Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La membrana de la cáscara de huevo (MCH) es una red de biopolímeros, esencialmente organizada por 2 capas de fibras entrecruzadas de proteínas (una externa y otra interna) que tienen flexibilidad en solución acuosa y son permeables al agua y a los gases. Aquí se utilizó como una bioplataforma para la inmovilización de la enzima rennina. En este estudio, la rennina se inmovilizó sobre la capa externa de la membrana de cáscara de huevo a través de adsorción por atrapamiento y luego fue tratada con glutaraldehido como agente reticulador. También se evaluó el efecto por separado de la rennina sola en ambas capas de la membrana, la rennina directamente en la leche, el glutaraldehido sobre la membrana, el glutaraldehido directamente en la leche, la membrana sola en la leche y la leche sola. Para evaluar el efecto de inmovilización enzimática se pesó el producto de la coagulación de la caseína (cuajo y suero). Se puedo observar que hubo presencia de cuajo y suero en tres casos, a saber: cuando la rennina se añadió sobre la membrana, la rennina más glutaraldehido sobre la membrana y la rennina directamente en la leche. Sin embargo no se puedo determinar si la cantidad neta de la enzima es diferente en los tres casos. Paralelamente, se reutilizó una membrana con la rennina más glutaraldehido y una membrana solo con rennina durante diez veces consecutivas, en la reutilización 9º y º10º de ambas membranas se observó una baja de pH a 4,5 logrando una coagulación ácida de la leche / Financiamiento: Proyecto Fondecyt No. 1120172 y 1150681

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Con el continuo crecimiento de la población mundial, la constante preocupación por el bienestar animal y la apertura de los mercados internacionales, la industria avícola se ha visto en la obligación de reducir sus costos al máximo para así poder entregar un producto lo más económico posible al consumidor, sin descuidar la calidad del mismo. Esta disminución de costos no puede llevarse a cabo a través del aumento en la densidad de las aves por jaula, lo que implica un menor bienestar, ya que la legislación es cada día más exigente al respecto. Es por esto, que se hace indispensable minimizar los costos de producción y uno de ellos son las pérdidas producidas por la ruptura de la cáscara del huevo. El proceso de biomineralización de la cáscara del huevo es realizado por poblaciones celulares especializadas del oviducto, que actúan como una línea de ensamblaje a medida que el huevo avanza a través de éste. Esta biocerámica resulta de la interacción controlada entre una fase orgánica y una inorgánica. Estructuralmente la cáscara del huevo está constituida por cuatro capas, las cuales del interior al exterior son: capa de las membranas de la cáscara, capa mamilar, capa en empalizada, capa cuticular. Durante su formación, la cáscara del huevo es altamente susceptible a ser alterada por diversos factores, entre ellos el estrés. Los factores estresantes son responsables de una serie de defectos en la calidad de la cáscara del huevo que disminuyen su valor comercial e incluso pueden llevar a la perdida total en algunos casos. Desde hace muchos años diversos autores han evaluado la calidad de la cáscara del huevo tomando en consideración diversas características, distintas condiciones ambientales y usando una gran variedad de técnicas tanto directas como indirectas. Para el presente estudio se utilizaron gallinas White Leghorn, las cuales fueron divididas en subgrupos e inyectadas con 1 mg de adrenalina por vía subcutánea a distintas horas post ovipostura para evaluar el efecto del estrés adrenérgico sobre la calidad de la cáscara del huevo. Las características evaluadas fueron resistencia y espesor de la cáscara con y sin membranas, las cuales se compararon mediante una prueba de t de dos colas. Mediante microscopía electrónica de barrido se analizó la ultraestructura de estas cáscaras de huevo. El análisis de los resultados muestra que no existe diferencia estadísticamente significativa entre el grupo tratado y el control, tanto para resistencia a la compresión mecánica como para el espesor de la cáscara con y sin membranas, sin embargo al realizar un estudio ultraestructural de las cáscaras de los huevos de las gallinas que efectivamente respondieron al tratamiento con adrenalina se observaron diversas alteraciones que explicaban su baja resistencia y espesor de cáscara. Esta falta de diferencia significativa podría deberse a la gran variación individual que existe en la respuesta al tratamiento y en el tiempo de recuperación. No obstante lo anterior el análisis ultraestructural mostró que las alteraciones observadas, como presencia de cuerpos A y B, confluencia de mamilas, líneas de fractura, columnas de distinto grosor y tamaño, alteraciones en las membranas de la cáscara, presencia de cristales de calcita entre las columnas, concordaban con el tiempo post ovipostura en que las gallinas eran tratadas y la estructura del huevo que estaba en formación. Niveles de estrés agudo, comparables a los producidos por la administración de adrenalina, se producen al disturbar a las gallinas por incursiones no habituales de personal, aves silvestres u otros animales en los galpones de postura. / Proyecto Fondap 11980002

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Los tejidos duros de animales y humanos contienen aproximadamente entre un 70 a un 90% de su peso total de una fase inorgánica conocida como apatita biológica. Los materiales sustitutos de hueso más destacados presentes hoy en día, corresponden a cerámicas de fosfato de calcio sintéticos en base a hidroxiapatita (HAp) o fosfato β-tricálcico, debido a que la composición química de estas cerámicas está muy relacionada con la del mineral óseo, lo que conduce a una buena biocompatibilidad en contacto con hueso. El objetivo de este trabajo fue la obtención de HAp porosa a partir de cáscaras de huevo y tunicina, una celulosa obtenida a partir de tunicados. La síntesis de HAp se realizó en solución con tunicina, carbonato de calcio y ácido fósforico, respetando la relación estequeométrica Ca:P de 1,67. Tanto la tunicina como la HAp fueron caracterizadas mediante SEM y XRD. Por otra parte, la tunicina se extrajo mediante hidrólisis con ácido clorhídrico, siendo caracterizada como fibras individuales, flóculos y varillas fabricadas en seco y en medio líquido. El resultado obtenido de la síntesis fue prensado a 10.000 toneladas a fin de formar un compósito. La caracterización del compósito se realizó mediante SEM. Luego se calcinó a 1200 ºC para producir HAp porosa. Se realizó SEM, XRD, FT-IR, mediciones del área BET y pruebas de resistencia mécanica y deformación. La caracterización mediante SEM y área BET arrojó un tamaño de poros adecuado para osteoconducción, superior a 200 μm, siendo el mínimo necesario 100 μm, las fibras de tunicina se caracterizaron individualmente, como varillas producidas tanto en agua como en seco mediante fricción, resultando el último método aquel que entrega tamaños de fibras más adecuados para la formación del compósito. Tanto los resultados del XRD presentaron los principales picos de la HAp (2θ: 11,59; 29,30) y FT-IR, en donde se encuentran las longitudes de onda típicas (3570 cm-1 para los grupos hidroxilos y 1090 cm-1, 1043 cm-1, 961 cm-1, para los grupos fosfatos y carbonatos), avalan la formación de HAp a partir de la cáscara de huevo. No sólo la HAp y la tunicina fueron caracterizadas por XRD, también se realizó con muestras de cáscara de huevo y cáscara calcinada. Las mediciones de resistencia mecánica se realizaron a las distintas cerámicas de HAp porosas en las que se utilizó o no gelatina, con una concentración de 70 % HAp y 30 % tunicina u 80 % HAp y 20% tunicina, resultando diferencias entre los distintos tratamientos para la resistencia (promedio para las muestras con gelatina arrojó una media de 439,5 ± 237,85 g, mientras que las muestras sin gelatina la media fue de 544 ± 208,96 g con un CV = 38,456, considerando la relación HAp/Tunicina, se desprende para el grupo 70/30 una media de 298,75 ± 74,91 g, mientras que para las muestras 80/20 la media es 684,75 ± 50,77 g siendo el valor de p = <0,0001), pero no para la deformación (promedio con gelatina de 0,36 mm ± 0,06 y sin gelatina de 0,41 ± 0,09 mm; proporción de 70/30 de 0,37 ± 0,05 mm y proporción de 80/20 de 0,39 ± 0,10 mm siendo el valor de p = 0,6633). En tanto los ensayos con análisis volumétrico de adsorción o área BET (área superficial), no mostraron diferencias para los mismos tratamientos (p = 0,8126). Estos resultados comprueban la factibilidad de la síntesis, mediante tunicina e HAp, de una cerámica porosa que pueda ser utilizada como implante ya que cumple los requisitos mínimos de diámetro para osteoconducción y biocompatibilidad

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El objetivo del presente estudio fue caracterizar la calidad de cáscara del huevo blanco en planteles avícolas comerciales en Chile y su relación con determinados factores de producción, para lo que se realizó un muestreo entre los 10 principales productores de huevos del país. A cada empresa participante se le solicitó muestras de huevos provenientes de aves de diferentes edades, los que fueron evaluados respecto a su peso y resistencia y espesor del cascarón. Además, se evaluó la conchuela utilizada como fuente de calcio en la dieta de las ponedoras en los distintos planteles, en cuanto a su granulometría y contenido de calcio. Como resultado se obtuvo que el peso del huevo aumentó según la edad de las aves, mientras que la resistencia de sus cáscaras disminuyó de manera constante. El espesor de cáscara se mantuvo estable con el incremento de la edad en las diferentes empresas. Se evaluaron las relaciones entre el promedio de todos los planteles participantes para las distintas variables por medio de regresiones lineales y coeficientes de correlación. Se determinó además que los componentes con mayor injerencia sobre la resistencia de la cáscara son su espesor y la edad de las aves de forma conjunta. En cuanto a la granulometría de conchuela se obtuvo que ninguno de los productores participantes cumple con los requerimientos propuestos por los manuales de las líneas genéticas utilizadas; no obstante, fue posible concluir que el contenido de calcio de la conchuela es relativamente estable entre las muestras otorgadas por las distintas empresas. / The aim of this study was to characterize the quality of the white shell egg in commercial poultry establishments in Chile and its relationship to certain factors of production, for which a sampling among the top 10 egg producers in the country was performed. Each participating company was requested to provide samples of eggs from hens of different ages, which were evaluated for weight and strength and thickness of the eggshell. In addition, the oyster shell used as a source of calcium in the diet of laying hens in various enterprises, in terms of particle size and calcium content was evaluated. The resulting data showed that egg weight increased along with the age of the birds, while the strength of their shells fell steadily. The eggshell thickness remained stable with increasing age across different companies. The relationship between the average of all participating establishments for different variables by linear regression and correlation coefficients were evaluated. It was further determined that the components with greater influence on the eggshell strength are its thickness, as well as the age of the hens together. As for the oyster shell particle size, was found that none of the participating egg producers meet the requirements proposed by the manuals of genetic lines used. However, it was possible to conclude that the calcium content of the oyster shell is relatively stable between samples given by the different companies.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El tejido óseo está constituido por células especializadas, matriz orgánica y fase mineral. Es dinámico ya que está en constante renovación y es uno de los pocos tejidos del organismo capaz de regenerar tras una lesión. Por otro lado, existen patologías óseas como el Radius curvus y la displasia de cadera, entre otras, en cuyos tratamientos se requiere realizar una ostectomía, es decir, retirar un trozo de hueso con el fin de retardar la regeneración ósea. Pero, estos tienen la desventaja de ser muy invasivos, convirtiéndose en procedimientos agresivos, aumentando las posibilidades de infección, inflamación, dolor y lenta recuperación del paciente. Con la finalidad de evitar el uso de este método y mejorar las técnicas quirúrgicas actualmente utilizadas para solucionar estas patologías osteoarticulares, se utilizó la membrana de cáscara de huevo de gallina como material inhibidor de la regeneración ósea. La membrana de cáscara de huevo está constituida por colágeno tipo I, V y principalmente por colágeno tipo X, al cual se le atribuye el rol inhibidor de la mineralización. Los resultados de las evaluaciones de los implantes de membrana de cáscara de huevo tanto en tejido subcutáneo como hueso ulnar, indican que la membrana implantada no es reabsorbida ni presenta respuesta a cuerpo extraño hasta por lo menos la octava semana. La reacción inflamatoria y la fibrosis se van incrementando con el transcurso de las semanas hasta producirse reacción de rechazo ya alcanzada la décimo sexta semana. Se observó escasa o nula neoformación ósea en las muestras implantadas. Se sugiere que la membrana de cáscara de huevo es capaz de inhibir la regeneración ósea / PROYECTO FONDAP 11980002

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La membrana de la cáscara de huevo (MCH) es una red de biopolímeros, esencialmente formada por 2 capas de fibras entrecruzadas de proteínas (una externa y otra interna) que tienen flexibilidad en solución acuosa y son permeables al agua y a los gases. En el presente trabajo se utilizó MCH como una bioplataforma para la inmovilización de la enzima Anhidrasa Carbónica (AC). La enzima AC se inmovilizó sobre la capa externa de la membrana de cáscara de huevo a través de dos métodos: adsorción por atrapamiento y reticulado, usando glutaraldehido como agente reticulador. Paralelamente se usó AC en solución (1 mg de enzima anhidrasa carbónica de 2500 unidades/mg (SIGMA) en 1 mL de agua desionizada). Se compararon estas dos variables junto a un control con MCH sin tratamiento. Para evaluar el efecto de la inmovilización se ocupó SEM, para observar la morfología, tamaño y número de los cristales depositados. De esta forma se pudo observar que el depósito de cristales de calcita fue mayor en presencia de AC inmovilizada, versus AC en solución. Al igual que el tamaño y la morfología de estos. En AC se observaron calcitas con bordes lisos y regulares, en contraste con los cristales modificados encontrados con AC en solución. / The eggshell membrane (MCH) is a network of fibrous biopolymers, essentially formed by two layers of protein fibers (an external and an internal one), flexible in aqueous solution and showing water and gas permeability. MCH was used in the present work as a bio platform for immobilizing carbonic anhydrase (CA) enzyme. The CA enzyme was immobilized on the outer layer of the egg shell membrane using two methods: adsorption by entrapment and crosslinked using glutaraldehyde as crosslinking agent. Parallel CA was used in solution (1 mg of carbonic anhydrase enzyme 2500 units / mg (Sigma) in 1 mL of deionized water). These two variables were compared with untrated MCH as control. To evaluate the effect of immobilization SEM was used to observe the morphology, size and number of deposited crystals. Thus it was observed that the deposit of calcite crystals was higher in the presence of immobilized CA, compare with CA in solution. Same for size and morphology of these. In MCH with CA immobilized. Calcite crystal were observed with smooth and regular edges, in contrast whit the modified crystals found in CA in solution. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1120172 y 1150681

Los hongos son fuente de alimento y medicina desde tiempos remotos. Por su valor nutracéutico y como fuente de nutricéuticos se han utilizado para mantener y mejorar la salud, preservar la juventud y promover la longevidad. También son fuente de compuestos químicos bioactivos útiles para la preparación de productos farmacéuticos. De las 700 especies de hongos comestibles investigadas, sólo unos 50 hongos tienen valor medicinal y entre ellos Grifola frondosa es uno de los más notables e investigados, especialmente como estimulador del sistema inmune y por sus propiedades antitumorales en la lucha contra el cáncer. En los bosques andino patagónicos de Argentina y Chile existen dos representantes del género Grifola: G. gargal Singer y G. sordulenta (Mont.) Singer, para los cuales no se ha investigado suficientemente sobre su biología y por lo tanto no se ha desarrollado aún una tecnología apropiada para su cultivo, como tampoco se han hecho estudios sobre sus posibles propiedades medicinales y aplicaciones no solo terapéuticas sino también biotecnológicas. Por ello se investigó la factibilidad de cultivarlos en condiciones controladas y a su vez se profundizó en el conocimiento de distintos aspectos biológicos de interés. Por otra parte, la actividad medicinal hallada en políporos y en especial en Grifola frondosa apoya la formulación de la hipótesis que plantea también la presencia de actividad antioxidante y/o antigenotóxica en estas especies. La confirmación de tales propiedades es necesaria para sostener más investigación sobre su uso medicinal y resulta de importancia en la propuesta de posibles variedades de productos a partir de ellos, lo cual otorgaría un plus como valor agregado de estos hongos. Para comprender aún más las condiciones de crecimiento de estas especies se realizaron cuatro campañas recorriendo diferentes bosques de robles del Parque Nacional Lanín. Allí, con la ayuda de residentes del lugar y micólogos, se pudieron recolectar fructificaciones sólo en determinados lugares, así como también se tomaron datos de las colonias en crecimiento y muestras de G. gargal causando podredumbre. Asimismo, se aislaron dos cepas (cepa B y G9) de G. gargal, una proveniente de un árbol en pie y otra tomada de un roble caído que llevaba más de 20 años produciendo fructificaciones. La historia de los bosques de roble, informada por otros autores, revela que durante la última glaciación fueron fragmentados y en consecuencia se desarrollaron procesos de variabilidad genética entre los mismos. Algunas de estas variables son el contenido y calidad de ciertos compuestos polifenólicos los cuales se sabe que son importantes en la biología de los hongos degradadores de la madera. En consecuencia esto indicaría una variabilidad entre cepas de los diferentes bosques de robles para G. gargal. Dos cepas, correspondientes a G. gargal (cepa A) y G. sordulenta, fueron obtenidas del Centro de Investigación y Extensión Forestal Andino Patagónico (CIEFAP). Hallar las condiciones óptimas en la producción de micelio y cuerpos fructíferos es un paso fundamental para la producción optimizada de los compuestos con valor nutricional, y como fuente de nutricéuticos y fármacos hipotéticamente presentes en estos hongos. El análisis del crecimiento micelial de G. gargal y G. sordulenta en agar nutritivo reveló que para ambas especies, las mejores condiciones de cultivo fueron pH 4, 18ºC y medio de cultivo MYPA 16 suplementado con 0,4% de cáscara de girasol en polvo. Así, fue posible disminuir el tiempo para la obtención de inóculo de excelente calidad y el cultivo de las cepas en este medio fue posteriormente utilizado en forma rutinaria para su mantenimiento y para su uso como inóculo. Los resultados presentados fueron analizados por una posible pérdida de vigor (luego de tres años de subcultivos) y se halló que ambas cepas no perdieron vigor y que además hubo una mejora en la velocidad de colonización por G. sordulenta y ello se puede explicar por haber desarrollado una adaptación a los ingredientes del medio, concluyendo que las condiciones de rutina empleadas fueron adecuadas para conservar su vigor por más de 12 subcultivos. El aumento en contenido de polvo de cáscara de girasol no modificó la velocidad de colonización de la cepa A de G. gargal por lo que no se justifica su aumento en el medio de cultivo por encima del 0,4 % para esta especie; no se encontraron diferencias en la velocidad de colonización entre las cepa A, B y G9. Usualmente se observa en el stock de cepas de los laboratorios de micología que algunas cepas producen primordios y/o verdaderos cuerpos fructíferos un tiempo después que son almacenadas. Esto llevó a utilizar este método de cultivo in vitro en condiciones controladas para dilucidar los procesos que subyacen en la morfogénesis fúngica, i.e.: la diferenciación del micelio vegetativo a micelio reproductivo. Las observaciones realizadas con lupa y microscopio a G. frondosa, G. gargal y G. sordulenta, fueron comparadas con las observaciones realizadas por otros autores en la bibliografía hallándose algunas diferencias de importancia taxonómica en cuanto a velocidad de crecimiento, morfología de las colonias, cambios de coloración en el medio de cultivo y tipo de degradación de compuestos fenólicos, estudiada in vitro. El aspecto al microscopio de las hifas generativas, gloeopleuras, esqueletales, presencia de clamidosporas y estructuras cristaloides, también en comparación con las observaciones de otras investigaciones, indicó algunas diferencias que permiten conocer mejor la variabilidad entre cepas de estas especies. El estudio de las formaciones morfogénicas in vitro de G. gargal y G. sordulenta fue útil para detectar cambios producidos en estos cultivos luego de aplicar diferentes condiciones lumínicas. La irradiación con luz blanca durante el crecimiento vegetativo de G. gargal previno una demora significativa del crecimiento de micelio en cajas de Petri causadas por temperaturas desfavorables (c.a. 21ºC). Las diferentes condiciones de luz produjeron cambios en el metabolismo secundario y en la diferenciación morfogénica de los cultivos. La respuesta a estas condiciones lumínicas fue mayor en G. gargal que en G. sordulenta. Los resultados indicaron que ambas especies de Grifola fueron sensibles a la irradiación lumínica, con respuestas morfogénicas de distinto tipo e intensidad, si bien la luz blanca fue más efectiva. En ausencia del estímulo luminoso, ambas especies del género fueron capaces de mostrar eventos morfogénicos. En el caso de G. gargal, en presencia del estímulo luminoso, la cepa A fue más sensible que la B en la presentación de respuestas fotomorfogénicas. Estos resultados registrados para los distintos anchos de banda de irradiación lumínica son sugerentes de la participación de más de una molécula fotorreceptora. Para estimar la capacidad ligninolítica in vitro, se cultivó G. gargal y G. sordulenta en medios diferenciales conteniendo diferentes compuestos fenólicos. Para fines comparativos y para poder extrapolar los resultados al cultivo, resultó útil realizar este estudio en forma simultánea con otras dos especies poliporales que tienen una buena performance en fermentaciones en estado sólido empleando cáscara de girasol como sustrato: G. frondosa y Ganoderma lucidum (dos cepas). El estudio reveló la expresión de enzimas polifenol oxidasas en diferentes momentos del crecimiento y con diferentes patrones. Se sugiere que una de estas sería la enzima lignina peroxidasa (LiP). En otro estudio se verificó la actividad de lacasas. Asimismo, la presencia de la enzima con actividad de Mn-peroxidasa (MnP), fue también detectada, ya que en presencia de 20 ppm de Mn(II) en sustratos a base de cáscara de girasol la velocidad de crecimiento micelial fue mayor; asimismo en el caso de G. sordulenta causó un aumento en la densidad micelial aparente. En otro análisis similar se estudió el crecimiento de estas especies en medios diferenciales conteniendo diferentes fuentes de carbohidratos para determinar la actividad de la enzima celobiosa deshidrogenasa. El crecimiento fue en todos los casos moderado a bajo. Se determinó que G. gargal crece mejor en xilulosa y pectina, lo cual indicaría una preferencia por la fracción hemicelulósica de los sustratos. Grifola sordulenta por su parte, crece bien en celulosa y xilulosa y presentó actividad de la enzima celulosa deshidrogenasa. La velocidad de crecimiento y la densidad de la colonización en los medios de carbohidratos fue mayor en las colonias de G. frondosa y Ganoderma lucidum superando a G. gargal y G. sordulenta que si bien crecieron en todos los medios, mostraron menor habilidad para colonizarlos. Por lo cual ambos estudios en medios diferenciales mostraron una menor performance in vitro, lo cual permitió prever un desempeño regular a bajo al extrapolar estos resultados al cultivo en sustratos basados en cáscara de girasol. En algunas especies el cultivo de micelio en medios líquidos ofrece ciertas ventajas como reducción de las pérdidas por contaminación, utilización de espacios más reducidos, y fácil recolección de la biomasa y de los metabolitos disueltos en el medio. Se realizaron cultivos de G. gargal y G. sordulenta en medio líquido agitado empleando Erlenmeyers de 250 ml y 500 ml, y frascos de 3 l, así como también en medio líquido estacionario empleando fuentes de vidrio de 4 l. Se compararon los diferentes sistemas considerando el trabajo que requiere cada técnica y la cantidad de biomasa que produce. Para G. gargal se encontró favorable el cultivo en frascos de 3 l, y para G. sordulenta en Erlenmeyers de 250 ml, obteniéndose una biomasa de 4 y 18 g/l en 20 días de cultivo, respectivamente. En ambas especies la temperatura óptima para este cultivo fue de c.a. 18ºC. En este trabajo se determinó que la suplementación con diferentes reguladores del crecimiento vegetal y/o vitaminas o aminoácidos, o sólo con bencilaminopurina (0,1-10 mg/l) a los medios de ambas especies no incrementa significativamente la biomasa. Por otra parte, mediante el empleo de inóculo homogeneizado se consiguió disminuir la variabilidad dentro de los tratamientos en comparación con el uso de discos de micelio cultivado en agar como inóculo. Los diferentes protocolos suministraron material micelial con diferentes cualidades para ensayar posteriormente las propiedades antioxidantes de estas especies. El spawn en granos es el material que se emplea para inocular grandes masas de sustrato en el cultivo de hongos. La evaluación del crecimiento de micelio de G. gargal y G. sordulenta mediante el bioensayo de crecimiento lineal de Duncan (1997) reveló que ambas especies pueden ser cultivadas en granos de trigo, girasol, maíz y combinaciones de trigo con mijo y maíz con girasol; se determinó que el mejor crecimiento se logra para ambas especies con el cultivo en granos de trigo en el rango de pH de 5,3 a 6,4. La colonización completa de los granos de trigo, según la técnica de producción habitual en botellas de un litro, se produce más rápidamente a 24ºC, en comparación con el crecimiento del micelio en medios semisólidos y líquidos (c.a. 18ºC). En el cultivo en granos no se hallaron diferencias en el número de botellas que completaron la colonización a los días 25 y 30. Para ambas especies y para todos los tipos de granos, la mayor proporción de botellas colonizadas se observó a los 30 días. Considerando la cantidad de granos por gramo de spawn, el empleo de granos de trigo es el más indicado. Se empleó el test de crecimiento lineal de Duncan para evaluar la velocidad de colonización, la densidad aparente, el incremento del contenido de proteínas y de actividad de lacasas, y la degradación de fibras de G. gargal y de G. sordulenta en 20 formulaciones de sustrato a base de cáscara de girasol. Seguidamente se realizó otro ensayo para estudiar el efecto de ciertos suplementos en la velocidad de colonización y densidad aparente en 10 formulaciones más. Con la información recolectada se puede afirmar que ambas especies pueden crecer en estos sustratos, que la cáscara de girasol no necesita suplementos, como salvado o sustrato gastado de Pleurotus ostreatus, para sostener un buen crecimiento del micelio. Para G. gargal la colonización mejoró con un tratamiento ácido del sustrato, o con el agregado de cofactores enzimáticos (Mn(II) y Zn(II)), o de otras fuentes lignocelulósicas como roble, álamo o paja de trigo; para G. sordulenta se encontró que la colonización mejora sólo en cuanto a la densidad con un tratamiento ácido del sustrato, o con el agregado de cofactores enzimáticos (NH4(I), Mn(II) y Zn(II)). Con el establecimiento de un cultivo axénico de G. gargal y G. sordulenta sobre troncos sintéticos artificiales empleando cáscara de girasol como sustrato, se encontró que ambas especies pueden colonizar bien el sustrato, si bien con un ciclo productivo más extenso y mayor riesgo de contaminación a posteriori que para otras especies cultivadas con la misma técnica. La inducción con choque térmico a 5ºC produjo una sensible inducción de primordios, y se lograron algunas fructificaciones. El intercambio gaseoso es crucial para el desarrollo de los basidiomas, como era esperable según los antecedentes registrados en la literatura sobre la producción de G. frondosa. La secuencia de producción de ambas especies en las diferentes etapas es similar a la de G. frondosa: primordios granulares grises, que luego se diferencian en fructificaciones que se suceden en formas conocidas como cerebro, coliflor y racimo. Las propiedades antioxidantes de extractos metanólicos de cuerpos fructíferos, micelio de cultivo líquido y/o de cultivo de granos de trigo fueron analizadas en cuanto a sus propiedades de extinción de radicales (radical DPPH), y poder reductor, asimismo también se comparó el contenido de compuestos fenólicos y se caracterizaron los extractos metanólicos con la técnica de cromatografía de capa delgada. Los resultados hallados permitieron conocer las propiedades antioxidantes de G. gargal y G. sordulenta. Estas especies resultaron poseer muy buenos atributos antioxidantes, especialmente poder reductor. Las diferentes bioformas de micelio y también las formas de cultivo modifican cuali y cuantitativamente el contenido de antioxidantes causando variaciones en la actividad secuestrante de radicales y en el poder reductor. También se encontró que el micelio puede ser inducido a modificar su contenido en antioxidantes usando reguladores de crecimiento vegetal, y que la variación en el contenido de una propiedad antioxidante es independiente de la producida en otra propiedad antioxidante. La actividad antioxidante se debió en parte a la presencia de compuestos fenólicos pero no fueron los únicos compuestos activos. El análisis de cromatografía de capa delgada reveló además que la mayoría de los compuestos antioxidantes eran de naturaleza polar, en éstos siempre se hallaron las características de revelado correspondientes a compuestos fenólicos, y además en algunas bandas también se reveló la presencia de flavonoides. Por su parte los metabolitos apolares se observaron en todos los cromatogramas de los extractos. En algunos casos podría asociarse a compuestos fenólicos, mientras que en otros podría deberse a metabolitos no fenólicos. En G. sordulenta se halló que la actividad antioxidante estuvo parcialmente asociada a compuestos flavonoides. Las propiedades antigenotóxicas de cuerpos fructíferos y micelio de cultivo líquido de G. gargal; así como las harinas de granos de trigo fermentados con G. gargal, G. sordulenta y/o G. frondosa, fueron estudiadas con el test de mutación y recombinación somática en Drosophila melanogaster. El agente químico utilizando para causar las mutaciones (promutágeno) fue el DMBA (7-12-dimetilbenzo(α)antraceno). Con el estudio de la toxicidad de DMBA en distintos tratamientos pudo observarse un incremento en la mortalidad de las larvas de 9 a 45%, sin embargo cuando se agregaron los extractos fúngicos esta mortalidad disminuyó. La mutación y recombinación se evaluó como el número de spots blancos por cada cien ojos, mostrando un aumento en la frecuencia en aquellos tratamientos que contenían DMBA, y una disminución en los co-tratamientos conteniendo ambos: DMBA, y extractos fúngicos en el siguiente orden: fructificación de G. gargal, las tres harinas de granos colonizados y micelio de cultivo líquido de G. gargal. Se concluyó que el material evaluado resultó no tóxico per se y en combinación con el promutágeno y procancerígeno DMBA pudieron disminuir su mortalidad y la genotoxicidad. La respuesta protectora de los materiales fúngicos activó mecanismos de detoxificación en la larva de D. melanogaster que pueden ser desmutagénicos o bioantimutagénicos, y que fueron causados por ciertos compuestos bioactivos presentes en estos hongos superiores con actividad antigenotóxica como p.e. fenólicos, ácido linoleico, polisacáridos y polipéptidos. Luego de demostrar la ausencia de genotoxicidad, las propiedades antioxidantes y las propiedades antigenotóxicas de G. gargal y G. sordulenta, aun es necesario realizar estudios adicionales sobre la producción de cuerpos fructíferos por medio de la fermentación en estado sólido, y así facilitar su disponibilidad para su consumo como alimento. Hasta entonces una alternativa es la producción de micelio y metabolitos por medio del cultivo líquido. Finalmente, en un apartado final de la tesis se muestra información del contenido mineral y de diferentes nutrientes analizados en muestras de micelio, fructificaciones y granos de trigo colonizados, y como una novedad con potencial biotecnológico se sugiere la obtención de una harina de trigo colonizado por estos hongos para ser empleada como un alimento funcional. / As of ancient times, fungi have been and still are a source of food and medicine. Due to their nutraceutical value, they have been used to maintain and improve health, preserve youth and promote longevity. They are also a source of bioactive chemical compounds, which are, in turn, useful for the preparation of nutriceuttical and pharmaceutical products. Of the 700 edible mushroom species investigated to date, only 50 have medicinal value. Among these 50 is Grifola frondosa which is one of the most thoroughly investigated, particularly as a stimulator of the immune system and for its antitumoral properties. Grifola gargal Singer and G. sordulenta (Mont.) Singer, two representatives of the genus Grifola, in the andean patagonian forest in Argentina and Chile, have not been fully studied to date. Nor have their medicinal properties with their corresponding therapeutic applications been investigated. The purpose of this Ph. D. thesis was therefore to study the possibilities of cultivating G. frondosa under control conditions. On the other hand, the medicinal activity observed in polypores, particularly in G. frondosa, gives support to the hypothesis on the presence of antioxidant and /or antigenotoxic activity in these species. Confirming such properties is absolutely necessary to conduct further research in favor of its medicinal properties and to promote the proposal of possible varieties of products derived from them, which would, in turn increase the value of these fungi. To further learn about the growth conditions of these species four campaigns were done in the oak forests located within Lanín National Park. With the help of mycologists and people living in the area, fruiting bodies were collected. Growth data and samples of rotting G. gargal were also collected. Two new strains (strain B and G9) of G. gargal were isolated, one from a standing tree and another from a fallen oak which had been producing fruits for a period longer than 20 years. Previous research on the history of oak forests reveals that during the last ice age they were fragmented, thus inducing the development of processes of genetic variability. Some of these sources of variability variables are the content and quality of certain polyphenolic compounds which are known to be important in the biology of fungal decomposers of wood. This could therefore be indicative of variability among different strains of oak woodlands to G. gargal. Two strains, corresponding to G. gargal (strain A) and G. sordulenta, were obtained from the Centro de Investigación y Extensión Forestal Andino Patagónico (CIEFAP). Reaching to the optimal conditions for the production of mycelium and fruiting bodies is key to the optimized production of compounds with nutritional, nutraceutical and also as a source for nutriceuticals and pharmaceuticals hypothetically present in these fungi. Analysis of mycelial growth of G. gargal and G. sordulenta on nutrient agar medium revealed that for both species, the best culture conditions were pH 4, 18 ° C and culture medium supplemented with 0.4% MYPA of sunflower husk powder. It thus took shorter time to obtain high quality seed and cultivation of strains in this medium was subsequently used routinely both for its maintenance and use as inoculum. Results were analyzed by a possible loss of vigour (after three years of subcultures) and showed that both strains did not lose vigour and that there was a higher rate of colonization in Grifola sordulenta which could be due to the fact that they adapted to the ingredients of the medium, thus indicating that the routine mycelium growing conditions followed were adequate to maintain its force for more than 12 subcultures. On the other hand, the increase in the content of sunflower husk powder (0.4 %) did not alter the rate of colonization of strain A to G. gargal. This indicated that there is no need in increasing the amount of this supplement in this species. It was also observed that there were no differences in the rate of colonization between strain A, B, and G9. It has been observed that in stock strains of mycology laboratories some strains produce primordia and/or real fruitbodies after they are stored. This led us to use the method of in vitro culture under controlled conditions to deep on the processes underlying fungal morphogenesis, i.e the differentiation of vegetative mycelium to reproductive mycelium in these species. Observations of G. frondosa, G. gargal and G. sordulenta under a magnifying glass and microscope were compared with observations by other researchers. These comparisons revealed some differences in taxonomic significance in terms of growth speed, colony morphology, colour changes in the culture medium and type of degradation studied in vitro. The comparison of the microscopic appearance of generative hyphae, gloeopleuras, skeletal, presence of chlamydospores and crystalloid structures with observations from other researchers showed differences which will contribute to better understanding of the variability among strains of these species. The study of the in vitro morphogenic differentiation of G. gargal and G. sordulenta was useful as it helped detect changes in these crops after applying different light conditions. Irradiation with white light during the vegetative growth of G. gargal prevented a significant delay in growth of mycelium in Petri dishes, originated from unfavourble temperatures (c.a. 21 º C). The different light conditions produced, in fact, changes in secondary metabolism and morphogenic differentiation of cultured mycelia. Compared to findings from a study conducted in colonies grown in Petri dishes which had completed their vegetative growth in darkness and had received a thermal shock, in our study the effect of these environmental conditions was greater on G. gargal and similar on G. sordulenta. This indicates that both species of Grifola are sensitive to light irradiation with different morphogenic response type and intensity while white light is more effective. In the absence of light stimulus, both species of the genus were found to have the ability to show morphogenic events. In the case of G. gargal, strain A was observed to be more sensitive than B in the presentation of photomorphogenic responses. These results reported for different bandwidths of light irradiation are indicative of the involvement of more than one photoreceptor molecule. Grifola gargal and G. sordulenta were cultured in differential media containing different phenolic compounds in order to estimate ligninolytic ability in vitro. For comparative purposes and in order to extrapolate results to their cultivation, this study was carried out simultaneously with two other species of poliporales which exhibit a good performance behave naturally in solid state fermentation when using sunflower husks as main substrate. The study revealed polyphenol oxidase enzyme expression at different times and with different growth patterns. It is suggested that one of these could be the enzyme lignin peroxidase (LiP). It was further verified the activity of laccases. Mn-peroxidase (MnP) activity was presumably present because it was also detected in other strains of G. gargal and because addition of Mn (II) increased the rate of colonization with G. gargal cultivation on sunflower husk as substrate and aspect was better in G. sordulenta. Growth of these species in differential media containing different carbohydrate sources was also studied in order to determine the activity of the enzyme cellobiose dehydrogenase. In all cases, growth ranged from moderate to low. It was found that G. gargal grows best in xylulose and pectin, which could be indicaive of a preference for the hemicellulosic fraction of the substrates. In contrast, G. sordulenta was observed to grow well on cellulose and xylulose and evidenced cellulose dehydrogenase activity. Growth rate and density of colonization on media containing carbohydrates was higher in colonies of G. frondosa and Ganoderma lucidum, being even higher than those of G. gargal and G. sordulenta which, although they grew in all media, evidenced lower ability to colonize them. Both studies in differential media showed a lower in vitro performance, thus preannouncing a regular to low growth performance when these results were extrapolated to crop-based substrate sunflower husk. In some species the mycelium growing in liquid media have the advantage of reducing losses due to culture, the use of smaller spaces, and allow for an easy harvesting of the biomass and recovery of the metabolites dissolved in the medium. Cultures of G. gargal and G. sordulenta were carried out in agitated liquid medium using 250 and 500 ml Erlenmeyers flasks, and 3-liter bottles, as well as in liquid medium sources using 4-liter glass containers. Different systems were compared considering the work involved in each technique and the amount of biomass produced. Grifola gargal culture was carried out in 3-liter glass flasks and G. sordulenta was carried out in 250 ml Erlenmeyers flasks, yielding a biomass of 4 and 18 g/l after 20 days of culture, respectively. In both species, optimum temperature for this crop was c.a. 18 °C. In this work it was also determined that supplementation with different plant growth regulators and/or vitamins or aminoacids, or benzylaminopurine alone (0.1-10 mg/l) to the media of both species does not significantly increase biomass. Moreover, the use of homogenous innoculum reduced variability within treatments with respect to the use of disks of mycelium grown on agar as inoculum. The fungal material obtained from this work provided mycelial with different qualities to further test the antioxidant properties of these species. Grain spawn is the material used to inoculate large number of substrates in mushroom cultivation. The evaluation of mycelial growth of G. gargal and G. sordulenta by linear growth bioassay of Duncan (1997) revealed that both species can be cultivated in grains of wheat, sunflower, corn and wheat combinations with millet and corn with sunflower. It was also observed that optimum growth is achieved for both species when cultivation of wheat grains is in the pH range of 5.3 to 6.4. The full colonization of grains of wheat, following the production technique in traditional 1 liter bottles, occurs more rapidly at 24 °C, compared with the growth of mycelium in semisolid media and liquid (c.a. 18 ° C). In grain cultivation there were no differences in the number of bottles that completed the colonization by days 25 and 30. For both species and for all types of grains, the largest proportion of substrates in bottles was colonized after 30 days. Considering the number of grains per gram of spawn grains, using wheat is best recommended. Duncan linear growth test was used to assess the substrate mycelia colonization rate, bulk density, increased protein content and laccase activity, and fiber degradation produced G. gargal and G. sordulenta in 20 formulations based substrate sunflower husk. Another test was further conducted to study the effect of certain supplements on the colonization rate and apparent mycelial density in 10 formulations. Taken together, findings from our study support the conclusion that both species grow in these substrates, that sunflower seed husks needs no supplements such as bran or Pleurotus ostreatus spent substrate to sustain regular growth of the mycelium. For G. gargal colonization was found to improve with an acid treatment of the substrate or with the addition of enzyme cofactors (Mn (II) and Zn (II)), or other lignocellulosic sources such as oak, poplar, wheat straw. For G. sordulenta colonization was found to improve only in terms of mycelial density with an acid treatment of the substrate, or with the addition of enzyme cofactors (NH4 (I), Mn (II) and Zn (II)). The axenic culture of G. gargal and G. sordulenta on artificial synthetic logs using sunflower husks as substrate showed that both species can colonize the substrate, but with a longer production cycle and increased risk of contamination in relation to other mushroom species with the same technique. The thermal shock induction of 5 °C produced a significant induction of primordia and produced some fructifications. Gas exchange is crucial to the development of basidiomas, as expected based on previous research on the production of G. frondosa. The production sequence of both species at different stages is similar to that of G. frondosa: gray granular primordia that grow into fruitbodies of brain shape, then cauliflower shape and finally cluster flower. The antioxidant properties of methanolic extracts of fruiting bodies, mycelium from liquid culture and/or wheat grains were analyzed in terms of their radical scavenger properties (DPPH radical) and reducing power. The content of phenolic compounds was compared and methanol extracts were characterized using thin layer chromatography. It was thus possible to learn more about the properties of G. gargal and to confirm them for the first time in the case of G. sordulenta. These species have antioxidant reducing power properties. Different bioforms of mycelium and also different culture systems modify forms of qualitative and quantitative antioxidant content causing variations in radical scavenger activity and reducing power. In other words, the mycelium can be induced to change their antioxidant content using plant growth regulators and variability in the content of antioxidant property is independent of that produced in other antioxidant property. Antioxidant activity was found to be due in part to the presence of phenolic compounds but it was not the only active compound. Thin layer chromatography also helped to show that the majority of antioxidant compounds were polar, in these were always revealed the presence of phenolic compounds, and in some bands, also the presense of flavonoids. Non-polar metabolites were observed in all chromatograms of extracts. In some cases they could be associated with phenolic compounds while in others could be associated to non-phenolic metabolites. In G. sordulenta it was found that the antioxidant activity was preferentially associated to flavonoid compounds. Antigenotoxic properties of fruiting bodies and mycelia from liquid cultures of G. gargal, as well as grains of wheat flour fermented with G. gargal, G. sordulenta and/or G. frondosa were also studied to test somatic mutation and recombination in Drosophila melanogaster. The chemical agent used to cause mutations (promutagen) was DMBA (7-12-dimethylbenz (α) anthracene). Research on toxicity revealed that treatment with DMBA increased larval mortality from 9 to 45%. Still, when fungal extracts were added larval mortality rate decreased. Both mutation and recombination were assessed as the number of white spots per hundred eyes, showing an increased frequency in the treatments with DMBA, and a decrease in co-treatments with both: DMBA and fungal extracts in the following order: G. gargal fruiting body, three grain meals colonized and G. gargal liquid culture mycelium. It could be concluded that the material evaluated was not toxic and that in combination with procarcinogenic promutagenic DMBA both mortality and genotoxicity decreased. The protective response observed with fungal materials triggered detoxification mechanisms in D. melanogaster larvae which could be either desmutagenic or bioantimutagenic and which could be produced due to some bioactive compounds present in higher fungi with antigenotoxic activity, such as phenolics, linoleic acid, polysaccharides and polypeptides. Summing up, findings on the absence of genotoxicity and antioxidant and antigenotoxic properties, in the fungal species studied in this Ph.D. thesis, will be greatly benefited from further research on the optimization of both species for the production of fruiting bodies through fermentation in the solid state. In the meantime, the production of mycelia and metabolites in liquid culture medium is the alternative for such optimitization. A final section of this Ph.D. thesis includes information on the mineral content of different nutrients which were analyzed in samples of mycelium and fruiting bodies and colonized wheat grains. A novelty with biotechnological potential derived from this section concerns the obtention of wheat flour colonized by these fungi, which evidenced factibility of being used as functional nutrient.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El presente estudio buscó medir y comparar los efectos de la suplementación de fuentes orgánicas e inorgánicas de zinc, manganeso y cobre en la dieta de gallinas de postura sobre la producción, calidad interna y externa del huevo y respuesta inmune, durante el segundo ciclo de postura, período comprendido entre las 65 a 84 semanas de edad de las aves (posterior a una pelecha forzada). El estudio contempló la utilización de 140 gallinas Leghorn de la línea Hy-Line W-36 las cuales fueron distribuidas en 36 jaulas con 4 aves cada una. La dieta estándar se elaboró en base a maíz nacional, afrecho de soya, afrechillo de trigo y aceite vegetal. Esta dieta se suplementó en los 3 tratamientos de la siguiente manera: T1 o control (80 ppm de ZnSO4, 80 ppm de MnSO4 y 5 ppm de CuSO4); T2 (80 ppm de ZnSO4, 80 ppm de MnSO4 y 5 ppm de CuSO4 más 40 ppm de Availa Zn®, 40 ppm de Availa Mn® y 7 ppm de Availa Cu®); T3: (120 ppm de ZnSO4, 120 ppm de MnSO4 y 12 ppm de CuSO4). La pelecha forzada se logró manejando la alimentación y las horas luz. Los indicadores productivos medidos fueron: la producción de huevos (%) registrada diariamente y expresada como promedio semanal y el peso de huevos (g) registrado semanalmente. Las evaluaciones de calidad del huevo fueron de dos tipos: de registro diario (huevos trizados, quebrados, sin cáscara y sucios expresados como porcentaje) y de análisis mensual (gravedad específica, grosor de cáscara (mm), resistencia a la fractura (kg/cm2), deformación de la cáscara (mm), unidades haugh, color de yema y relación yema/albúmina para peso y volumen). La evaluación inmunológica se realizó midiendo el nivel de anticuerpos pre y post vacunación para Enfermedad de Newcastle (ENC), Bronquitis Infecciosa (BI) y S. enteritidis (SE) mediante test de Elisa (IDEXX®). Los resultados indican que el indicador producción de huevos, no mostró diferencias significativas entre tratamientos (P>0.05). El peso del huevo, mostró diferencias significativas (P<0.05) entre tratamientos, donde el mayor peso corresponde a las aves del tratamiento 3, seguido por los tratamientos 1 y 2 respectivamente. Respecto de la calidad externa del huevo, el indicador huevos trizados no mostró diferencias significativas (p>0.05) entre tratamientos. Por el contrario, sí se obtuvieron diferencias significativas (p<0.05) en los indicadores huevos sucios, huevos quebrados y huevos sin cáscara. Para huevos sucios, T2 fue el que tuvo los mayores porcentajes seguido de T1 y T3 respectivamente. No se encontraron diferencias significativas (p>0.05) entre tratamientos para los parámetros gravedad específica, deformación de la cáscara, resistencia a la fractura, unidades haugh, color de yema, relación peso yema/albúmina, relación volumen yema/albúmina y grosor de cáscara. Según lo esperado, hubo diferencias significativas (p<0.05) en cuanto a tiempo de muestreo (pre y post vacunación) en todos los tratamientos para ENC, BI y SE. Sin embargo no se observaron diferencias significativas (p>0.05) entre tratamientos para las respuestas inmunes evaluadas. En el presente estudio no se evidenció una superioridad de los minerales incorporados en forma orgánica sobre los minerales inorgánicos. Si bien es cierto existe una mejora en algunos indicadores, esta situación podría deberse a un mayor nivel de incorporación suplementaria, independientemente del tipo de fuente mineral empleada

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