biofilme visível (grau 2, OR=5,5, IC 95%=2,5-12,3; grau 3, OR=14,5, IC 95%=6,5-32,4). No estudo longitudinal, 200 escolares foram reexaminados após 12 meses (taxa de perda de 22,5%). Foram encontradas pequenas taxas de progressão das lesões cariosas inativas (3,9%) e incidência nas superfícies hígidas (2,6%) ao longo de 12 meses, não tendo sido encontrada diferença entre os grupos (qui-quadrado, p=0,48). Ajustado para o acúmulo de biofilme, estágio eruptivo, tipo de molar e arco, as lesões cariosas inativas apresentaram um risco à progressão similar às superfícies oclusais hígidas (OR=0,98, IC 95%=0,40-2,38). A presença de biofilme facilmente detectável (graus 2 + 3) na superfície oclusal foi o único preditor da incidência e progressão de cárie após 1 ano (OR=2,73, IC 95%=1,01-7,41). Conclusões: Acúmulos de biofilme em superfícies oclusais de molares permanentes podem ser visualmente avaliados de modo acurado e reprodutível. O uso de um corante evidenciador pode não ser necessário. O período de erupção dos molares permanentes pode ser visto como um período de risco para o desenvolvimento de lesões cariosas ativas em crianças e adolescentes. Superfícies oclusais com lesões cariosas inativas não requerem atenção adicional àquela normalmente dispensada às superfícies oclusais hígidas em um período de 12 meses. / Objectives: The general aim of this thesis was to study the clinical behavior of dental caries on the occlusal surfaces of permanent molars. It is composed by three studies whose specific aims were: (1) To assess the accuracy and reproducibility of a simplified, visual index to assess biofilm accumulation on occlusal surfaces ; (2) To estimate the independent effects of biofilm accumulation and eruption stage on the occurrence of active caries lesions on occlusal surfaces of permanent molars; and (3) To compare caries incidence and progression on sound occlusal surfaces and on surfaces presenting inactive enamel lesions as well as to estimate the risk of caries progression on these surfaces. Methods: Biofilm accumulation on occlusal surfaces of 80 permanent molars was visually assessed and scored as follows: (0) no visible biofilm; (1) hardly detectable biofilm, restricted to grooves and fossae; (2) biofilm easily detectable in grooves and fossae; and (3) occlusal surface partially or totally covered with heavy biofilm accumulations. Clinical examinations were performed three times, using no detector dye in the first and second examinations, and using 7% fuchsine in the third examination. Intra-examiner reproducibility, sensitivity, specificity, positive and negative predictive values, and accuracy were calculating using the examination with fuchsine as the gold standard. These diagnostic measures were calculated for each biofilm score and for the dichotomized index according to the presence of thick biofilm (0 + 1 versus 2 + 3). At baseline, 298 6-15-year-old schoolchildren had their permanent molars examined in regards to stage of eruption (1 = the occlusal surface partially erupted; 2 = the occlusal surface fully erupted, but more than half of the tooth facial surface was covered with gingival tissue; 3 = the occlusal surface fully erupted, and less than half of the tooth facial surface was covered with gingival tissue; 4 = full occlusion), occurrence and localization of occlusal plaque as previously described, and occurrence and localization of occlusal caries. To be included in the study, children should present a status of caries-inactive dentition with at least one permanent molar with sound occlusal surface and another permanent molar with inactive occlusal enamel lesion (n=258). After 12 months, clinical examination was repeated according to the baseline examination (stage of eruption, plaque accumulation, and active occlusal caries). In both examinations, the exact localization of occlusal caries was detailed mapped on standardized drawings of the occlusal groove-fossa-system in order to assure that the same lesion would be monitored over time. Statistical analysis was performed using generalized estimating equations with a logistic link function due to the clustering of data. Odds ratio (OR) and their respective 95% confidence intervals (95% CI) were estimated. The proportion of new caries lesions or lesions that progressed on sound occlusal sites and on sites presenting inactive enamel lesions was compared using the Chi-square test. Results: Repeated analysis showed that the index under study is reproducible (k=0.8). It was observed a significant association between stage of eruption and active caries on permanent molars. Adjusted for biofilm accumulation, molars under eruption were at an increased risk for active caries than molars in full occlusion (stage of eruption 1, OR=63.3, IC 95%=22-183.7; stage of eruption 2, OR=14.9, IC 95%=7.1-31.2; stage of eruption 3, OR=4.1, IC 95%=2-8.4). Adjusted for stage of eruption, teeth with easily detectable biofilm were more susceptible to caries activity than those without visible biofilm accumulation (score 2, OR=5.5, 95% CI=2.5-12.3; score 3, OR=14.5, 95% CI=6.5-32.4). At the longitudinal study, 200 schoolchildren were followed (dropout rate of 22.5%). It was observed low rates of lesion progression in inactive enamel lesions (3.9%) and sound surfaces (2.6%), with no difference between them (chi-square test, p=0.48). Adjusted for plaque, stage of eruption, type of molar and dental arch, inactive enamel lesions presented a similar risk for caries progression than sound occlusal surfaces (OR=0.98, 95%CI=0.40-2.38). The presence of easily detectable plaque (scores 2 + 3) on occlusal sites was the only predictor for caries incidence and progression after 1 year (OR=2.73: 95% CI 1.01-7.41). Conclusions: Biofilm accumulation on occlusal surfaces of permanent molars can be visually assessed in an accurate and reproducible way. The use of a detector dye may not be necessary. The stage of eruption of permanent molars can be regarded as a risk period for active caries in children and adolescents. Occlusal surfaces harboring inactive caries lesions do not require additional attention than the one normally given to sound occlusal surfaces over a 12-months period.

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:22:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003-08-08. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:28:49Z : No. of bitstreams: 1 000209033.pdf: 3006947 bytes, checksum: e0f461b5643caabba97c18e5683c7dda (MD5) / O objetivo deste estudo in vitro foi analisar ao microscópio de luz polarizada o comportamento do esmalte decíduo adjacente a quatro materiais restauradores, após um desafio desmineralizante. Foram realizados preparos cavitários de Classe V nas faces vestibulares de quarenta molares decíduos hígidos, os quais foram aleatoriamente divididos em quatro grupos experimentais (n=10) de acordo com os seguintes materiais: uma resina composta modificada por poliácidos (Dyract AP), uma resina composta híbrida (Z-250), um cimento de ionômero de vidro modificado por resina (Vitremer) e um cimento de ionômero de vidro convencional (Fuji IX GP Fast). Após o polimento das restaurações, os espécimes foram impermeabilizados e submetidos a um desafio desmineralizante representado pela imersão dos espécimes em gelatina acidificada (pH4,5) em temperatura ambiente por 14 dias. Após este período, os espécimes foram incluídos em resina e seccionados longitudinalmente obtendo-se secções de 100µm de espessura, que foram embebidas em água destilada para análise ao microscópio de luz polarizada. Os resultados obtidos revelaram formação de lesões artificiais de cárie em todos os grupos e os valores de profundidade da lesão externa, obtidos por meio de análise histomorfométrica, foram submetidos aos testes estatísticos de Kruskal-Wallis e Dunn (5%) constatando-se que o grupo do cimento de ionômero de vidro exibiu profundidade da lesão externa significantemente menor do que o grupo restaurado com resina composta. Concluiu-se que a desmineralização do esmalte decíduo pode ser influenciada pelo uso de diferentes materiais restauradores / The aim of this in vitro study was to evaluate by polarized light microscopy the development of artificial carious lesions in primary teeth adjacent to different restorative materials. Buccal class V restorations were prepared in 40 deciduous human molars with margins in enamel which were ramdonly divided into four groups (n=10): a poliacid modified resin composite (Dyract AP); a hybrid resin composite (Z-250); a resin-modified glass ionomer cement (Vitremer) and a conventional glass ionomer cement (Fuji IX GP Fast). After the restorative procedures, all teeth surfaces were coated with nail polish, except for the restoration area and 1 mm rim of tooth structure. ln order to induce artificial carious lesions, the specimens were immersed into an acidified gel (pH 4,5) for 14 days at room temperature. After this, the specimens were prepared for polarized light microscopy in an imbibition's media of water. The results showed the development of caries lesions in all groups. The data was analysed by Kruskal-Wallis and Dunn's test (5%) and the specimens restored with glass ionomer cement exhibited- the depth of caries significantly lower than the group restored with composite resin. lt was concluded that the restorative material can influence the demineralization of primary enamel