Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La maduración ovocitaria involucra cambios nucleares y citoplasmáticos que comprenden la reanudación de la meiosis y la redistribución de organelos como el aparato de Golgi. La coordinación de estos procesos en el tiempo es un evento crítico para el establecimiento de desarrollo embrionario normal. Este trabajo estudió la dinámica del aparato de Golgi (AG) durante la maduración de ovocitos de perra y su relación con la progresión nuclear. La localización del AG se evaluó mediante inmunofluorescencia indirecta en ovocitos no madurados, madurados in vitro (IVM) hasta 96 hrs y madurados in vivo, los cuales fueron distribuidos aleatoriamente para ser incubados con los Ac contra las proteínas del AG GM130 y Giantin; la configuración cromatínica se determinó mediante tinción DAPI, en vesícula germinal (VG), reinicio meiótico (GVBD), metafase I (MI) y II (MII). Los resultados mostraron dos patrones de distribución de la inmunomarca: a) Homogéneo en el citoplasma, que predominó en ovocitos no madurados (99%) presentando paralelamente el estado de VG (87%) y, b) Cortical, principalmente en ovocitos sometidos a IVM (97%), donde se reanuda la meiosis incrementando el desarrollo meiótico con el tiempo de cultivo y predominando el estado MI (75%). Todos los ovocitos madurados in vivo mostraron patrón cortical y 94% de MII. Estos resultados sugieren que el AG se relocaliza durante la IVM de ovocitos de perra, lo que se relaciona con la progresión meiótica pero de manera no coordinada, siendo in vitro menos eficiente que in vivo / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1110265

Memoria para optar al Título Profesional de Médico veterinario / En el presente trabajo, se estudiaron los efectos de la suplementación con piruvato al medio de cultivo y del tiempo de incubación (72-96 h) sobre el desarrollo meiótico de ovocitos caninos. Los ovocitos utilizados se obtuvieron de ovarios de perras ovariohisterectomizadas, los que fueron liberados mediante cortes finos con hojas de disección, recolectándose bajo lupa estereoscópica. Se seleccionaron aquellos ovocitos de mayor tamaño, que presentaban citoplasma homogéneo y al menos dos capas de células del cúmulo, lavándose dos veces en medio PBS para posteriormente incubarlos en grupos de 8 a 10 ovocitos en gotas de 100 μL, bajo aceite mineral estéril. Se utilizó un medio de maduración A (control), preparado en base a TCM 199 suplementado con 10% de suero fetal bovino, 10 UI/mL de gonadotrofina coriónica humana, 12 mg/mL de penicilina y 20 mg/mL de estreptomicina; y el medio de maduración B, que correspondió al medio control más la suplementación de 11,2 mg/mL de ácido pirúvico. Los ovocitos incubados en ambos medios se cultivaron por periodos de 72 y 96 horas a 38,5 ºC, en una atmósfera de 5% de CO2 y 98% de humedad. Luego de cada periodo de incubación, los ovocitos se fijaron en una solución de ácido acético, metanol y cloroformo (3:6:2 v/v) por tres minutos, y posteriormente en ácido acético y metanol (1:3 v/v) por 72 horas a 4º C. Los ovocitos fijados se tiñeron con 0,1% de ioduro de propídeo (PI) y se evaluaron bajo microscopia de epifluorecencia. Los distintos estados de desarrollo meiótico fueron clasificados como: estado de vesícula germinativa (GV), reinicio meiótico (GVBD), primera metafase (MI) y segunda metafase (MII). Se realizaron 9 réplicas experimentales. Para el análisis de los resultados los porcentajes fueron transformados: arc-sen √% y evaluados por ANDEVA. Los promedios fueron comparados a través de la prueba de Tukey. 7 Diferencias de p≤ 0,05 fueron consideradas significativas. Tanto a las 72 como a las 96 horas de cultivo el porcentaje de ovocitos que se mantuvieron arrestados al estado de vesícula germinativa, sin progresar en la meiosis, fue significativamente mayor (P≤ 0,05) en el medio control, que en el medio suplementado con piruvato. Por otra parte, la proporción de gametos en reinicio meiótico y primera metafase no varió en los distintos sistemas de cultivo, mientras que la maduración nuclear completa alcanzando el estado de segunda metafase (MII) fue favorecida por la presencia de ácido pirúvico en el medio (P≤ 0,05). No se observaron diferencias significativas asociadas al efecto del tiempo de incubación (72 y 96 horas) sobre los distintos estados de maduración nuclear en ninguno de los medios de cultivo. Los resultados muestran que la suplementación con piruvato mejora las tasas de maduración in vitro de ovocitos de perra y que la prolongación del tiempo de incubación no influye significativamente en el efecto que tiene el piruvato sobre el desarrollo nuclear de los ovocitos caninos madurados en cultivo / Financiamiento: Proyecto FONDECYT 1030380

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En caninos, el desarrollo de las biotecnologías reproductivas ha sido inferior en comparación al realizado en otras especies, básicamente debido a la baja eficiencia en la maduración in vitro de los ovocitos. La adecuada maduración comprende tanto al núcleo como al citoplasma, a nivel citoplasmático involucra la redistribución y desarrollo de organelos, entre estos, la organización y la actividad metabólica de las mitocondrias. Sin embargo, no hay mayores antecedentes respecto al desarrollo citoplasmático in vitro en los caninos, por lo que en la presente memoria se estudió la actividad y distribución mitocondrial en ovocitos de perras en estado inmaduro, madurados in vitro por 72 y 96h y madurados in vivo. Se analizó un total de 766 ovocitos obtenidos de perras sanas sometidas a ovariohisterectomía. Del total de estos ovocitos estudiados, 215 fueron utilizados como inmaduros, 254 fueron madurados durante 72 horas y los otros 297 durante 96 horas. Adicionalmente se analizó una cantidad total de 15 ovocitos madurados in vivo, obtenidos por lavados del oviducto a perras en estro, ovariohisterectomizadas 72 h después de la ovulación, la que se determinó mediante análisis de progesterona sérica. Tanto los ovocitos inmaduros, madurados in vitro y madurados in vivo fueron procesados de forma separada para evaluar la distribución y actividad mitocondrial, usando la sonda de fluorescencia MitoTracker Red CMXRos®. Las observaciones se realizaron en un microscopio invertido con epifluorescencia. La actividad mitocondrial se evaluó de acuerdo a la fluorescencia emitida en alta, media y baja para cada uno de los estados de maduración de los ovocitos y se analizó mediante chi-cuadrado. Se estableció dependencia entre las frecuencias de ovocitos con distintas intensidades de fluorescencia (alta, media, baja) al comparar las muestras provenientes de ovocitos inmaduros, madurados in vitro por 72 y 96 h, y madurados in vivo (chi cuadrado = 30,59; p< 0,01), indicando que la actividad mitocondrial se encuentra directamente asociada al estado de maduración del ovocito de perra. En la actividad mitocondrial todos los ovocitos madurados in vivo presentaron fluorescencia de tipo media, la que predominó en ovocitos de perra inmaduros y madurados in vitro; sin embargo, se observó un aumento en el porcentaje de ovocitos con 3 esta emisión de fluorescencia durante la maduración in vitro que indicaría una actividad mitocondrial progresiva durante el cultivo, asociada al tiempo de maduración. La distribución mitocondrial se evaluó mediante análisis descriptivo, determinándose cuatro patrones: Homogéneo liso completo (A), Homogéneo granuloso completo (B), Heterogéneo granuloso periférico y central (C), y Heterogéneo granuloso central (D). En ovocitos inmaduros se encontraron dos patrones de distribución mitocondrial A (72,1%) y B (27,9%); en aquellos madurados in vitro por 72 h se presentaron los cuatro patrones, predominando el B (63,8%), seguido por C (20,5%), el A (9,8%) y finalmente el D (5,9%). en los ovocitos madurados por 96 h se observaron los patrones, B (63,6%), seguido por C (35,7%) y finalmente D (0,7%). En el caso de los ovocitos madurados in vivo se describió sólo un patrón de distribución mitocondrial que correspondió a B. Con estos antecedentes se indica que en ovocitos inmaduros de perra predomina una distribución uniforme de las mitocondrias en su citoplasma. Además la presentación de tres patrones diferentes en los ovocitos madurados in vitro a aquel descrito en ovocitos madurados in vivo podría indicar que durante la maduración in vitro se producen movimientos de las mitocondrias en el citoplasma ovular. También, las distribuciones de las mitocondrias, variaron a través de la maduración in vitro, asemejándose a aquellos madurados in vivo, sin embargo, hubo diferencias entre ambos tipos de maduración lo que podría estar asociado a las condiciones de cultivo. / Proyecto FONDECYT 1080618

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El Factor de Crecimiento Diferencial 9 (GDF9) cumple un rol esencial en el desarrollo ovocitario de los mamíferos, sin embargo, en ovocitos caninos se desconoce su presencia y participación durante la maduración. En este estudio, se evaluó la presencia de GDF9 en ovocitos de perra madurados in vitro (MIV) y su relación con la expansión del cúmulo, para lo cual complejos cúmulo ovocito (COC’s) se cultivaron por 0, 48, 72 y 96 h. Posteriormente, algunos COC’s fueron desprendidos del cúmulo. De este modo, ovocitos sin células del cúmulo y COC’s se procesaron para su evaluación a través de Inmunofluorescencia Indirecta y Western blot con el anticuerpo anti GDF9 humano. Con ambas técnicas, la proteína se detectó principalmente en el ovocito y en menor proporción en las células del cúmulo. Además, en ambos tipos celulares, la detección de GDF9 disminuyó a medida que progresó el tiempo de cultivo. En ovocitos denudados y COC’s, se detectó una banda de ~56 kDa correspondiente a la pro-proteína en todos los tiempos de maduración. Sin embargo, sólo en COC’s no madurados y MIV por 48 h se detectaron dos bandas de proteína madura de ~18 y 19 kDa. Finalmente, se observó una relación inversa entre la expansión del cúmulo durante la MIV y la detección de GDF9 por Western blot. Por consiguiente, GDF9 está presente en ovocitos de perra y tendría participación en los procesos iniciales del crecimiento y desarrollo ovocitario / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1110265

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El factor de crecimiento diferencial 9 (GDF-9) y la proteína morfogénica ósea 15 (BMP-15) regulan en diferentes especies procesos esenciales para la maduración del ovocito, tales como la expansión del cúmulo. Este estudio evaluó en caninos la expresión génica de GDF-9 y BMP-15 en las células del cúmulo (CCs) obtenidas de complejos cúmulos ovocitos (COCs) a través del ciclo estral en relación a la maduración in vitro (IVM) de los ovocitos y la expansión de estas células. Las CCs se obtuvieron de COCs de folículos antrales de anestro, proestro, estro y diestro, previo y después de la IVM, expandidas y no expandidas. Para lograr mayor cantidad de CCs, antes y después de la IVM, estas se cultivaron in vitro por 48 h en medio Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) con suero fetal bovino. El desarrollo meiótico luego de la IVM se evaluó mediante microscopía de fluorescencia, clasificándolo en vesícula germinal (VG), reinicio meiótico (GVBD), primera metafase (MI) y segunda metafase (MII). La expresión relativa de GDF-9 y BMP-15 en las CCs se evaluó mediante q-PCR. Estos genes se encontraron en todas las etapas del ciclo antes y después de la IVM, con diferencias significativas entre estas en relación a la expansión y maduración de los ovocitos. De acuerdo a los estados del ciclo estral, en las CCs de COCs no madurados, los niveles de GDF-9 fueron mayores (P < 0,05) durante el estro, seguido por el diestro y los menores (P < 0,05) niveles en proestro y anestro. En BMP-15, los mayores (P < 0,05) niveles de mRNA se observaron en estro y diestro. En las CCs expandidas no hubo diferencias en GDF-9 entre las distintas etapas del ciclo, pero en BMP-15 los menores (P < 0,05) niveles de mRNA se observaron en estro. Luego de la maduración, hubo un incremento (P < 0,05) de los transcriptos de ambos genes en las CCs de anestro, proestro y diestro, excepto los niveles de mRNA de BMP-15 durante el diestro. En estro en cambio, hubo una disminución significativa de la expresión de los dos genes luego de la IVM. No se encontraron diferencias significativas en la capacidad de alcanzar el estado de MII al considerar la etapa del ciclo. Sin embargo, los COCs obtenidos de proestro y diestro que expandieron sus CCs pudieron reiniciar la meiosis en mayor (P < 0,05) porcentaje en comparación con las demás etapas del ciclo y los COCs de estro que expandieron sus CCs lograron mayores (P < 0,05) porcentajes de MII en relación a los que no expandieron el cúmulo. En conclusión, GDF-9 y BMP-15 se expresan en las CCs en todas las etapas del ciclo con un patrón diferente de acuerdo a cada una y estarían involucrados en la expansión del cúmulo de la perra, pudiendo estar relacionado con la maduración meiótica in vitro, al menos en aquellos ovocitos en etapa estral. / Differential growth factor 9 (GDF-9) and bone morphogenic protein 15 (BMP-15) regulate essential processes for oocyte maturation in different species, such as cumulus expansion. This study evaluated gene expression of GDF-9 and BMP-15 in canine cumulus cells (CCs) obtained from cumulus-oocyte complexes (COCs) through the estrous cycle in relation to oocyte in vitro maturation (IVM) and the expansion of CCs. The CCs were obtained from COCs of antral follicles from anestrus, proestrus, estrus, diestrus phases, before and after IVM, expanded and non-expanded. To achieve more CCs, before and after IVM, these were cultured in vitro for 48 h in Dulbecco's Medium Modified Eagle's Medium (DMEM) with fetal calf serum. The meiotic development after IVM was evaluated by fluorescence microscopy, classifying it in germinal vesicle (GV), germinal vesicle breakdown (GVBD), first metaphase (MI) and second metaphase (MII). The relative expression of GDF-9 and BMP-15 in the CCs was evaluated by q-PCR. These genes were found in all stages of the reproductive cycle, before and after IVM, with significant differences between them in relation to the expansion and oocytes maturation. According to the estrous cycle stages, CCs from non-matured COCs expressed higher (P < 0.05) levels of GDF-9 mRNA during estrus in comparison with the other phases and the lowest (P < 0.05) levels at proestrus and anestrus. The highest (P < 0.05) levels of BMP-15 transcripts were observed in estrus and diestrus. There were no differences in GDF-9 gene expression comparing expanded CCs among the different phases of the estrous cycle, regarding BMP- 15 transcripts, the lowest (P < 0.05) levels were registered in estrus. After IVM, the level of both genes increased (P < 0.05) in CCs of anestrus, proestrus and diestrus, except BMP-15 during diestrus. In contrast, in estrus GDF-9 transcripts significantly decreased after IVM. Non expanded CCs exhibited the lowest levels of both genes at anestrus and proestrus, whereas at diestrus the levels of GDF-9 in non-matured CCs were lower (P < 0.05) than that of the expanded cells, the levels of BMP-15 were similar. No differences were found in the oocyte ability to reach MII state when comparing the phases of the estrous cycle. However, COCs obtained from proestrus and diestrus that expanded their CCs showed higher (P < 0.05) percentage of meiosis resumption than to the other phases. At estrus expanded CCs achieved higher (P < 0.05) percentages of MII in comparison to those did not expand. In conclusion, GDF-9 and BMP-15 are expressed in the CCs over the estrous cycle with different patterns according each phase and these genes maybe involved in the cumulus expansion in canines, maybe related to the in vitro maturation, at least in oocytes at estrus phase / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1171670

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El avance de las biotecnologías reproductivas en caninos ha sido más lento que en otras especies animales. El estudio del proceso de capacitación espermática es un factor determinante para el desarrollo exitoso de estas técnicas, siendo aún poco estudiado en caninos. El objetivo del presente trabajo fue evaluar en caninos, el efecto del tiempo de capacitación espermática in vitro a través de la fecundación in vitro, evaluando la penetración espermática obtenida en ovocitos de perra previamente madurados en el laboratorio. De ovarios de perras sanas sometidas a ovariohisterectomía se obtuvieron los ovocitos por corte fino a través de réplicas experimentales, los que se seleccionaron de acuerdo: mayor tamaño, citoplasma oscuro y homogéneo y con más de 3 capas compactas de células del cúmulo. Los ovocitos seleccionados se incubaron para maduración en medio TCM 199 suplementado, a 38,5°C, 5 % CO2 y 98% de humedad, durante 72 y 96 horas. Se obtuvieron 6 eyaculados de 3 perros adultos utilizando la segunda fracción espermática de cada eyaculado, los que fueron centrifugados y el pellet resuspendido en medio de capacitación canino (CCM), dejándolos en incubación a temperatura ambiente (20° - 22°C) durante 1, 2 y 3 horas en forma separada para capacitarlos. Al término de cada período de capacitación se extrajo el CCM mediante centrifugación y los espermatozoides se resuspendieron en medio Fert-Talp, con el cual se prepararon gotas de 100 μL (10 x 106 espermatozoides/mL) para ser coincubados con los ovocitos (10 – 15 ovocitos por gota) previamente madurados in vitro por los diferentes tiempos en forma separada. La coincubación gamética se realizó en la estufa de cultivo por 3 horas a 38,5°C y 5% de CO2 en 98% de humedad. 7 Luego de la coincubación los ovocitos inseminados se lavaron y se fijaron en ácido acético, metanol y cloroformo 3:6:2, respectivamente, por tres minutos y luego en ácido acético y metanol 1:3 por 72 horas a 4 °C. Finalmente, los ovocitos se tiñeron con ioduro de propidio (1μg/mL) y fueron evaluados mediante microscopia de epifluorecencia. Se evaluó un total de 425 ovocitos, determinando el porcentaje de ovocitos penetrados por espermatozoides a nivel de la zona pelúcida (ZP), espacio perivitelino (EP) o en el citoplasma ovular (C). Los resultados se evaluaron por ANDEVA y la prueba de Tukey para determinar la significancia de las diferencias P ≤ 0,05. Se logró penetración con espermatozoides incubados en los tres tiempos de capacitación empleados, sin encontrar diferencias significativas (P>0,05) respecto a los tiempos de capacitación espermática empleados. Hubo mayores porcentajes de penetración (P<0,05) en los ovocitos madurados durante 72 horas (promedio 60,6%) que en aquéllos madurados durante 96 horas (promedio 45,1%). Se obtuvieron porcentajes de penetración similares al comparar los diferentes niveles evaluados (ZP, EP y C) entre ambos tiempos de maduración ovocitaria, con los 3 tiempos de capacitación empleados. Tanto en ovocitos de 72 horas, como de 96 horas de maduración, se encontró mayor porcentaje de penetración a nivel de C (P > 0,05), promedio 55,0% y 50,0% respectivamente, en comparación con los otros niveles de penetración evaluados. Estos porcentajes son superiores a los obtenidos en otros estudios en los cuales se ha medido la penetración al citoplasma ovular. Se puede concluir que los espermatozoides caninos pueden ser capacitados por períodos de 1 a 3 horas, logrando porcentajes de penetración importantes en ovocitos de perras, en orden de obtener fecundación in vitro exitosa en esta especie. / Proyecto FONDECYT No.1060602

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En este trabajo se estudió el efecto del tiempo de capacitación en la actividad enzimática de acrosina en espermatozoides refrigerados de perro a través de dos métodos de evaluación: digestión de gelatina en placa y la hidrólisis de ester de bajo peso molecular (BAEE) a través de espectrofotometría. La obtención de semen se realizó a 4 perros adultos sanos, mediante estimulación digital del pene, utilizando sólo la fracción espermática de cada eyaculado. El volumen, la motilidad y la concentración espermática se evaluaron de acuerdo a las técnicas estandarizadas en el laboratorio. El trabajo se realizó con semen fresco (control) y semen refrigerado proveniente de los mismos machos. Las muestras obtenidas fueron incubadas a temperatura ambiente con medio Fert Talp durante diferentes tiempos de capacitación (0, 1, 2 y 3 horas), para inducir la capacitación. Luego de cada tiempo de capacitación se evaluó la actividad enzimática de acrosina mediante ambas técnicas señaladas. En la digestión de gelatina se midió el tamaño de los halos obtenidos a través de un microscopio de contraste de fase, obteniendo un promedio de los tamaños de cada tiempo. Mediante la hidrólisis de ester de bajo peso molecular (BAEE), se midió la actividad de acrosina a través de la absorbancia de las muestras en el espectrofotómetro. Se realizaron 4 replicas experimentales y los resultados obtenidos se evaluaron mediante análisis de varianza ANOVA y LSD Fisher a posteriori. Se observó que la actividad enzimática de acrosina de los espermatozoides refrigerados, medida a través del tamaño de los halos de digestión de gelatina, no mostró variaciones estadísticas durante los diferentes tiempos de incubación (p > 0,05). Mientras que los espermatozoides frescos mostraron un aumento significativo de su actividad durante el tiempo 1 (p < 0,05). Al medir la actividad enzimática de acrosina a través de la hidrólisis de ester de bajo peso molecular (BAEE), no se observó en los espermatozoides refrigerados diferencias entre los tiempos de incubación (p > 0,05). Sin embargo, los espermatozoides frescos mostraron un aumento significativo de su actividad a la primera hora de incubación (p < 0,05). Al comparar la actividad enzimática de la acrosina de los espermatozoides refrigerados y frescos, no se observaron diferencias (p > 0,05) en los diferentes tiempos de incubación, tanto en su actividad proteolítica de gelatina como en espectrofotometría con BAEE. Esto podría indicar que el daño o alteraciones sufridas por los espermatozoides refrigerados, durante el proceso de criopreservación, no produciría un cambio significativo en la actividad de acrosina / Financiamiento: Proyectos Fondecyt 1060602 y 1080618

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El objetivo del presente estudio fue evaluar la distribución de los gránulos corticales (GC)en el citoplasma ovular, y su relación con el desarrollo meiótico en ovocitos caninos durante la maduración in vitro (MIV) a las 48, 72 y 96h, comparados con aquellos ovocitos no sometidos a cultivo (no madurados) y ovocitos madurados in vivo (ovulados). La distribución de los GC durante la MIV e in vivo fue evaluada a través de la tinción con la lectina lens culinaris conjugada con FITC mediante microscopia de epifluorescencia, en tanto, la configuración cromatínica se evaluó paralelamente mediante la tinción con DAPI y microscopia de epifluorescencia. A través del tiempo de incubación se pudieron establecer tres patrones de distribución de los GC que indicarían el movimiento de estas estructuras durante el proceso de maduración del ovocito. El patrón A, Homogéneo liso; en el cual la marca fluorescente se presentó fina y homogénea en todo el citoplasma ovular, Patrón B, Homogéneo granuloso; pequeñas agrupaciones o conglomerados de aspecto granular (“Clusters”) distribuidos uniformemente por todo el citoplasma, Patrón C, Granuloso cortical; de aspecto granular, en la cual los gránulos se ubicaron inmediatamente por debajo de la membrana plasmática del ovocito en todo su perímetro. El patrón A, se observó sólo en ovocitos en vesícula germinativa (VG) (19%), y fue encontrado sólo en ovocitos no madurados, no obstante la mayoría (p<0,05) de los ovocitos en VG presentó el patrón B, observándose mayoritariamente (p<0,05) en ovocitos no madurados (94%), también en ovocitos madurados en cultivo por 48h (4%), disminuyendo (P<0.05) al aumentar el tiempo de cultivo hasta las 96h. El patrón C se observó sólo en aquellos ovocitos sometidos a MIV aumentando significativamente con el tiempo de cultivo, además de observarse en todos (100%)los ovocitos ovulados. A medida que el tiempo transcurrió, la maduración meiótica progresó sólo con el tiempo de cultivo a una tasa menor que la alcanzada por los GC durante la MIV, a pesar de observar que ovocitos con una distribución cortical o periférica de los gránulos (patrón C), aumentaron en estados nucleares de metafase I (MI) y metafase II (MII) con el tiempo de cultivo. Además considerando que el desarrollo meiótico sólo alcanzó un 27 % de MII a las 96 h en comparación al 90% de ovocitos ovulados en MII, es posible establecer que sólo la distribución de los GC progresaría paralelamente al tiempo de cultivo indicando con esto que la maduración citoplasmática evaluada a través de la migración de estas vesículas no ocurre coordinadamente con la maduración nuclear

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. / La hembra canina presenta un ciclo estral con ciertas características únicas si se compara con el de otras especies mamíferas. A lo largo del ciclo estral en la perra, se describe la secreción de hormona luteinizante (LH), la cual cumple variadas funciones en el ámbito reproductivo. Esta gonadotrofina ejerce su efecto a través de su receptor, LHR, el cual corresponde a una glicoproteína de transmembrana perteneciente a la superfamilia de receptores asociados a proteína G (GPCR) y que ha sido localizado en diversos tipos celulares, incluyendo el folículo ovárico; sin embargo, la dinámica de expresión de los receptores para LH durante el ciclo reproductivo no se había descrito en la perra. El objetivo de este trabajo fue estudiar a través de q-PCR la expresión génica (mRNA-LHR) de este receptor como también, mediante western blot, la proteína (LHR) en los folículos ováricos de perras a través del desarrollo folicular en las distintas etapas del ciclo estral mediante lupa estereoscópica, se aislaron en forma mecánica células de la teca y de la granulosa tanto de folículos preantrales como antrales provenientes de ovarios de perras en anestro, proestro/estro y diestro. Los resultados, analizados mediante ANOVA y correlación de Pearson, mostraron que 1os niveles de mRNA-LHR aumentaron a medida que el desarrollo folicular avanzó de anestro a proestro/estro y disminuyendo al pasar a diestro. En el caso de la proteína LHR se identificó una forma de 90 kDa como una de 67 kDa, sin una diferencia significativa entre el volumen de ambas en anestro, pero si presentes en algunos tamaños foliculares de proestro/estro y diestro. El análisis correlativo entre la expresión génica y la proteína presentaron valores positivos muy cercanos a 1 para la forma inmadura del receptor, mientras que, para la forma madura, si bien fueron igualmente positivos, estuvieron más alejados del valor mencionado. Tanto el mRNA del LHR como ambas formas proteicas fueron detectadas desde los folículos preantrales y a lo largo de todo el ciclo folicular. Las proteínas de LHR encontradas corresponderían a la forma madura e inmadura del receptor, siendo esta última la más abundante / The estrous cycle in canines has especial features compared to other mammal species. However, some of the aspects that affect follicular development are still unknown. The secretion of the Luteinizing Hormone (LH) has been described in dogs throughout the entire estrous cycle, playing an important role in reproduction processes. This gonadotrophin exerts its effects through its receptor, LHR, which corresponds to a transmembrane glycoprotein belonging to the G protein couple receptor (GPCR) superfamily that has been localized in many cellular types, including ovarian follicles. However, the expression dynamics of the LH receptors during the reproductive cycle had not been described in the bitch. The objective of this study was to know the gene expression (mRNA-LHR) and also the presence of its encoded protein LHR in the ovarian follicles throughout follicular development over the estrous cycle. Theca and granulosa cells from antral and preantral follicles of ovaries from adult bitches in anestrus, proestrous/estrous and diestrus where isolated mechanically under the stereoscope and evaluated by using q-PCR and western blot analyses. The results were analyzed through ANOVA and Pearson Correlation, using a significance of P < 0.05. Both mRNA LHR and LHR proteins were detected from preantral follicles over the reproductive cycle. During anestrous and proestrous/estrous the levels of the mRNA-LHR increased (P<0,05) but during diestrous the messenger levels decreased (P < 0,05). A 90 kDa and a67 kDa forms of the LHR protein were identified by western blot analyses, these would correspond to the mature and immature form of the receptor respectively. The immature form was the most abundant in all follicle types. The correlation between the gene expression and the presence of the protein was positive (P<0,05) for both mature and immature forms

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Una fecundación exitosa depende, entre otras cosas, de la capacidad que tengan los espermatozoides de experimentar la reacción acrosómica. Este fenómeno es esencial para una adecuada interacción gamética y posterior fecundación del ovocito. El espermatozoide de perro al ser sometido a criopreservación puede verse afectado alterando negativamente este proceso y por tanto, su capacidad fecundante. En este trabajo se estudió el efecto del tiempo de capacitación en espermatozoides congelados de perro a través de la actividad enzimática de la acrosina, mediante dos métodos de evaluación: hidrólisis de gelatina en placa y por espectrofotometría, la hidrólisis de esteres de bajo peso molecular (BAEE). La obtención de semen se realizó a partir 5 machos adultos sanos, mediante estimulación manual del pene. Se utilizó la segunda fracción espermática de cada eyaculado, midiendo su volumen en copa recolectora y la motilidad espermática se evaluó en forma subjetiva al microscopio de contraste de fases. La concentración espermática se determinó mediante recuento en la cámara de Neubauer, de acuerdo a las técnicas estandarizadas en el laboratorio. Se trabajó con semen fresco (control) y semen congelado proveniente de los mismos machos. El pellet obtenido de cada muestra se ajustó a una concentración de 200x106 de esp/ml, incubándolas por períodos de 0, 30, 60 y 90 minutos a temperatura ambiente (21°C) para inducir la capacitación de los espermatozoides. Luego de cada tiempo de capacitación se realizó la medición de la actividad enzimática de acrosina a través de hidrólisis de gelatina en placa y espectrofotometría de esteres de bajo peso molecular (BAEE). 7 Los resultados obtenidos en relación a la actividad enzimática de acrosina durante la capacitación espermática en perros se describieron en términos de promedios, y se evaluaron mediante análisis de varianza ANOVA y LSD Fisher a posteriori. Se realizaron 5 replicas experimentales y se usó 1 eyaculado por perro en promedio. En relación al tipo de población espermática, los espermatozoides congelados y frescos (control) presentaron diferencias (P < 0,05) en relación al tamaño de los halos de digestión, observándose un diámetro promedio de halo mayor en espermatozoides frescos en comparación a los congelados de acuerdo a los tiempos de capacitación. Al evaluar la actividad enzimática de acrosina a través de la hidrólisis de BAEE, se observó que durante los diferentes tiempos de capacitación en los espermatozoides frescos, la actividad enzimática de acrosina presentó variaciones (P<0,05) con mayor actividad enzimática en los espermatozoides a partir de los 60 min, mientras que en espermatozoides congelados la mayor actividad se observó al tiempo 0 de capacitación (no capacitados) (P <0,05). La actividad enzimática de acrosina en espermatozoides congelados sería menor que en los espermatozoides frescos, tanto en su actividad proteolítica en gelatina, como en espectrofotometría con BAEE. Además, la actividad de proacrosina/acrosina en espermatozoides caninos frescos se vería aumentada a través del tiempo de capacitación a diferencia de los espermatozoides congelados donde no se observó diferencias entre los diferentes tiempos de incubación en medio capacitante, por lo que se sugeriría que los espermatozoides frescos podrían retener mayores cantidades de acrosina que aquellos congelados/descongelados, lo que se traduciría en una acción más gradual en el tiempo observándose la mayor liberación de enzima entre los tiempos 60 y 90 minutos. / Proyecto Fondecyt 1060602-1080618