La hormona paratiroidea (PTH) es un importante mediador de la remodelación ósea y actúa como regulador esencial de la homeostasis del calcio. Dependiendo del tipo y del contexto celular, PTH puede también inhibir o promover la apoptosis. La apoptosis, una forma de muerte celular programada, es un proceso fundamental para el crecimiento y desarrollo normal, la respuesta inmune, la remodelación de los tejidos, y la homeostasis del epitelio intestinal. En este trabajo de tesis se demostró, por primera vez, la localización y expresión del receptor de PTH tipo 1 (RPTH1) en las células epiteliales Caco-2, derivadas de adenocarcinoma de colon humano. El receptor, se localiza en la membrana plasmática, el citoplasma y el núcleo de estas células intestinales. Se comprobó que en las células Caco-2 el tratamiento con PTH disminuye el número de células viables e induce cambios morfológicos consistentes con la apoptosis: alteración de los filamentos de actina y consecuentemente de la forma celular, pérdida de las uniones intercelulares, externalización de la fosfatidilserina de membrana, distribución perinuclear de las mitocondrias, condensación nuclear y fragmentación del ADN. Además, el tratamiento con PTH en estas células resultó en la desfosforilación de la proteína pro-apoptótica Bad, su disociación de la proteína 14-3-3 y su translocación a las mitocondrias con la consecuente liberación de los factores pro-apoptóticos citocromo c y Smac/Diablo desde las mitocondrias al citosol resultando finalmente en la activación de la enzima pro-apoptótica caspasa-3 y el clivaje de su sustrato PARP. En estas células, la hormona provocó la desfosforilación de Akt (quinasa que controla el balance entre la supervivencia celular y la apoptosis e induce la fosforilación de Bad) mediante la serina/treonina fosfatasa PP2A. PTH además indujo la asociación de Akt con la subunidad catalítica de PP2A (PP2Ac), promovió la translocación de PP2Ac del citosol a las mitocondrias e incrementó la actividad de esta fosfatasa vía el AMPC. PP2A también participó en la regulación de la viabilidad de las células Caco-2 dependiente de PTH y en el clivaje del sustrato de caspasa-3, PARP. PTH no modificó los niveles de expresión proteica de p53, sugiriendo que, en estas células, la hormona es un estímulo apoptótico que induce la muerte celular por un mecanismo independiente de la expresión de p53. PTH aumentó los niveles de la proteína 14-3-3 en el citosol y no se detectó la asociación entre 14-3-3 y RPTH1 en condiciones basales ni luego del tratamiento hormonal, sugiriendo que 14-3-3 no regularía la localización subcelular del RPTH1 en las células Caco-2. Los resultados de este trabajo de tesis demuestran que PTH desencadena efectos pro-apoptóticos en las células Caco-2, y aportan información sobre los mecanismos moleculares de señalización que son estimulados por la hormona en estas células intestinales. / Parathyroid hormone (PTH) functions as a major mediator of bone remodeling and as an essential regulator of calcium homeostasis. Depending on the cell type involved, PTH also inhibits or promotes the apoptosis. Apoptosis, a form of programmed cell death, is a fundamental process to normal growth and development, immune response, tissue remodeling, and homeostasis of the intestinal epithelium. In this thesis work, we demonstrated, for the first time, the localization and expression of the PTH receptor type 1 (PTHR1) in the epithelial Caco-2 cells, a cell line derived from human colorectal adenocarcinoma. The receptor is present in plasma membrane, cytoplasm and nucleus of these intestinal cells. In Caco-2 cells, PTH treatment diminished the number of viable cells. Moreover, the hormone induced disruption of actin filaments with changes to cellular shape, alteration of cell-to-cell junctions, externalization of membrane phosphatidylserine, mitochondrial cellular distribution to the perinuclear region, chromatin condensation and DNA fragmentation of the nucleus, which are morphological features consistent with apoptosis. In addition, the treatment with PTH in these cells resulted in Bad dephosphorylation, its dissociation of 14-3-3 protein and its translocation to the mitochondria with the subsequent release of cytochrome c and Smac/Diablo to the cytosol which resulted in activation of downstream caspase-3 and degradation of its substrate PARP. The hormone also decreased the phosphorylation of Akt (a kinase which controls the balance between cell survival and apoptosis and induces the phosphorylation of Bad) via the serine/threonine phosphatase PP2A. PTH also induced an association of Akt with the catalytic subunit of PP2A (PP2Ac), promoted the translocation of PP2Ac from the cytosol to the mitochondria and increased its phosphatase activity via the AMPc pathway. Furthermore, PP2A plays a role in hormone-dependent Caco-2 cells viability and in the cleavage of caspase-3 substrate PARP. PTH did not modify the protein levels of p53, suggesting that the hormone is an apoptotic stimulus that induces cell death by a p53-expression independent mechanism in these cells. PTH increased the amount 14-3-3 protein in the cytosol. However, the association of 14-3-3 with PTHR1 was not detectable under basal conditions or after PTH treatment, suggesting that 14-3-3 does not regulate the subcellular localization of PTHR1 in Caco-2 cells. The results of this tesis provide, for the first time, evidence of pro-apoptotic effects of PTH in Caco-2 cells and information about the molecular mechanisms of PTH-mediated signaling pathway in these intestinal cells.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. / La hembra canina presenta un ciclo estral con ciertas características únicas si se compara con el de otras especies mamíferas. A lo largo del ciclo estral en la perra, se describe la secreción de hormona luteinizante (LH), la cual cumple variadas funciones en el ámbito reproductivo. Esta gonadotrofina ejerce su efecto a través de su receptor, LHR, el cual corresponde a una glicoproteína de transmembrana perteneciente a la superfamilia de receptores asociados a proteína G (GPCR) y que ha sido localizado en diversos tipos celulares, incluyendo el folículo ovárico; sin embargo, la dinámica de expresión de los receptores para LH durante el ciclo reproductivo no se había descrito en la perra. El objetivo de este trabajo fue estudiar a través de q-PCR la expresión génica (mRNA-LHR) de este receptor como también, mediante western blot, la proteína (LHR) en los folículos ováricos de perras a través del desarrollo folicular en las distintas etapas del ciclo estral mediante lupa estereoscópica, se aislaron en forma mecánica células de la teca y de la granulosa tanto de folículos preantrales como antrales provenientes de ovarios de perras en anestro, proestro/estro y diestro. Los resultados, analizados mediante ANOVA y correlación de Pearson, mostraron que 1os niveles de mRNA-LHR aumentaron a medida que el desarrollo folicular avanzó de anestro a proestro/estro y disminuyendo al pasar a diestro. En el caso de la proteína LHR se identificó una forma de 90 kDa como una de 67 kDa, sin una diferencia significativa entre el volumen de ambas en anestro, pero si presentes en algunos tamaños foliculares de proestro/estro y diestro. El análisis correlativo entre la expresión génica y la proteína presentaron valores positivos muy cercanos a 1 para la forma inmadura del receptor, mientras que, para la forma madura, si bien fueron igualmente positivos, estuvieron más alejados del valor mencionado. Tanto el mRNA del LHR como ambas formas proteicas fueron detectadas desde los folículos preantrales y a lo largo de todo el ciclo folicular. Las proteínas de LHR encontradas corresponderían a la forma madura e inmadura del receptor, siendo esta última la más abundante / The estrous cycle in canines has especial features compared to other mammal species. However, some of the aspects that affect follicular development are still unknown. The secretion of the Luteinizing Hormone (LH) has been described in dogs throughout the entire estrous cycle, playing an important role in reproduction processes. This gonadotrophin exerts its effects through its receptor, LHR, which corresponds to a transmembrane glycoprotein belonging to the G protein couple receptor (GPCR) superfamily that has been localized in many cellular types, including ovarian follicles. However, the expression dynamics of the LH receptors during the reproductive cycle had not been described in the bitch. The objective of this study was to know the gene expression (mRNA-LHR) and also the presence of its encoded protein LHR in the ovarian follicles throughout follicular development over the estrous cycle. Theca and granulosa cells from antral and preantral follicles of ovaries from adult bitches in anestrus, proestrous/estrous and diestrus where isolated mechanically under the stereoscope and evaluated by using q-PCR and western blot analyses. The results were analyzed through ANOVA and Pearson Correlation, using a significance of P < 0.05. Both mRNA LHR and LHR proteins were detected from preantral follicles over the reproductive cycle. During anestrous and proestrous/estrous the levels of the mRNA-LHR increased (P<0,05) but during diestrous the messenger levels decreased (P < 0,05). A 90 kDa and a67 kDa forms of the LHR protein were identified by western blot analyses, these would correspond to the mature and immature form of the receptor respectively. The immature form was the most abundant in all follicle types. The correlation between the gene expression and the presence of the protein was positive (P<0,05) for both mature and immature forms

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / El uso de micropartículas de polímeros naturales ha sido descrito como una innovadora técnica de formulación de adyuvantes para diversas vacunas. En este estudio se prepararon micropartículas de quitosano (MPQ) y de carragenina (MPC) como también de diferentes proporciones volumétricas (1:1; 1:3; 3:1) usando soluciones de quitosano de 0.1 a 1% (p/v) y carragenina al 0.83% (p/v), respectivamente, las cuales se utilizaron como adyuvantes en forma de micropartículas para una vacuna peptídica contra la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH-I). Las micropartículas de quitosano y carragenina (MPQC) fueron obtenidas mediante una técnica combinada de coacervación compleja, usando agitación mecánica y ultrasonicación y la técnica de secado por atomización. Lográndose un método optimizado de formación de micropartículas. Se determinó el porcentaje de rendimiento (R) de las micropartículas y se caracterizaron las propiedades de tamaño, morfología y potencial zeta. Adicionalmente, se evaluaron los parámetros de eficiencia de encapsulación (EE), capacidad de carga (CC) en estudios in vitro de encapsulación. Así mismo se estudió la cinética de liberación in vitro de las proteínas de albúmina sérica de bovino (BSA) y de un análogo de la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH G/Q) en solución de buffer fosfato de pH 7.4 a 37 ºC. Las micropartículas MPQC obtenidas por la técnica de ultrasonicación fueron elegidas para el presente estudio. El análisis morfológico mediante microscopia SEM de las MP mostró diversas morfologías y tamaños, siendo las MPQC (3:1) de forma elíptica, bordes definidos, superficie lisa, las características más constantes, cuyos tamaños fluctuaron entre 4 a 7 μm. Los resultados de Z potencial confirmaron la carga neta positiva del quitosano con valores promedios para las MPQ de +47,91 mV y de -52,86 mV para la carga negativa de carragenina. Los valores de Z potencial de las micropartículas MPQC fueron +49,89, + 27,88 y -41,79 para las relaciones de 3:1, 1:1 y 1:3. Los tamaños obtenidos por el analizador de tamaño de partículas fluctúo entre 1495,9 nm y 13302,6 nm, siendo mayor para las MPQC. El valor de R mayor fue de las MPQ. Los valores de EE y CC fue mayor en MP compuestas por complejos poliiónicos cargadas con GnRH G/Q. La cinética de liberación in vitro presentó dos picos de liberación a los 7 y 14 días aprox. de estudio. En conclusión, fue posible la obtención de MP en base a quitosano-carragenina con diferentes formas, tamaños y potencial zeta. A su vez las MP compuestas por complejos poliiónicos presentaron valores elevados de EE y CC, como también una sostenida y prolongada cinética de liberación in vitro, concluyéndose que esta formulación de complejos poliiónicos podría utilizarse como una nueva opción de adyuvante para la vacuna peptídica contra GnRH-I / Proyecto FONDEF D08I1085

El efecto de sincronización de la onda folicular empleando GnRH y LH sobre la tasa de preñez fue estudiado en 60 alpacas hembras adultas, y 60 llamas hembras adultas. Las hembras con folículos ≥ 7mm detectadas por ultrasonografía, fueron distribuidas al azar en tres grupos experimentales de 20 animales cada uno: grupo Control (1 ml de solución salina, IM); grupo GnRH (0.004 mg de acetato de buserelina, IM) y grupo LH (5 mg de LH, IM). La respuesta ovárica a los tratamientos se evaluó mediante ultrasonografía transrectal para determinar el intervalo en días, desde los tratamientos a la emergencia de la nueva onda folicular y el día en que el nuevo folículo dominante alcanzó ≥ 7mm de diámetro. El intervalo desde los tratamientos a la emergencia de la onda folicular fue similar (p mayor 0.05) en los grupos Control (4.5 ± 1.2 días y 4.7 ± 1.2 días), GnRH (4.3 ± 1.4 días y 4.6 ± 1.2 días) y LH (4.5 ± 1.2 días y 4.0 ± 1.2 días), para alpacas y llamas respectivamente. El intervalo desde el tratamiento hasta el día en qué el nuevo folículo dominante alcanzó ≥7 mm, no difirió en los grupos de alpacas Control (8.4 ± 1.9 días), GnRH (9.0 ± 1.6 días) y LH (7.9 ± 2.0 días) (p mayor 0.05). Entretanto en llamas, el intervalo desde los tratamientos a la presencia del nuevo folículo dominante en los grupos GnRH (7.9 ± 1.6 días) y LH (6.7 ± 1.6 días) fueron diferentes con el grupo Control (9.6 ± 1.0 días) (p menor 0.05). El tamaño folicular en alpacas, un día antes del empadre fue menor en los grupos GnRH (6.8 ± 1.4 mm) y Control (7.2 ± 1.3 mm) comparado con el grupo LH (8.9 ± 1.9 mm) (p menor 0.05). Adicionalmente en llamas, el tamaño folicular, un día antes del empadre fue diferente (p menor0.05) entre los grupos Control (6.4 ± 1.3 mm), GnRH (8.5 ± 0.6 mm) y LH (10.4 ± 3.6 mm). El empadre se realizó 12 días después de los tratamientos. Los animales fueron evaluados por ultrasonografía para determinar la tasa de ovulación el día 2 después del empadre y la tasa de preñez el día 35 después del empadre. La tasa de ovulación post empadre fue similar en los grupos control (85.7% y 64.7%), GnRH (94.4% y 88.9%) y LH (85.7% y 77.8%), para alpacas y llamas, respectivamente. La tasa de preñez en el día 35 después del empadre fue similar para todos los grupos (p> 0.05), Control (78.6% y 47.1%), GnRH (77.8% y 66.7%) y LH (64.3% y 72.2%) para alpacas y llamas, respectivamente. En conclusión, la sincronización con GnRH o LH no influyó en el intervalo desde los tratamientos a la emergencia de la nueva onda folicular, tasa de ovulación post empadre, ni la tasa de preñez en alpacas y llamas. / The effect of follicular wave synchronization using GnRH and LH on pregnancy rate was studied in 60 adult female alpacas, and 60 adult female llamas. Females with follicles ≥ 7mm detected by ultrasonography were randomly allocated in three experimental groups of 20 animals each one: Control group (1 ml saline solution, IM), GnRH group (0.004 mg of buserelin acetate, IM) and LH group (5 mg of LH, IM). The ovarian response to treatments was evaluated by transrectal ultrasonography to determine the interval in days from treatments to new follicular wave emergency and to the day which the new dominant follicle reached ≥ 7mm in diameter. The intervals from the treatments to follicular emergency were similar (p> 0.05) in Control (4.5 ± 1.2 days and 4.7 ± 1.2 days); GnRH (4.3 ± 1.4 days and 4.6 ± 1.2 days) and LH groups (4.5 ± 1.2 days and 4.0 ± 1.2 days), for alpacas and llamas respectively. The interval from the treatment to the day on which the new dominant follicle reached ≥ 7 mm in alpacas did not differ in Control (8.4 ± 1.9 days), GnRH (9.0 ± 1.6 days) and LH (7.9 ± 2.0 days) groups (p> 0.05). Meanwhile in llamas, the interval from the treatment to the presence of the new dominant follicle in GnRH (7.9 ± 1.6 days), and LH (6.7 ± 1.6 days) groups were different in comparison to Control group (9.6 ± 1.0 days) (p less 0.05). Follicular sizes in alpacas a day before mating were smaller in GnRH (6.8±1.4 mm) and Control (7.2 ± 1.3 mm) groups in comparison to LH group (8.9 ± 1.9 mm) (p less 0.05). Additionally, in llamas follicular size a day before mating was different (p less 0.05) among Control (6.4 ± 1.3 mm), GnRH (8.5 ± 0.6 mm) and LH (10.4 ± 3.6 mm) groups. Mating was permitted 12 days after treatments. Animals were evaluated by ultrasonography to determine ovulation rate on day 2 after mating and pregnancy rate on day 35 after mating. After mating, ovulation rate were similar in Control (85.7% and 64.7%), GnRH (94.4% and 88.9%) and LH (85.7% and 77.8%) groups, for alpacas and llamas, respectively. Pregnancy rate on day 35 after mating were similar for all groups (p> 0.05), Control (78.6% and 47.1%), GnRH (77.8% and 66.7%), and LH (64.3% and 72.2%) for alpacas and llamas, respectively. In conclusion, synchronization with GnRH or LH did not affect on the intervals from treatments to emergency of new follicular wave, ovulation rate post mating, nor pregnancy rate in alpacas and llamas.

Caracteriza y determina el número de folículos emergentes en cada onda folicular en alpacas. El estudio fue realizado durante el primer trimestre del 2016 en el Centro de Investigación y Producción Chuquibambilla de la Universidad Nacional del Altiplano en la región Puno. Se emplearon 34 alpacas suri hembras adultas, vacías, sin cría al pie, sin antecedentes de anormalidades reproductivas y con presencia de un folículo dominante ≥ 7 mm, para ser inducidas a ovulación mediante la aplicación intramuscular de 4.2 µg de acetato de buserelina (día 0). Dos días después del estímulo hormonal, se registró el desarrollo folicular individual a partir del número total de folículos antrales ≥ 3 mm en ambos ovarios mediante un seguimiento ecográfico transrectal interdiario de hasta 60 días. El total de animales en investigación tuvieron acceso a pastizales naturales y estuvieron sujetos a similares condiciones de manejo. Se determinó que la emergencia folicular se produjo el día 4.5 ± 1.4 (rango 2-8). El número de folículos antrales (NFA) ≥ 3 mm calculado durante la emergencia folicular fue en promedio 2.8 ± 1.3 (rango 1-8). Los resultados muestran que a pesar de haber una notable similitud (P>0.05) en el NFA ≥ 3 mm durante emergencias sucesivas, existe una diferencia significativa en el número de folículos emergentes entre animales distintos (P <0.05). La repetibilidad del NFA ≥ 3 mm calculada durante la emergencia folicular fue de 0.72. El intervalo interonda promedió los 16.9 ± 3.9 días, se definió como un carácter variable entre animales y presentó una repetibilidad de 0.23. Se concluye que el número de folículos emergentes ≥ 3 mm en alpacas representa una característica variable entre individuos distintos, pero altamente repetible dentro de un mismo animal; siendo además el intervalo interonda un carácter no repetible en alpacas. / Universidad Nacional Mayor de San Marcos (Lima). Vicerrectorado de Investigación y Posgrado / Tesis

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En el presente estudio se determinaron los cambios histológicos gonadales e hipotalámico-hipofisiarios en ratones hembra Balb/c inmunizados con una vacuna peptídica contra la hormona GnRH-I, basada en el antígeno recombinante GnRX/ GQ y quitosano como adyuvante, en una formulación soluble y una estrategia de micropartículas. Los animales inmunizados (días 1 y 30) desarrollaron anticuerpos específicos IgG, IgG1 e IgG2a contra el antígeno recombinante desde la primera vacunación y contra la hormona nativa GnRH-I desde la revacunación. Se observó una disminución del número de cuerpos lúteos y folículos preovulatorios en el parénquima ovárico de los individuos inmunizados, principalmente en el grupo donde se utilizó quitosano soluble como adyuvante. Por otro lado, en los animales inmunizados se determinó mediante inmunohistoquímica, un aumento de células positivas para GnRH-I en la zona hipotalámico-hipofisiaria, sin embargo, en estudios futuros se debe complementar la inmunohistoquímica de encéfalo con un método cuantitativo como qPCR, debido a la difícil estandarización y cuantificación de los resultados obtenidos mediante inmunohistoquímica encefálica en ratones

Caracteriza y determina el número de folículos emergentes en cada onda folicular en alpacas. El estudio fue realizado durante el primer trimestre del 2016 en el Centro de Investigación y Producción Chuquibambilla de la Universidad Nacional del Altiplano en la región Puno. Se emplearon 34 alpacas suri hembras adultas, vacías, sin cría al pie, sin antecedentes de anormalidades reproductivas y con presencia de un folículo dominante ≥ 7 mm, para ser inducidas a ovulación mediante la aplicación intramuscular de 4.2 µg de acetato de buserelina (día 0). Dos días después del estímulo hormonal, se registró el desarrollo folicular individual a partir del número total de folículos antrales ≥ 3 mm en ambos ovarios mediante un seguimiento ecográfico transrectal interdiario de hasta 60 días. El total de animales en investigación tuvieron acceso a pastizales naturales y estuvieron sujetos a similares condiciones de manejo. Se determinó que la emergencia folicular se produjo el día 4.5 ± 1.4 (rango 2-8). El número de folículos antrales (NFA) ≥ 3 mm calculado durante la emergencia folicular fue en promedio 2.8 ± 1.3 (rango 1-8). Los resultados muestran que a pesar de haber una notable similitud (P>0.05) en el NFA ≥ 3 mm durante emergencias sucesivas, existe una diferencia significativa en el número de folículos emergentes entre animales distintos (P <0.05). La repetibilidad del NFA ≥ 3 mm calculada durante la emergencia folicular fue de 0.72. El intervalo interonda promedió los 16.9 ± 3.9 días, se definió como un carácter variable entre animales y presentó una repetibilidad de 0.23. Se concluye que el número de folículos emergentes ≥ 3 mm en alpacas representa una característica variable entre individuos distintos, pero altamente repetible dentro de un mismo animal; siendo además el intervalo interonda un carácter no repetible en alpacas. / Universidad Nacional Mayor de San Marcos (Lima). Vicerrectorado de Investigación y Posgrado / Tesis

En este trabajo de Tesis se investigaron los efectos de la hormona paratiroidea (PTH) en enterocitos de duodeno de ratas jóvenes (3 meses) y seniles (24 meses) y de adenosina trifosfato (ATP) en células Caco-2 derivadas de adenocarcinoma de colon, sobre las cascadas de señalización de las MAP quinasas (MAPKs) y su participación en la proliferación de estas células. Los resultados demuestran que PTH estimula, en forma rápida y transitoria, igual que a ERK1/2 (estudios previos), la fosforilación y actividad de JNK1/2 en células intestinales de ratas jóvenes, siendo los efectos de la hormona dependientes del Ca2+ intra y extracelular. Con el envejecimiento los efectos de PTH sobre JNK1/2 disminuyen significativamente. La expresión proteica basal de JNK1/2 no difiere entre enterocitos de ratas jóvenes y seniles, no obstante su fosforilación basal es mucho más elevada en células intestinales de seniles explicando la menor activación de JNK1/2 en respuesta a la hormona con el envejecimiento. PTH no modifica ni la actividad ni la fosforilación basal de p38 MAPK en enterocitos de ratas jóvenes. Sin embargo, en seniles indujo la fosforilación de esta quinasa de manera dependiente del tiempo, siendo máxima a los 5 minutos de tratamiento. PTH incrementa la síntesis de ADN, siendo mayor la magnitud en enterocitos de ratas jóvenes (+30%) que en seniles (+18%). ERK1/2 y JNK1/2 participan en el efecto proliferativo de la hormona en enterocitos de ratas jóvenes. En seniles, además de estas dos vías, también participa p38 MAPK. En la línea celular Caco-2, el ATP induce la rápida fosforilación de ERK1/2, p46 JNK y p38 MAPK. Una vez activadas, ERK1/2 y JNK translocan al núcleo. La estimulación de las quinasas también se observó en presencia de UTP, UDP y ATPS sugiriendo la participación de los subtipos de receptores P2Y2, P2Y4, P2Y6 y probablemente P2Y11 en la activación purinérgica. Estudios de RT-PCR y la secuenciación de sus productos confirmaron la expresión de P2Y2 y P2Y4 en estas células. Se comprobó que el ATP aumenta la concentración de Ca2+ intracelular y, que en el mecanismo de activación de las MAPKs participan el Ca2+, Src, y en menor grado las vías AMPc/ PKA y PKC, y la transactivación del receptor del factor de crecimiento epidermal (EGFR). La activación de las MAPKs por ATP en las células Caco-2, contribuye a la fosforilación de los factores de transcripción ATF-1, ATF-2 y JunD e induce la expresión de c-Fos y miembros de la familia de Jun. Además las MAPKs participan en la inducción y en la fosforilación de la fosfatasa dual MKP-1, capaz de inactivar a ERK1/2, JNK1/2 y p38 MAPK mediante la desfosforilación de dos residuos críticos en el loop de activación. Finalmente, el ATP a través de las cascadas de señalización de las MAPKs estimula la proliferación (+27%) de las células Caco-2. En conjunto, estos estudios son aportes originales al conocimiento de los mecanismos de acción de PTH y ATP en células intestinales. La comprensión del deterioro de las funciones de PTH con el envejecimiento, y de las modificaciones inducidas por el ATP en células tumorales, nos permiten ampliar las bases moleculares de la regulación de la fisiología intestinal. / In the present study, we investigated the effects of parathyroid hormone (PTH) on duodenal enterocytes from young (3 months) and aged rats (24 months), and the role of adenosine triphosphate (ATP) on Caco-2 cells derived from colon adenocarcioma, on MAP kinases signaling cascades (MAPKs) and their involvement in cell proliferation. Our results show that, in intestinal cells from young rats, PTH induces a transient and rapid increment, as happens with ERK1/2 (previous studies), in JNK1/2 phosphorylation and activity, effects that depend on intra and extracellular calcium. PTH actions on JNK1/2 are significantly diminished with ageing. JNK1/2 basal protein expression is not different in the enterocytes from young and aged rats, however basal protein phosphorylation increases with ageing explaining the lower JNK1/2 activation in response to PTH in aged rats. The hormone does not change the basal phosphorylation and activity of p38 MAPK in young enterocytes. However, in cells from aged rats, it induced the phosphorylation of p38 MAPK in a time dependent manner, peaking at 5 min. PTH increased intestinal cells DNA synthesis, being the effect on young enterocytes (+30%) more pronounced than in aged ones (+18%). ERK1/2 and JNK1/2 participate in the proliferative role of the hormone in duodenal cells from young rats. In aged enterocytes, besides these two pathways, p38 MAPK is also involved. ATP induces the rapid phosphorylation of ERK1/2, p46 JNK and p38 MAPK in Caco-2 cells, which is followed by traslocation of active ERK1/2 and JNK into the nucleous. UTP, UDP and ATPS induce MAPKs phosphorylation, suggesting the involvement of P2Y2, P2Y4, P2Y6 and probably P2Y11 subtypes receptors in purinergic actions. ART-PCR studies and PCR product sequencing supported the expression of P2Y2 and P2Y4 in this cell line. ATP increases the intracellular calcium concentration. In addition ATP-induced phosphorylation of MAPKs in Caco-2 cells was dependent on calcium influx and intracellular calcium release, Src and partially dependent on the cAMP/PKA and PKC pathways and EGFR transactivation. MAPKs activation by ATP is involved in ATF-1, ATF-2 and JunD transcription factors phosphorylation and in c-Fos and Jun family members induction. Moreover, MAPKs participate in the induction and phosphorylation of the dual MKP-1 phosphatase, capable of inactivating ERK1/2, JNK1/2 and p38 MAPK through the dephosphorylation of two critical residues in the activation loop. Finally, ATP through MAPKs signaling cascades stimulates the proliferation (+27%) of Caco-2 cells. In summary, these studies are originals contributions to the knowledge of PTH and ATP mechanisms actions on intestinal cells. The comprehension of PTH functions deterioration with ageing, and of the modifications induced by ATP on tumoral cells, let us amplified the molecular bases of the regulation of intestinal physiology.

La Llama es el Camélido doméstico más abundante de Argentina. La cría de Llamas constituye una actividad económica de gran importancia debido a que es una especie poliproductora de carne, fibra, cuero y transporte. Actualmente existe interés creciente por mejorar el rendimiento y calidad de estos productos. El estudio de genes candidatos permite vincular las variaciones de un carácter y la manera en que éste se manifiesta en el fenotipo del individuo. En ese contexto la hormona de crecimiento (GH), producto del gen GH1 y secretada por la glándula pituitaria, estimula el crecimiento de huesos y músculos. Por otra parte, es bien conocido el interés que existe en la producción de fibras por determinados colores con mayor valor comercial. La determinación del color de capa en mamíferos se debe a la interacción de los genes MC1R (receptor 1 de melanocortina) y ASIP (péptido de señalización Agouti). Ambos controlan el tipo y localización de pigmento eumelánico (negro-marrón oscuro o sepia) o feomelánico (rojoamarillento) producido. Esta Tesis tuvo por objetivo caracterizar y analizar la diversidad genética del gen GH1 y realizar la caracterización molecular de las variantes alélicas de MC1R y ASIP en Llamas con distintos fenotipos de colores de capas. Mediante PCR se amplificaron y luego secuenciaron los tres genes. El gen GH1 mostró un alto nivel de variabilidad encontrándose 15 SNPs, mayormente situados en región no codificante. Sin embargo se identificaron dos polimorfismos en el promotor y uno en la región 5´no traducible. Dado que los polimorfismos localizados en el promotor podrían afectar los niveles de expresión del gen, se concluye que los mismos pueden ser útiles en futuros estudios de asociación. Con respecto al gen MC1R se identificaron 13 SNPs en región codificante, 10 de los cuales fueron no sinónimos. La combinación de 3 de estos polimorfismos permitieron diferenciar Llamas con capas pigmentadas (A259/A376/T383) de las blancas no albinas (BNA) que carecían de pigmento (G259/G376/C383). En ASIP el hallazgo más importante fue una deleción de 57pb en el Exón 4 con posible pérdida de función. De esta manera, el alelo delecionado en homocigosis se observó en Llamas eumelánicas y el alelo sin delecionar en estado homocigota o heterocigota, se vió en Llamas feomelánicas. La identificación de los alelos de los genes MC1R y ASIP permitió proponer un mecanismo por el cual se genera la pigmentación feomelánica y eumelánica (TO) en las Llamas.

Se determinó el efecto de un análogo de GnRH sobre la maduración final ovocitaria y los perfiles plasmáticos de testosterona (T), 17b Estradiol (E2) y 17a, 20b dihidroxiprogesterona (17a, 20b DP) en ejemplares de E. ringens. Para ello, individuos de esta especie fueron capturados en la Bahía del Callao fueron acondicionados al cautiverio en tanques de 10 m3 con aeración constante, temperatura del agua de 16 ºC, recirculación de agua de mar y alimentación ad libitum durante un periodo de un mes. Una vez que los peces alcanzaron la madurez gonadal, fueron tomados al azar y anestesiados con tricaína (80 mg L-1) para luego inyectarles 0,005 mg GnRHa g-1 de peso corporal; 0,005 mg GnRHa g-1 de peso corporal + 0,01 mg DOM g-1 de peso corporal y 0,9 % de solución salina. Como GnRHa se empleo acetato de buserelina y como antidopaminérgico se empleó domperidona. Transcurridas 0, 12, 24 y 48 h post inyección (pi) grupos de peces fueron sacrificados mediante sobre exposición de tricaína con la finalidad de extraer las gónadas y colectar la sangre en tubos Eppendorf. El efecto de la hormona sobre la maduración final ovocitaria fue determinado en base al análisis histológico de las gónadas, mientras que su efecto sobre los perfiles de los esteroides mencionados se determinó en base a la cuantificación plasmática mediante radioinmunoanálisis. Los resultados sugieren que la inyección de acetato de buserelina a 0,005 mg g-1 de peso corporal induce la maduración final ovocitaria en hembras maduras de E. ringens 12 horas pi, culminando con el desove entre las 24 y 48 horas pi. Por otro lado, la combinación de esta hormona con domperidona tendría un efecto retardante sobre la activación de dicho proceso. Se determinó además, que los niveles plasmáticos de E2 disminuyen durante la maduración final ovocitaria y luego de producirse el desove se incrementan. Finalmente, se sugiere que el 17a, 20b DP podría estar implicado en la activación de la maduración final ovocitaria sin llegar a ser el principal MIS de la anchoveta. / The present work had a main objective determine the effect of an analogue of GnRHa on the final oocyte maturation and on the hormonal profiles of testosterone (T), 17b Estradiol (E2) and 17a, 20b dihidroxiprogesterone (17a, 20b DP) in Peruvian anchovy Engraulis ringens. Individuals of this species were captured in Callao Bay, conditioned in 10 m3 tanks with constant aeration, water temperature of 16 ºC, recirculation of seawater and fed ad libitum for a period of one month. Once fish reached gonadal maturity they were taken at random and anesthetized with Tricaine (80 mg L-1), and injected with 0,005 mg GnRHa g-1 BW; 0,005 mg GnRHa g-1 BW + 0,01 mg DOM g-1 BW and 0,9% of saline solution. Busereline acetate was used as GnRHa and domperidone as antidopaminergic. After 0, 12, 24 and 48 h post injection (pi) groups of fish were sacrificed by means of over exposition of tricaine with the purpose to extract the gonads and to collect the blood in Eppendorf tubes. The effect of the hormone on the final maturation was determined based on histological analysis of the gonads, while its effect on the steroids hormones profiles was determined based on plasmatic quantification using RIA. These results suggest that busereline acetate injection of 0,005 mg g-1 body weight has an inductor effect on final oocyte maturation in mature females of E. ringens 12 hours pi, ending with spawning between 24 and 48 hours pi. In the other hand, the combination of this hormone with domperidone could have a delaying effect on the activation of this process. Also, it was determined that plasmatic levels of E2 during the final oocyte maturation decrease and then increase after spawning. Finally, it is suggested that 17a, 20b DP could be implicated in the activation of final oocyte maturation without ending up being main MIS of the anchovy