La hormona paratiroidea (PTH) es un importante mediador de la remodelación ósea y actúa como regulador esencial de la homeostasis del calcio. Dependiendo del tipo y del contexto celular, PTH puede también inhibir o promover la apoptosis. La apoptosis, una forma de muerte celular programada, es un proceso fundamental para el crecimiento y desarrollo normal, la respuesta inmune, la remodelación de los tejidos, y la homeostasis del epitelio intestinal. En este trabajo de tesis se demostró, por primera vez, la localización y expresión del receptor de PTH tipo 1 (RPTH1) en las células epiteliales Caco-2, derivadas de adenocarcinoma de colon humano. El receptor, se localiza en la membrana plasmática, el citoplasma y el núcleo de estas células intestinales. Se comprobó que en las células Caco-2 el tratamiento con PTH disminuye el número de células viables e induce cambios morfológicos consistentes con la apoptosis: alteración de los filamentos de actina y consecuentemente de la forma celular, pérdida de las uniones intercelulares, externalización de la fosfatidilserina de membrana, distribución perinuclear de las mitocondrias, condensación nuclear y fragmentación del ADN. Además, el tratamiento con PTH en estas células resultó en la desfosforilación de la proteína pro-apoptótica Bad, su disociación de la proteína 14-3-3 y su translocación a las mitocondrias con la consecuente liberación de los factores pro-apoptóticos citocromo c y Smac/Diablo desde las mitocondrias al citosol resultando finalmente en la activación de la enzima pro-apoptótica caspasa-3 y el clivaje de su sustrato PARP. En estas células, la hormona provocó la desfosforilación de Akt (quinasa que controla el balance entre la supervivencia celular y la apoptosis e induce la fosforilación de Bad) mediante la serina/treonina fosfatasa PP2A. PTH además indujo la asociación de Akt con la subunidad catalítica de PP2A (PP2Ac), promovió la translocación de PP2Ac del citosol a las mitocondrias e incrementó la actividad de esta fosfatasa vía el AMPC. PP2A también participó en la regulación de la viabilidad de las células Caco-2 dependiente de PTH y en el clivaje del sustrato de caspasa-3, PARP. PTH no modificó los niveles de expresión proteica de p53, sugiriendo que, en estas células, la hormona es un estímulo apoptótico que induce la muerte celular por un mecanismo independiente de la expresión de p53. PTH aumentó los niveles de la proteína 14-3-3 en el citosol y no se detectó la asociación entre 14-3-3 y RPTH1 en condiciones basales ni luego del tratamiento hormonal, sugiriendo que 14-3-3 no regularía la localización subcelular del RPTH1 en las células Caco-2. Los resultados de este trabajo de tesis demuestran que PTH desencadena efectos pro-apoptóticos en las células Caco-2, y aportan información sobre los mecanismos moleculares de señalización que son estimulados por la hormona en estas células intestinales. / Parathyroid hormone (PTH) functions as a major mediator of bone remodeling and as an essential regulator of calcium homeostasis. Depending on the cell type involved, PTH also inhibits or promotes the apoptosis. Apoptosis, a form of programmed cell death, is a fundamental process to normal growth and development, immune response, tissue remodeling, and homeostasis of the intestinal epithelium. In this thesis work, we demonstrated, for the first time, the localization and expression of the PTH receptor type 1 (PTHR1) in the epithelial Caco-2 cells, a cell line derived from human colorectal adenocarcinoma. The receptor is present in plasma membrane, cytoplasm and nucleus of these intestinal cells. In Caco-2 cells, PTH treatment diminished the number of viable cells. Moreover, the hormone induced disruption of actin filaments with changes to cellular shape, alteration of cell-to-cell junctions, externalization of membrane phosphatidylserine, mitochondrial cellular distribution to the perinuclear region, chromatin condensation and DNA fragmentation of the nucleus, which are morphological features consistent with apoptosis. In addition, the treatment with PTH in these cells resulted in Bad dephosphorylation, its dissociation of 14-3-3 protein and its translocation to the mitochondria with the subsequent release of cytochrome c and Smac/Diablo to the cytosol which resulted in activation of downstream caspase-3 and degradation of its substrate PARP. The hormone also decreased the phosphorylation of Akt (a kinase which controls the balance between cell survival and apoptosis and induces the phosphorylation of Bad) via the serine/threonine phosphatase PP2A. PTH also induced an association of Akt with the catalytic subunit of PP2A (PP2Ac), promoted the translocation of PP2Ac from the cytosol to the mitochondria and increased its phosphatase activity via the AMPc pathway. Furthermore, PP2A plays a role in hormone-dependent Caco-2 cells viability and in the cleavage of caspase-3 substrate PARP. PTH did not modify the protein levels of p53, suggesting that the hormone is an apoptotic stimulus that induces cell death by a p53-expression independent mechanism in these cells. PTH increased the amount 14-3-3 protein in the cytosol. However, the association of 14-3-3 with PTHR1 was not detectable under basal conditions or after PTH treatment, suggesting that 14-3-3 does not regulate the subcellular localization of PTHR1 in Caco-2 cells. The results of this tesis provide, for the first time, evidence of pro-apoptotic effects of PTH in Caco-2 cells and information about the molecular mechanisms of PTH-mediated signaling pathway in these intestinal cells.

En este trabajo de Tesis se investigaron los efectos de la hormona paratiroidea (PTH) en enterocitos de duodeno de ratas jóvenes (3 meses) y seniles (24 meses) y de adenosina trifosfato (ATP) en células Caco-2 derivadas de adenocarcinoma de colon, sobre las cascadas de señalización de las MAP quinasas (MAPKs) y su participación en la proliferación de estas células. Los resultados demuestran que PTH estimula, en forma rápida y transitoria, igual que a ERK1/2 (estudios previos), la fosforilación y actividad de JNK1/2 en células intestinales de ratas jóvenes, siendo los efectos de la hormona dependientes del Ca2+ intra y extracelular. Con el envejecimiento los efectos de PTH sobre JNK1/2 disminuyen significativamente. La expresión proteica basal de JNK1/2 no difiere entre enterocitos de ratas jóvenes y seniles, no obstante su fosforilación basal es mucho más elevada en células intestinales de seniles explicando la menor activación de JNK1/2 en respuesta a la hormona con el envejecimiento. PTH no modifica ni la actividad ni la fosforilación basal de p38 MAPK en enterocitos de ratas jóvenes. Sin embargo, en seniles indujo la fosforilación de esta quinasa de manera dependiente del tiempo, siendo máxima a los 5 minutos de tratamiento. PTH incrementa la síntesis de ADN, siendo mayor la magnitud en enterocitos de ratas jóvenes (+30%) que en seniles (+18%). ERK1/2 y JNK1/2 participan en el efecto proliferativo de la hormona en enterocitos de ratas jóvenes. En seniles, además de estas dos vías, también participa p38 MAPK. En la línea celular Caco-2, el ATP induce la rápida fosforilación de ERK1/2, p46 JNK y p38 MAPK. Una vez activadas, ERK1/2 y JNK translocan al núcleo. La estimulación de las quinasas también se observó en presencia de UTP, UDP y ATPS sugiriendo la participación de los subtipos de receptores P2Y2, P2Y4, P2Y6 y probablemente P2Y11 en la activación purinérgica. Estudios de RT-PCR y la secuenciación de sus productos confirmaron la expresión de P2Y2 y P2Y4 en estas células. Se comprobó que el ATP aumenta la concentración de Ca2+ intracelular y, que en el mecanismo de activación de las MAPKs participan el Ca2+, Src, y en menor grado las vías AMPc/ PKA y PKC, y la transactivación del receptor del factor de crecimiento epidermal (EGFR). La activación de las MAPKs por ATP en las células Caco-2, contribuye a la fosforilación de los factores de transcripción ATF-1, ATF-2 y JunD e induce la expresión de c-Fos y miembros de la familia de Jun. Además las MAPKs participan en la inducción y en la fosforilación de la fosfatasa dual MKP-1, capaz de inactivar a ERK1/2, JNK1/2 y p38 MAPK mediante la desfosforilación de dos residuos críticos en el loop de activación. Finalmente, el ATP a través de las cascadas de señalización de las MAPKs estimula la proliferación (+27%) de las células Caco-2. En conjunto, estos estudios son aportes originales al conocimiento de los mecanismos de acción de PTH y ATP en células intestinales. La comprensión del deterioro de las funciones de PTH con el envejecimiento, y de las modificaciones inducidas por el ATP en células tumorales, nos permiten ampliar las bases moleculares de la regulación de la fisiología intestinal. / In the present study, we investigated the effects of parathyroid hormone (PTH) on duodenal enterocytes from young (3 months) and aged rats (24 months), and the role of adenosine triphosphate (ATP) on Caco-2 cells derived from colon adenocarcioma, on MAP kinases signaling cascades (MAPKs) and their involvement in cell proliferation. Our results show that, in intestinal cells from young rats, PTH induces a transient and rapid increment, as happens with ERK1/2 (previous studies), in JNK1/2 phosphorylation and activity, effects that depend on intra and extracellular calcium. PTH actions on JNK1/2 are significantly diminished with ageing. JNK1/2 basal protein expression is not different in the enterocytes from young and aged rats, however basal protein phosphorylation increases with ageing explaining the lower JNK1/2 activation in response to PTH in aged rats. The hormone does not change the basal phosphorylation and activity of p38 MAPK in young enterocytes. However, in cells from aged rats, it induced the phosphorylation of p38 MAPK in a time dependent manner, peaking at 5 min. PTH increased intestinal cells DNA synthesis, being the effect on young enterocytes (+30%) more pronounced than in aged ones (+18%). ERK1/2 and JNK1/2 participate in the proliferative role of the hormone in duodenal cells from young rats. In aged enterocytes, besides these two pathways, p38 MAPK is also involved. ATP induces the rapid phosphorylation of ERK1/2, p46 JNK and p38 MAPK in Caco-2 cells, which is followed by traslocation of active ERK1/2 and JNK into the nucleous. UTP, UDP and ATPS induce MAPKs phosphorylation, suggesting the involvement of P2Y2, P2Y4, P2Y6 and probably P2Y11 subtypes receptors in purinergic actions. ART-PCR studies and PCR product sequencing supported the expression of P2Y2 and P2Y4 in this cell line. ATP increases the intracellular calcium concentration. In addition ATP-induced phosphorylation of MAPKs in Caco-2 cells was dependent on calcium influx and intracellular calcium release, Src and partially dependent on the cAMP/PKA and PKC pathways and EGFR transactivation. MAPKs activation by ATP is involved in ATF-1, ATF-2 and JunD transcription factors phosphorylation and in c-Fos and Jun family members induction. Moreover, MAPKs participate in the induction and phosphorylation of the dual MKP-1 phosphatase, capable of inactivating ERK1/2, JNK1/2 and p38 MAPK through the dephosphorylation of two critical residues in the activation loop. Finally, ATP through MAPKs signaling cascades stimulates the proliferation (+27%) of Caco-2 cells. In summary, these studies are originals contributions to the knowledge of PTH and ATP mechanisms actions on intestinal cells. The comprehension of PTH functions deterioration with ageing, and of the modifications induced by ATP on tumoral cells, let us amplified the molecular bases of the regulation of intestinal physiology.